Summary
Wir präsentieren eine tibiale Ablenkung Osteogenesis Mausmodell mit einem maßgeschneiderten Distraktor entwickelt. Die Verwendung einer Maus als ein Analyseziel ist vorteilhaft für die Förderung der Forschung.
Abstract
Ablenkung Osteogenesis (DO) ist ein chirurgisches Verfahren, das Skelett Geweberegeneration ohne Stammzelltransplantation beinhaltet. Eine-Modell besteht aus den folgenden drei Phasen: die Phase der Latenz nach Osteotomie und Vermittlung von externen Distraktor; die Ablenkung-Phase, wobei die getrennten Knochenenden allmählich und kontinuierlich abgelenkt werden; und die Konsolidierungsphase. Dieses maßgeschneiderte Distraktor verwendet für DO besteht aus zwei unvollständige Acrylharz Ringen und einer Erweiterung-Schraube. Der Prozess wurde von einer Form mit Silikon Abformmasse und dann erstellen maßgeschneiderte Distraktor initiiert. Dental, Harz wurde in die Schalung gemacht der Abformmasse Silikon gegossen, und es durfte polymerisieren um die unvollständige Harz Ringe für die maßgeschneiderte Distraktor erforderlich zu erstellen. Diese Ringe wurden mit einer Erweiterung-Schraube mit transparentem Harz befestigt. Der maßgeschneiderte Distraktor erstellt über diesen Ansatz hing an der Tibia von Mäusen. Die Tibia war an der Vorrichtung mit einem Paar von 25 G Nadeln proximal, ein paar 27 G Nadeln nach distal, befestigt und Acrylharz. Nach einer Latenzzeit von 5 Tagen leitete Ablenkung mit einer Rate von 0,2 mm/12 h. Für 8 Tage, wodurch insgesamt 3,2 mm Abstand der Verlängerung setzte. Die Mäuse wurden 4 Wochen nach Ablenkung geopfert. Knochenbildung in der Ablenkung Lücke war mit Röntgen und Histologie bestätigt.
Introduction
Ablenkung Osteogenesis (DO) ist eine etablierte Behandlungsmethode für eine Vielzahl von Skeletterkrankungen wie Gliedmaßen Länge Abweichungen, Knochendefekte und Gliedmaßen Missbildungen1. Diese einzigartige Behandlungsstrategie basiert auf der "Spannung Prinzip" von Ilizarov vorgeschlagen. Diese Methode erfordert mehrere Tage für Latenz, mehrere Wochen für aktive Ablenkung und mehrere Monate für die Konsolidierung, bis der Reifen Knochen gebildeten2ist.
Die hypoxischen Gegebenheiten durch Blockade der Blut fließen3,4 und mechanische Stimulation5,6 sind besonders wichtig bei der Heilung zu tun. Hypoxie-induzierte Angiogenese trägt Sauerstoff, Nährstoffen, lösliche Faktoren und Zellen für die Reparatur von Gewebe lokal über die Blutbahn notwendig. Mechanische Stimulation durch Erweiterung Betrieb führt biologische Reaktionen wie Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen, Knochenbildung, Verkalkung und Umbau. Serielle Behandlung ermöglicht die Bildung von nicht nur harte Gewebe, sondern auch Weichteile, wie Nerven, Muskeln, Blutgefäße und Hautgewebe, ohne die Notwendigkeit für Stammzelltransplantationen. Daher gilt eine-Modell als ein hervorragendes Modell für die Regeneration von verschiedenen Geweben zu analysieren.
Kaninchen und Hunde sind die am häufigsten verwendeten Tiere in der Grundlagenforschung für DO; Allerdings gibt es einige Analysetools für diese Tiere. Die Verwendung von einem Mausmodell ermöglicht eine genauere Analyse. Es eignet sich besonders für Experimente mit Knockout-Mäusen. Allerdings sollte bei der Verwendung einer Maus als ein Versuchstier eine Extensionsgerät erstellt werden. Hier entwickelt präsentieren wir Ihnen eine Maus Tibia kann Modellieren mit eine maßgeschneiderte Distraktor erstellt mit einem Dentallabor Werkzeug und Technik, die in einer früheren Studie verwendet wurde.
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Protocol
Alle Experimente wurden gemäß Protokollen durch die Animal Care and Use Committee unserer Institution genehmigt durchgeführt. Sterilisieren Sie alle Instrumente vor dem Eingriff.
1. Vorbereitung einer Form für die Erstellung von maßgeschneiderten Distraktor
- Machen Sie zwei unvollständige Ringe (Außendurchmesser, 20 mm, Innendurchmesser 10 mm), die ein Teil der Distraktor, mit einem Blatt von Paraffinwachs (145 x 74 mm) mit einem Evans-Wachs-Carver sind.
- 4 der gleichen Stücke zu machen. Mit einem Spatel Wachs mit einem Gasbrenner erhitzt. Stapeln Sie die vier Ringe für eine Dicke von 5 mm. bieten Raum für die Erweiterung Schraube und Nadel, 8 x 2 mm und 5 mm x 2 mm bzw. mit der Evans-Wachs-Carver (Abbildungen 1A, 1 b).
- Betten Sie Wachsmodelle in das Silikon-Abdruckmaterial ein und erstellen Sie eine Form für die Harz-Ringe (Abbildung 1C).
- Nach dem Aushärten der Silikon-Abformmasse (ca. 5 min bei Raumtemperatur), entfernen Sie die Wachsmodelle.
2. Herstellung von maßgeschneiderten Distraktor
- Vaseline dünn und gleichmäßig auf die Silikonform anwenden. Mischen Sie 3 g Polymerisation dental Harz und gießen Sie sie sofort in die Silikonform. Set für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie die polymerisierten Harz-Ring aus der Form und Polieren Sie es mit einem Hartmetall-Bar und eine zahnärztliche Mikromotor, den Grat (ca. 1 min) zu entfernen. Zwei Kunststoff-Ringe sind für jedes maßgeschneiderte Distraktor erforderlich.
- Wiederholen Sie den Vorgang, um die erforderliche Anzahl von Harz Ringe (Abbildung 1D) erstellen.
- Lassen Sie einen Abstand von ca. 2 mm zu beheben die Harz-Ringe mit Dienstprogramm Wachs und die Außenseite der Erweiterung Schraube komplett mit transparentem Harz zu sichern. Legen Sie das Harz für 5 min bei RT Bei der Polymerisation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Ausbau Schraube Knopf (Abbildung 1E).
3. chirurgische Protokoll
- Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche Mäuse.
- Anästhesie mit einer intraperitonealen Injektion von Medetomidine Hydrochlorid bei 0,3 mg/g, Midazolam bei 4 mg/kg und Butorphanol Tartrat bei 5 mg/kg Körpergewicht zu induzieren.
- Rasieren Sie sorgfältig und desinfizieren Sie den OP-Bereich mit 10 % Jod-Lösung und dann verwalten Sie 0,5 % Lidocain Hydrochlorid in der rechten unteren Extremität zu.
- Machen Sie einen längs-Hautschnitt (ca. 15 mm in der Länge) am rechten Bein mit einem Skalpell Nr. 15 zu senken. Unverblümt trennen Sie die darunter liegenden Muskeln, kümmert sich nicht um alle von der Knochenhaut zu entfernen. Ansatz von außen, das Wadenbein (Fibula) leicht zu erreichen. Durchschneiden Sie das Wadenbein (Fibula) mit einer Schere.
- Greifen Sie den Knöchel mit schmalen dünnen sterilen Pinzette und verwenden Sie eine sterilen 27 G Nadel ein Loch in den Knochen ca. 5 mm von der Ferse zu. Die Nadel sollte die Haut, Knochen und Haut in dieser Reihenfolge eindringen. Wenn die Nadel dringt, die Spitze und die Wurzel mit einer Nipper geschnitten, so dass die Nadel ist ca. 15 mm.
- Ein weiteres Loch in der gleichen Weise, ca. 2 – 3 mm proximal zu machen. Halten Sie um den Knöchel und passieren Sie zwei 25 G Nadeln unter dem Knie auf die gleiche Weise. Nachdem die Nadeln zu durchdringen, schneiden Sie die Spitzen und Wurzeln mit einem Nipper (Abbildung 1F).
- Der maßgeschneiderte Distraktor zu platzieren, so dass es parallel zur Richtung Erweiterung. Befestigen Sie die Nadeln und das Gerät mit genügend Polymerisation dental Harz, die Rillen des Geräts zu füllen. Warten auf die Polymerisation in Anspruch (ca. 5 min) (Abbildung 1G).
- Achten Sie darauf, dass Sie nicht das umliegende Gewebe zu schädigen. Schneiden Sie die Mitte der Diaphyse der Tibia mit einer sehr dünnen Trennscheibe beim Anwenden einer Salzlösung (1 – 2 mL).
- Schließen Sie die Wunde mit einer 4: 0-Nylon-Naht.
- Geben Sie subkutane Injektionen von Buprenorphin (0,1 mg/kg) für Analgesie unmittelbar nach Operation. Buprenorphin alle 12 Std. durch postoperativen Tag 7 und nach Bedarf danach weiter.
4. Ablenkung Protokoll
Hinweis: Es gibt verschiedene Berichte über die Latenz-Zeit und Ablenkung Rate, aber hier repräsentative Protokolle werden gezeigt.
- Starten Sie nach einer Latenzzeit von 5 Tagen Ablenkung mit einer Rate von 0,2 mm/12 h. Verwenden Sie für die Erweiterung die Pin auf die rasche Expansion-Schraube befestigt. Bewegen Sie den Stift in Richtung der gelbe Pfeil an die Erweiterung-Schraube (Bild 1E) befestigt.
- Narkose ist nicht erforderlich, beim Ausfahren. Halten Sie das Heck mit den kleinen Finger und Handfläche und fixieren Sie das Extensionsgerät mit Zeigefinger und Daumen.
- Erweiterung (0,2 mm für 1/4 Umdrehung) durchführen. Verlängerung für 8 Tage, insgesamt 3,2 mm Abstand führt weiter.
5. Analyse
- Röntgen-Analyse: nach Abschluss der Erweiterung, evaluieren Knochenregeneration mit der Computertomographie unter Vollnarkose mit 2,0 % Isofluran.
Hinweis: Wenn in Bezug auf die Position des Geräts Erweiterung Sorgfalt ist es möglich, es auch mit dem Gerät verbunden mit einfachen Röntgen zu bewerten. - Histologische Analyse: Entfernen Sie das Gerät vorsichtig um keine Bruchstelle Ablenkung während der Probenahme zu verursachen. Befestigen Sie die Probe in 10 % neutral gepuffertem Formalin für 24 h bei Raumtemperatur. Entkalken Sie mit Morse Lösung (10 % Natriumcitrat, 20 % Ameisensäure) über Nacht bei 4 ° C.
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Representative Results
Abbildungen 1A und 1 b präsentieren unvollständige Ringe (äußeren Durchmesser, 20 mm, innere Durchmesser, 10 mm, 5 mm Dicke) mit Paraffinwachs. Zwei Wachsmodelle in Silikon Abformmasse eingebettet waren, und eine Form für die Harz-Ringe (Abbildung 1C) gegründet. Polymerisierten Harz wurde sofort in dieser Form gegossen wurden, und Harz Ringe (Abbildung 1D). Eine maßgeschneiderte Distraktor entstand durch die Kombination von zwei Harz-Ringen und einer Erweiterung-Schraube (Abbildung 1E). Abbildung 2 A zeigt typische Radiographie Ergebnisse 4 Wochen nach Ablenkung im Modell. Neu gebildeten Knochen wurde am Standort Ablenkung beobachtet. Abbildung 2B stellt die Hämatoxylin und Eosin Färbung Ergebnisse. Eine neu gebildete Knochen-Brücke wurde beobachtet, und der neu gebildete Knochen könnte aus dem nativen Knochen leicht unterschieden werden. Es gab keine intraoperative Bruch oder postoperativen Infektion in den 5 Mäusen in diesem Experiment verwendet.
Abbildung 1 : Maßgeschneiderte Distraktor. (A, B) Die ungefähren Abmessungen des Ringes sind wie folgt: Außendurchmesser, 20 mm; Innendurchmesser 10 mm; 5 mm Dicke. Die Räume für die Erweiterung Schraube (weiße Pfeilspitze) und Nadel (schwarze Pfeilspitze) sind gesichert. (C) Wachsmodell eingebettet in die Silikon-Abformmasse. (D) abgeschlossene Ringe Harz. (E) die beiden Harz Ringe und die Erweiterung Schraube werden mit Harz befestigt. (F) vier Nadeln werden in den proximalen und distalen Metaphyse des Schienbeins eingefügt. (G) Ablenkung Gerät platziert in der Maus-Extremität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Radiologische und histologische Befunde. (A) radiologisch, neu gebildeten Knochen tritt 4 Wochen nach Ablenkung. (B) histologisch, die Lücke ist gefüllt mit neu gebildeten Knochen (Maßstabsleiste = 500 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wenn ein großes Tier als ein experimentelles Modell verwendet wird, eine fertige Extensionsgerät kann verwendet werden, und es ist einfach zu erhalten gute Fixierung und bewerten die Erweiterung Operation selbst und die Erweiterung. Wenn eine Maus als ein experimentelles Modell verwendet wird, ist es jedoch notwendig, einige oder alle Geräte zu entwickeln. Isefuku Et Al. und Tay Et Al. das Gerät aus und erstellt ein Maus-Modell7,8. Carvahjo Et Al. angenommen eine Methode, die Fixierung eines fertigen Ausbau-Geräts (Distraktor verfolgen: KLS Martin) durch eine Ligatur Draht-9. Wir könnten auch ein Mausmodell mit bestehenden Produkten für die Erweiterung Geräte und Entwicklung einer Fixierung-Methode erstellen. Dieser Ansatz würde es einfach zur Herstellung der Extensionsgerät, Erweiterung durchführen und bewerten die Erweiterung Menge machen. Darüber hinaus wird erwartet, dass eine tibiale segmentale defekt-Modell mit demselben Gerät erstellt werden könnte. Darüber hinaus ist die Länge des Mangels einstellbar in Schritten von 0,2 mm und somit das Gerät gilt als vielseitig.
In ein solches Experiment ist es technisch schwierig, fädeln Sie die Nadel durch die Tibia. Insbesondere der Durchmesser der distalen Teil des Schienbeins ist klein und etwas Training ist erforderlich, um zwei Nadeln zu übergeben. Wenn ausreichend Knochen nicht vermerkt ist, ist es notwendig zu prüfen, ob gute Fixierung gewonnen wird. Um gute Fixierung zu erhalten, könnte es besser, die Nadeln in einem Winkel und mit einem Abstand so weit wie möglich zwischen den Nadeln7,8übergeben sein. Zusätzlich, da die Rate der Heilung und der Histologie während der Heilung nach der Methode der Osteotomie ändern würde, ist es notwendig, das Verfahren in einer bestimmten Weise durchzuführen.
Die Größe der das Versuchstier kann als ein limitierender Faktor für dieses Experiment betrachtet werden. Es gibt keine Probleme, wenn die Maus groß ist; jedoch wenn es zu klein ist, kann Chirurgie selbst nicht möglich. Zuvor, wir 4 Wochen alten Mäusen verwendet und konnten ohne jede Probleme10Experimente durchführen. Im Hinblick auf den Auswertungszeitraum konnte Erweiterung Geräte bis 42 Tage nach dem Schneiden des Knochens ohne Probleme installiert werden. Als weitere Beobachtungen nicht gemacht wurden, ist jedoch weitere Forschung notwendig in der Zukunft. Das Auftreten von Komplikationen kann ein Problem sein, wenn Experimente voran. Bei etwa 1 von 30 Mäusen könnte zum Bruch während der Operation kommen. In ähnlicher Weise kann postoperative Wundinfektionen in etwa 1 von 30 Mäuse auftreten.
Abschließend stellten wir eine tibiale Mausmodell mit einem maßgeschneiderten Distraktor entwickelt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Frau Makiko Kato für die Bereitstellung von Ermutigung, diese Studie abzuschließen. Wir danken auch die Division von Versuchstieren und Medical Research Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, für die Unterbringung von Mäusen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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