Summary
Aqui descrevemos um protocolo para realizar a cateterização da cisterna magna (CMc), uma forma minimamente invasiva para entregar traçadores, substratos e moléculas sinalizadoras no fluido cerebrospinal (CSF). Combinado com diferentes modalidades de imagem, CMc permite sistema de glymphatic e avaliação de dinâmica do CSF, bem como a entrega de todo o cérebro de vários compostos.
Abstract
Canulação de cisterna magna (CMc) é um procedimento simples que permite acesso direto para o líquido cefalorraquidiano (CSF) sem danos operativo para o crânio ou o parênquima cerebral. Em roedores anestesiados, a exposição da dura-máter por dissecção romba dos músculos do pescoço permite a inserção de uma cânula para a cisterna magna (CM). A cânula, composta por uma agulha fina chanfrada ou borosilicato capilar, está ligada através de um tubo de polietileno (PE) com uma seringa. Usando uma bomba de seringa, moléculas podem então ser injetadas em taxas controladas diretamente o CM, que é contínua com o espaço subaracnoideo. Partir do espaço subaracnoideo, poderemos rastrear fluxos CSF pelo fluxo convectivo no espaço perivascular em torno de arteríolas penetrantes, onde ocorre a troca de soluto com o fluido intersticial (ISF). CMc pode ser realizada por injeções agudas, imediatamente após a cirurgia, ou para implantação de crônica, com posterior injeção em anestesiados ou acordado, movimentando-se livremente roedores. Quantificação da distribuição do traçador no parênquima cerebral pode ser executada por epifluorescência, 2-fotão microscopia e ressonância magnética (MRI), dependendo das propriedades físico-químicas das moléculas injetadas. Assim, o CMc em conjunto com várias técnicas de imagem oferece uma poderosa ferramenta para avaliação do sistema de glymphatic e dinâmica do CSF e função. Além disso, a CMc pode ser utilizada como um canal para entrega rápida, todo o cérebro de sinalização moléculas e substratos metabólicos que caso contrário não atravessar a barreira hemato-encefálica (BBB).
Introduction
Líquido cefalorraquidiano (CSF) banha o sistema nervoso central (SNC) em todo o sistema ventricular e ao longo dos espaços subaracnoide, um espaço anatomicamente definido no continuum com os ventrículos, que envolve o cérebro e a medula espinhal. Uma das principais funções do QCA é fornecer uma rota para apuramento dos metabolitos e solutos do parênquima cerebral. Acesso é facilitado através da glymphatic recentemente descoberto sistema1, o cérebro analógico para o sistema linfático periférico. Neste documento, podemos descrever e discutir a canulação cisterna magna (CMc), um método minimamente invasivo para a entrega direta de moléculas para o CSF. CMc é o método principal para estudar a função glymphatic. Além disso, CMc também pode ser aplicado para o estudo da dinâmica do CSF e para uma entrega rápida, todo o cérebro de moléculas permeável do cérebro não-sangue barreira (BBB) para o parênquima cerebral, ao longo do espaço perivascular.
O CMc explora princípios fisiológicos da dinâmica de movimento CSF através do CNS para entregar o palpador rotulado moléculas ou drogas para o espaço cheio de CSF da cisterna magna (CM). Moléculas são injetadas através de uma cânula implantada para a cobertura de dura-máter membrana atlanto-occipital, que as moléculas CM. em seguida são transportadas por fluxo de massa CSF para o parênquima cerebral através do paravascular espaço1. Agente de marcador ou contraste injetado através do CMc segue o movimento do CSF, que permite a avaliação da circulação do CSF e influxo de glymphatic através da quantificação de níveis de intensidade de moléculas rotulados que insira o parênquima cerebral. CMc é compatível com diferentes técnicas de imagem, incluindo epifluorescência, 2-fotão microscopia e ressonância magnética (MRI). Além disso, esta avaliação pode ser realizada tanto em vivo ou ex vivo. Importante, CMc permite a visualização do sistema de glymphatic sob anestesia ou durante o sono natural, assim como em animais acordados, andando livremente.
A técnica de CMc pode ser utilizada para estudar os diferentes aspectos da dinâmica dos fluidos no CSF, mas provou para ser particularmente útil para estudar o sistema de glymphatic. Glymphatic atividade impulsiona o fluxo convectivo de LÍQUOR do espaço periarterial através de canais de água aquaporina-4 (AQP-4), que são amarrados na membrana dos hamartomas vasculares quebra automática de endfeet. O fluxo convectivo permite o intercâmbio de CSF e fluido intersticial (ISF) dentro do parênquima cerebral. CSF/ISF contendo solutos e resíduos metabólicos é então removido o parênquima cerebral através do espaço de perivenous2,3. Finalmente, a CSF/ISF alcança a periferia através de vasos linfáticos dural recentemente descrito4,5. O sistema glymphatic foi mostrado crucial para a habilitação de metabolitos resíduos prejudiciais tais como β-amiloide2. Além disso, glymphatic afastamento é prejudicado no envelhecimento6, depois de lesão cerebral traumática7e em modelos animais de diabetes8 e a doença de Alzheimer9. Nomeadamente, glymphatic atividade é estado dependente, mostrando atividade significativamente maior durante o sono ou anestesia em comparação com a vigília1. De fato, animais anestesiados jovens apresentam a mais alta atividade de glymphatic. Assim, a quantificação experimental da atividade glymphatic é crítica quando estudando o seu papel na saúde e na doença.
Vários estudos têm abordado CSF dinâmica e seu intercâmbio com o líquido intersticial (ISF) no parênquima cerebral. No entanto, os métodos pelos quais moléculas etiquetadas são entregues são bastante invasivos, provocando dano do parênquima cerebral e alterações na pressão intracraniana (ICP) (ver revisão10). Alguns exemplos são intraventricular ou injeções difuso que envolvem craniotomia ou perfuração de uma rebarba do furo no crânio. Esses procedimentos foram mostrados para alterar o ICP, rompendo assim a glymphatic função2. Além disso, tais métodos invasivos induzem astrogliosis e aumentam imunorreatividade AQP-4 na área danificada de parênquima cerebral e seus arredores11,12. Como astrócitos e AQP-4 são elementos-chave do sistema de glymphatic, o CMc é o método de escolha para seus estudos. As principais vantagens do CMc em comparação com procedimentos invasivos mais são a manutenção de uma parênquima de crânio e cérebro intacta, evitando alterações de ICP e astrogliosis, respectivamente. Assim, o CMc em conjunto com diferentes ferramentas de imagem abre para uma ampla gama de possibilidades para estudar não só o sistema de glymphatic, mas também a dinâmica e os mecanismos de fluxo de fluido na homeostase, bem como em modelos animais de doenças neurológicas.
O procedimento de cateterização (CMc) cisterna magna permite acesso fácil e direto para o líquido cefalorraquidiano (CSF). Através da injeção de moléculas diferentes (por exemplo, marcadores fluorescentes, agentes de contraste MRI) o experimentador pode acompanhar o seu movimento no interior do compartimento do CSF e avaliar a atividade do sistema glymphatic. O protocolo seguinte descreve ambos o CMc aguda, para injeções imediatamente após a cirurgia e implantação crônica da cânula, em que o animal se recupera do procedimento cirúrgico para uma posterior injeção. A diferença mais importante entre a implantação aguda e crônica é que a implantação crônica permite o estudo da atividade glymphatic em ratos acordados.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Directiva 2010/63/UE Europeu para pesquisas com animais e foram aprovados pelo Conselho de experimentos animais sob o Ministério do ambiente e comida (2015-15-0201-00535).
1. procedimento para canulação
- Preparação de cânula
Nota: Evite tocar a cânula com luvas não estéreis.- Quebre a ponta de metal chanfrada com uma agulha de 30g dental usando um porta-agulha.
- Usando um porta-agulha, preparar a cânula introduzindo a ponta de metal chanfrada (aproximadamente 0,3 cm) em um comprimento de 30 cm de PE10 tubulação (tubulação de polietileno 0,024 OD x 0,011" ID") preenchida com aCSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 , 2 mM de MgSO4, 2mm CaCl2, glicose de 10mm, 26mm NaHCO3; pH 7,4 quando intoxicado com 95% O2 e 5% CO2).
- Lave a cânula com aCSF utilizando uma seringa de 1 mL, munida de uma agulha 30G (30 x ½" 0.3 x 12).
-
Procedimento cirúrgico
Nota: A crônica canulação CM permite que os animais para se recuperar do procedimento cirúrgico. CM injeções são feitas no dia pós-implante de cânula e, importante, podem ser realizadas em animais anestesiados ou acordados. Pois esta é uma cirurgia de recuperação, procedimentos devem ser realizados sob condições estéreis.- Pesar o mouse (C57BL/6JRj, ambos os sexos, 8 semanas) e anestesia-lo com uma mistura de ketamina e xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) através da injeção intraperitoneal (i.p.). Se necessário, redose o mouse com uma meia dose de cetamina (50mg/kg) durante o procedimento cirúrgico. Como alternativa, para canulação crônica, anestesiamos rato, colocando-o em uma câmara de indução de isoflurano em 2.5-3% de isoflurano, em cerca de 1 L/min O2. Nesse caso, use um cone de nariz para sustentar a anestesia de isoflurano em 1,5 a 2% durante a cirurgia.
- Quando pitada de dedo do pé reflexos cessar, e a respiração torna-se lento e firme, coloque o animal em uma armação estereotáxica sobre uma almofada de aquecimento.
- Aplica a pomada oftálmica. Repita durante a cirurgia, sempre que necessário.
- Raspar a cabeça e o pescoço do mouse, retire a pele e esterilizar a pele exposta primeiro com um algodão embebido em álcool e em seguida duas vezes com clorexidina (0,5%) ou solução de iodo (2%). Repita a esterilização mais duas vezes.
Nota: Mude o caimento cirúrgico para remover detritos e cabelo após fazer a barba. Então cubra o animal para proteger o campo estéril. - Para a canulação crônica, administrar 0,5 - 1 ml de lidocaína/bupivacaína (1 mg/ml a 0,25 mg/ml, respectivamente) por via subcutânea (s.c.) no local da incisão. Administre a buprenorfina (0,05 mg/kg; s.c.) para analgesia pós-operatória.
- Corrigi o mouse no quadro estereotáxica. Depois de garantir a fixação, ou intraural, ou pelo arco zigomático, incline a cabeça ligeiramente para que forma um ângulo de 120° com o corpo (Figura 1E).
- Encontre a parte do crânio salientes imediatamente acima dos músculos do pescoço - a crista occipital. Levante a pele sobrejacente usando um par de pinças e cortar um pedaço em forma de amêndoa de pele de aproximadamente 1 cm ao longo da linha mediana. Use cotonetes ou lanças para controlar qualquer sangramento resultante do olho.
- Usando a crista occipital como ponto de referência, separe o tecido conjuntivo superficial para expor os músculos do pescoço abaixo.
- Separe os músculos na linha executando cuidadosamente a pinça no meio do local da incisão no eixo para-ânteroposterior. Com um par de pinças curvas em cada mão, junte-se as pontas no meio na parte inferior do crânio e puxar os músculos de lado.
Nota: Isto deve expor o CM, que aparece como um pequeno triângulo invertido, delineado pelo cerebelo acima e medula abaixo, por trás da membrana dural translúcida (figura 1B e 1C). - Utilizando um cotonete de algodão ou lança olho cirúrgico, limpe a membrana dural cobrindo o CM.
-
Inserção da cânula para o CM
- Remova a seringa cheia de aCSF, mantendo a agulha 30G anexada a extremidade posterior da tubulação da cânula.
- Coloque a agulha 30G uma destilada cheio de água 100 µ l seringa conectada a uma bomba de seringa.
- Inserir uma bolha de ar de aproximadamente 1 cm dentro da cânula, retirando o ar com o auxílio de uma bomba de seringa.
- Usando uma bomba de seringa, retire 12 μL do tracer de CSF desejada dentro da cânula.
- Segure a cânula, preenchida com o localizador do CSF, perto da agulha tubo coberto com um par de pinças curvas a mão dominante. Apoie o dedo médio da mão não dominante na barra de orelha do lado oposto e segure firme para o uso posterior como um descanso para a cânula.
- Inserir a cânula em um ângulo de 45° em relação a cabeça de rato, passando para o centro do CM, identificado por seu aspecto triangular visto através da dura-máter. Evite qualquer penetração do cerebelo ou da medula. Certifique-se de que a agulha é inserida apenas a uma profundidade de 1-2 mm, ou seja, até o ponto onde o bisel é inteiramente sob a dura-máter. Liberar a pinça segurando a cânula e deixe a cânula descansar na mão não dominante.
Nota: A extremidade chanfrada das agulhas dentais exigirá a aplicação de uma força para perfurar a membrana dural cobrindo o CM. - Se necessário, seca qualquer liquórica sobre a penetração usando cotonetes de algodão ou lança um olho cirúrgico.
- Solte os 2-3 gotas de cola de cianoacrilato para a membrana dural em torno da cânula. Adicione uma gota de accelerator cola para curar a cola imediatamente. Cobrir o crânio e a agulha com uma mistura de cimento dental (aproximadamente 0,5 mg) e cola de cianoacrilato (3-5 gotas). Imediatamente depois, aplica uma gota de accelerator cola para curar.
- Para canulação crônica, cortar o tubo (deixando cerca de 2-3 cm ligado à cânula) e selá-lo com uma solda cirúrgica para manter os níveis de pressão intracraniana (ICP), impedindo o vazamento de LCR através da tubulação.
- Para canulação crônica, administrar carprofeno (5 mg/kg; s.c.)
- Para canulação crônica, posicione o mouse em uma gaiola, mantendo-o sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo até que o animal está totalmente recuperado da anestesia.
Nota: Deve ser individualmente alojados em gaiolas para assegurar que a cânula permanece intacta. Certifique-se de que o nariz é claro de roupa de cama, colocando o mouse sobre uma toalha de papel ou outro substrato sólido.
Nota: No dia seguinte, quando os animais são recuperados do procedimento cirúrgico realizado para a inserção da cânula, podem ser injetados com traçadores CSF. Para injeção sob anestesia, administrar uma mistura de xilazina/cetamina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente; i.p.) e proceder a etapas descritas na seção 2. Para injeção em animais acordados, prossiga para a seção 3.
2. injeção de CSF traçadores através da cânula de CM implantado aguda em animais anestesiados
Nota: Para a injeção dos marcadores do CSF através da cânula de CM implantado aguda em animais anestesiados, imediatamente após a etapa 8 da seção anterior, proceda a injeção do traçador CSF conforme descrito abaixo.
- Usando uma bomba de seringa, inicie a injeção para os marcadores de CM do CSF à taxa de 1 µ l/min. para 5 ou 10 min, resultando em um volume total de 5 µ l ou 10 µ l, respectivamente. No final da injeção, permitir que o tracer CSF a circular em todo o cérebro por 30 min com a cânula sem ser perturbado.
- Depois de 30 min, cortar o tubo conectado à cânula (aproximadamente 4 cm de distância da ponta de agulha) e selar sua extremidade usando uma solda cirúrgica.
- Sob anestesia profunda, abater o animal por decapitação. Rapidamente dissecar o cérebro e reparar o tecido por imersão em paraformaldeído 4% (PFA) diluído em solução salina tamponada fosfato (PBS; 0.01M; pH 7,4) durante a noite (o/n), a 4 ° C.
3. injeção de CSF traçadores através de cânula CM cronicamente implantado em animais acordado
- Usando uma bomba de seringa, retire 7 µ l ou 12 µ l do tracer de CSF desejado em uma cânula composta de aproximadamente 30 cm de tubo PE10 com uma ponta de agulha dental chanfrado de 0,5 cm.
- Delicadamente, conter o animal e o corte de aproximadamente 1 cm do tubo anexado para a cânula.
- Ainda sob restrição suave, rapidamente se conecte a cânula preenchida com tracer CSF para a cânula CM implantado.
- Usando uma bomba de seringa, iniciar a injeção para os marcadores de CM do CSF à taxa de 1 µ l de injetar 7 µ l/min. ou 12 µ l, para atingir um volume final de LCR injetado traçador de 5 µ l ou 10 µ l, compensando assim a aCSF restantes na cânula implantada. No final da injeção, permitir que o tracer CSF a circular em todo o cérebro por 30 min com a cânula sem ser perturbado. Garantir que o tubo permanece anexado durante períodos de injeção e circulação.
- No final do tempo de circulação do CSF palpador, proceda à eutanásia por decapitação, garantindo que o animal é anestesiado profundamente. Rapidamente dissecar o cérebro e reparar o tecido por imersão em paraformaldeído 4% (PFA) diluído em solução salina tamponada fosfato (PBS; 0.01M; pH 7,4) durante a noite (o/n), a 4 ° C.
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Representative Results
Mediante a fixação de ratos ou ratos em uma armação estereotáxica, os músculos do pescoço em torno da região de crista occipital sem rodeios são dissecados para expor a cisterna magna (CM). A estrutura triangular do CM é facilmente reconhecida entre a porção caudal do cerebelo e a medula (figura 1A-1 C). A cânula é inserida 1-2mm a CM perfurando delicadamente a membrana atlanto-occipital (Figura 1). A dura-máter membrana é uma estrutura resistente e a inserção da cânula é melhorada pela inclinação da cabeça do animal por um 120° em relação ao corpo. Com o auxílio de uma bomba de injeção, diferentemente rotuladas moléculas são então injetadas a cisterna magna a preços controlados (Figura 1E). Depois de um intervalo para permitir a circulação de marcador do CSF, animais são sacrificados. O cérebro é cuidadosamente dissecado e fixado por imersão em 4% o PFA/n a 4 ° C. Vista dorsal macroscópica dos cérebros de roedores CM-injetado colhidas mostra a distribuição dos marcadores do CSF nas cisternas subaracnoidea do cerebelo, no bulbo olfatório e no espaço paravascular ao longo da artéria cerebral média (MCAs) (Figura 1F ). Na porção ventral do cérebro, exibições de macroscópicas mostram a distribuição do traçador CSF ao longo do círculo de Willis (Figura 1). Cortes histológicos de CM-injetado cérebros mais revelaram a distribuição paravascular dos marcadores dentro do parênquima cerebral. Ratos injetados sob anestesia (Figura 1 H) (ou durante o sono natural, ver1) mostram um aumento notável na distribuição do traçador para o parênquima cerebral em comparação com ratos injetados enquanto acordado e andando livremente em sua gaiola em casa (Figura 1I).
Figura 1: injeção de traçadores para a cisterna magna. (A) visão geral esquemática da cabeça de rato e cérebro, mostrando a localização da cisterna magna (CM) em relação ao cérebro e estruturas cranianas. (B) fotomicrografia de CM exposto depois que os músculos do pescoço circundante foram dissecados e empurrados para os lados sem rodeios. (C) aumento da área descrita em B (retângulo preto), mostrando a estrutura triangular invertida o CM (linha tracejada) e sua localização em relação a circundante estruturas, ou seja, crista occipital, cerebelo e medula. (D) Fotomicrografia da cânula inserida no CM. (E) regime da vista lateral da cabeça do mouse fixo, ligeiramente inclinada em um ângulo de 120 ° em relação ao corpo. Baixo-relevo do retângulo tracejado delimitada por área mostra o esquema de um esquema de exibição parasagital parasagital vista do cérebro do rato com a cânula inserida a CM, conforme descrito em E. Uma seringa, que é acoplada a uma bomba de injeção, é usada para lançar o CSF marcadores ou agentes de contraste para o CM através de um tubo conectado a uma agulha fina de 30G. Imagens representativas de um cérebro de rato inteiro em 30 min após o término da injeção CM com um marcador fluorescente, visto a partir da dorsal (F) e ventral (G) aspectos. (H, I,) Seções do cérebro coronal representativo counterstained com DAPI (4' 6-diamidino-2-phenylindole; 1 µ g/mL de PBS) de ratos injetado com traçadores CSF o CM sob anestesiado (H) e vigília (I), 30 min após o término da injeção de CM, a uma taxa de 1 µ l/min de um 5 µ l volume de uma mistura de ovalbumina-AF647 conjugado (OA, 45kDa; 2% em aCSF) e conjugado FITC-dextrano (DEX, 3kDa; 2% em aCSF). Barras de escala, 5 mm para B, C, F, G; 2 mm para D e 500 µm por H, I. Cb, cerebelo; CM, cisterna magna; CTX, córtex; e OB, bulbo olfactory. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos um protocolo que descreve um procedimento detalhado para canulação de magna cisterna (CMc), que oferece um método simples para entregar rotulado de moléculas para o compartimento do CSF. CMc permite a visualização posterior da dinâmica do CSF, tanto in vivo e ex vivo, usando diferentes modalidades de imagem ou histologia.
Uma das principais vantagens da técnica da CMc reside no seu acesso direto para o espaço subaracnoide sem a necessidade de expor o cérebro por craniotomia. Por não exigir uma janela cranial ou penetração do parênquima cerebral com uma ponta de agulha, CMc permite a entrega de moléculas para o compartimento do CSF e a avaliação do sistema de glymphatic por um procedimento minimamente invasivo, com apenas breve perturbação do pressão intracraniana (ICP).
Notavelmente, a injeção para a CM é a jusante das principais fontes de LCR, a coroide plexi localizado no sistema ventricular (laterais, terceiros e quarto ventrículos). Partir dos ventrículos laterais, CSF fluxos para o terceiro ventrículo através do forame intraventricular (forame de Monro) e de terceira para quarta ventrículos através do aqueduto cerebral (aqueduto de Sylvius) para o tronco cerebral e medula espinhal (revisto em3 ). CSF atinge o espaço subaracnoide através da CM por flui através da abertura mediana (ou forame de Magendie), e assim, injeções de CMc ignorar todo o sistema ventricular. No entanto, enquanto isso pode ser problemático em alguns modelos de dinâmica de CSF/ISF através dos ventrículos, injeção direta dos marcadores para os ventrículos requer procedimentos cirúrgicos invasivos como perfuração de trepanação em windows o crânio e a aplicação de injeções ventriculares substancialmente perturbam o ICP13. Da mesma forma, a injeção de pressão dos marcadores para o espaço subaracnoideo13,14 em nossas mãos abole o fluxo dos marcadores do CSF ao longo do espaço paravascular. Em contraste, apesar de CMc implica punção da membrana dural, ICP está apenas transitoriamente perturbado e é rapidamente restaurado2.
Usando o CMc, glymphatic atividade pode ser medida em animais anestesiados depois CMc aguda, bem como em animais acordados, observando um período de 24 horas de recuperação após implantação de cânula. CMc aguda é adequado para combinação com 2-fóton de imagem, que fornece informações detalhadas sobre a atividade de glymphatic dentro do córtex, a uma profundidade de aproximadamente 200 µm1,2. Importante, CMc aguda também oferece a vantagem de apoiar estudos de MRI imparciais, onde a distribuição do traçador é seguida dinamicamente, relativo para uma imagem de linha de base individual adquirida antes do início do CSF traçador injeção15, 16 , 17. por ressonância magnética, a agulha dental usada para CMc deve ser substituída por um borossilicato capilar (aproximadamente 1 cm de comprimento, diâmetro de ponta de cerca de 20 µm) anexado para a tubagem de PE.
Em contraste com canulação aguda, crônica CMc permite que o experimentador realizar a injeção do traçador CSF em animais durante o sono natural ou sob anestesia, bem como em acordados, movimentando-se livremente os animais. Este é um fator crucial, desde que a atividade glymphatic é altamente dependente do estado; afluxo de marcador para o parênquima é muito maior nos animais que foram injetados sob anestesia ou dormindo do que nos animais que foram injetados no estado desperto1. Além disso, animais com uma cânula cronicamente implantado podem receber traçador CSF em sua gaiola em casa, minimizando fatores de confundimento devido aos efeitos do estresse e da excitação na atividade glymphatic. Para injeções crônicas sob anestesia, uma mistura de xilazina/cetamina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) é recomendado. Isoflurano em concentrações acima de 1,5% induz o inchaço do cérebro e não aumentar a atividade glymphatic em comparação com o estado desperto1. Observe que após a implantação do CMc, animais devem ser único abrigado, a fim de assegurar que animais CMc implantado não danificará a cânula do outro. Também, desde a implantação de crônica de CMc é um procedimento cirúrgico de recuperação, deve ser realizada em condições estéreis e os animais devem receber analgésicos das.
Importante, CMc pode ser usado como um método para entregar marcadores CSF em ratos, bem como em ratos, com modificações mínimas no protocolo. Deve ser administrada a dose adequada de anestésicos e o volume máximo do tracer CSF que é injetado em ratos é de 30 µ l, devido às diferenças no tamanho do espaço subaracnoideo e ventricular entre as duas espécies.
Apesar de sua simplicidade processual, algum treinamento e prática é necessária para o experimentador executar com êxito o CMc. Desde que o CM varia de tamanho entre as espécies e animais individuais, é aconselhável praticar o reconhecimento de sua estrutura. Praticar o procedimento usando azul de Evans (2% em aCSF) permite que o experimentador confirmar a inserção correta da agulha. Ocasionalmente, um navio será localizado diretamente na linha do CM, whereupon a agulha deve ser inserida ao lado do navio, mas tão perto como possível à sua mediana. Nestes casos devem notar, para posterior confirmação que marcadores são uniformemente distribuídos, apesar da colocação fora do centro da ponta da agulha. Importante, a membrana atlanto-occipital, cobrindo o CM é mecanicamente resistente, e uma pressão suficiente deve ser aplicada para inserir a ponta da agulha chanfrada. No entanto, é fundamental que a pressão aplicada não resulta em mergulhar a ponta da agulha, a medula ou o cerebelo. Para facilitar a inserção da agulha para o CM, a cabeça dos animais deve ser viradas para baixo em um ângulo de 120° em relação ao corpo, que se estende da membrana. Importante, devem ser tomadas precauções para não obstruir a respiração por essa cabeça flexão. Se a ponta da agulha deve entrar no cerebelo, traçadores serão retidas no tecido e deixam de distribuir em todo o espaço subaracnoideo. Danos à medula são frequentemente fatal, enquanto que o cerebelo danos em cânulas crônicas podem resultar em prostração e gerais anomalias no comportamento dos animais. Para minimizar o risco desta eventualidade, agulhas com um menor comprimento de bisel pode ser usado.
Ao mover os músculos da região do pescoço que cobre a membrana dura-máter para inserir a cânula para a CM, sangramento pode ocorrer. Cotonetes de algodão podem ser usados para absorver o sangramento, mas como alternativa, a solução de cloreto férrico pode ser aplicada. Cloreto férrico tem um efeito hemostático18e também provoca o endurecimento dos músculos do pescoço em torno do local da incisão, contribuindo assim para obter a correta inserção da agulha para a CM. férrico cloreto também resseca o crânio e a membrana dural, apresentando melhores superfícies para adesão da cânula. Para CMc, aplique 1 a 2 gotas de solução de cloreto férrico (10%) (cerca de 1 mL) em um algodão cotonete e pincele os músculos do pescoço e a crista occipital. No entanto, tópico cloreto férrico pode possivelmente infiltrar-se através da membrana do CSF, com efeitos desconhecidos na homeostase do cérebro. Se a utilização de cloreto férrico é motivo de preocupação, um pode usar ferida retractores para manter aberto o local da incisão. Remoção cuidadosa de afastadores de ferida depois de aplicar a cola de cianoacrilato evita inadvertido apego ao local da incisão.
CMc é um procedimento simples e reprodutível para entregar as moléculas diretamente no compartimento da CSF. Desde que o CMc é minimamente invasivo, é o método preferido para a visualização do sistema de glymphatic e pode ser combinado com diferentes modalidades de imagem como epifluorescência e 2-fotão microscopia ou ressonância magnética. CMc, representa uma grande ferramenta para estudos de dinâmica de fluidos, ou seja, CSF e ISF e também de afastamento fluido cérebro. Devido à cobertura macroscópica do sistema glymphatic, a CMc tem potencial para ser usado para entregar todo o cérebro moléculas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Novo Nordisk Foundation e Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. e Samões-R são beneficiários de uma bolsa de pós-doutorado e uma bolsa de doutoramento da Fundação Lundbeck, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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