Summary
אנו מציגים מודל פרכת הסחת דעת הטיביאלי העכבר פותח באמצעות של distractor בהזמנה אישית. השימוש של עכבר בתור מטרה ניתוח הוא יתרון לקידום המחקר.
Abstract
הארכת עצמות (DO) היא הליך כירורגי הכרוך התחדשות רקמות השלד ללא השתלת תא. מודל דו מורכב מהפעולות הבאות שלושה שלבים: שלב החביון לאחר osteotomy והמיקום של distractor חיצוניים; שלב הסחת דעת, שבו קצות העצם מופרדים בהדרגה ובאופן רצוף ודעתם מוסחת; שלב איחוד. זה distractor בהזמנה אישית משמש לעשות מורכבת שתי טבעות לא שלמה שרף אקרילי של בורג הרחבה. התהליך היה ביוזמת ללקיחת תבנית סיליקון הרושם החומר ולאחר מכן יצירת את distractor בהזמנה אישית. שרף שיניים נשפך לתוך טפסות עשוי מחומר סיליקון רושם, זה לא הותר פולימריזציה ליצירת הטבעות לא שלמה שרף הדרושות את distractor בהזמנה אישית. טבעות אלו היו קבוע עם בורג הרחבה באמצעות שרף שקוף. Distractor בהזמנה אישית שנוצרו באמצעות גישה זו צורפה עצם השוקה של עכברים. עצם השוקה היה קבוע להתקן באמצעות זוג אחד של 25 גרם מחטים הציר הקרוב, זוג אחד של מחטים 27 G. רחוק, שרף אקרילי. לאחר תקופה זמן השהיה של 5 ימים, הסחת הדעת היה יזם בשיעור של 0.2 מ מ/12 שעות. הארכת המשיך במשך 8 ימים, נוצר פער מוחלט של 3.2 מ מ. העכברים הוקרבו 4 שבועות לאחר הסחת דעת. היווצרות העצם בנקיק הסחת דעת אושר באמצעות רדיוגרפיה והן היסטולוגיה.
Introduction
הארכת עצמות (DO) היא שיטת טיפול הוקמה עבור מגוון רחב של הפרעות השלד, כגון אי-התאמות אורך האיבר, עצם פגמים איבר מומים1. אסטרטגיית טיפול ייחודי זה מבוסס על "עקרון מתח-מתח" המוצע על ידי מרפי. השיטה דורשת מספר ימים השהיה, מספר שבועות עבור active הסחת דעת של מספר חודשים עבור איחוד עד העצם בוגר הוא בנוי2.
התנאים ובשפתיים המקומי עקב חסימה של3,זרימת דם4 ו-5,גירוי מכני6 חשובים במיוחד בתהליך ההחלמה של האם. היפוקסיה-induced אנגיוגנזה נושא חמצן, חומרים מזינים, גורמים מסיסים ותאים הדרושים לתיקון רקמות מקומית דרך זרם הדם. גירוי מכני על ידי הרחבת הפעולה גורמת לתגובות ביולוגיות כגון בידול של גזע mesenchymal, היווצרות העצם, הסתיידות, שיפוץ. טיפול דו טורי מאפשרת היווצרות של רקמות קשה אלא גם רקמות רכות, כולל העצבים, שרירים, כלי דם, רקמות העור, ללא צורך השתלת תא גזע. לכן, מודל דו נחשב להיות מודל מצוין עבור ניתוח ולחידוש רקמות שונות.
ארנבים, כלבים הם החיות הנפוצה ביותר במחקר בסיסי לעשות; עם זאת, יש כמה כלי ניתוח זמינים עבור בעלי חיים אלה. השימוש העכבר לעשות מודל מקלה על ניתוח מפורט יותר. . זה מתאים במיוחד עבור ניסויים שימוש בעכברים נוקאאוט. עם זאת, בעת שימוש בעכבר כחיה ניסיוני, ליצור התקן הרחבה. כאן, אנו מציגים עכבר הטיביאלי מודל פותח באמצעות של distractor בהזמנה אישית שנוצרו באמצעות הכלי מעבדת שיניים טכניקה, אשר שימש במחקר הקודם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי חיה אכפת שימוש הוועדה של מוסדנו. לעקר את כל הכלים לפני ההליך.
1. הכנת תבנית ליצירת את Distractor בהזמנה אישית
- להפוך שתי טבעות לא שלם (הקוטר החיצוני, 20 מ מ; הקוטר הפנימי, 10 מ מ), אשר הם חלק distractor, עם גיליון אחד של פרפין (145 מ"מ x 74 מ"מ) באמצעות קארבר שעווה של אוונס.
- להפוך את 4 החלקים אותו. השתמש במרית שעווה מחוממת עם מבער גז. מחסנית של ארבע טבעות עבור עובי של 5 מ מ. לספק שטח הרחבה בורג, מחט, 8 מ"מ x 2 מ"מ ו 5 מ"מ x 2 מ"מ בהתאמה עם שעווה אוונס המבתר (דמויות 1A, 1B).
- להטביע שעווה תבניות סיליקון הרושם החומר וליצור תבנית עבור הטבעות שרף (איור 1C).
- לאחר ריפוי החומר הרושם סיליקון (כ 5 דקות בטמפרטורת החדר), הסר את דפוסי שעווה.
2. הפקת Distractor בהזמנה אישית
- להחיל וזלין דק וגם באופן שווה בתבנית סיליקון. לערבב דור 3 של שרף שיניים פלמור, ומיד שופכים אותו לתבנית סיליקון. להגדיר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- להסיר את הטבעת שרף polymerized כייר ולהבריק אותו עם בר קרביד, עם micromotor שיניים כדי להסיר את בר (בערך 1 דקות). שתי טבעות שרף נדרשים עבור כל distractor בהזמנה אישית.
- חזור על התהליך כדי ליצור את המספר הנדרש של שרף טבעות (איור 1D).
- השאר פער של-2 מ מ כדי לתקן את הטבעות שרף עם שעווה השירות ולאבטח החיצוני של הבורג הרחבה לחלוטין עם שרף שקוף. להגדיר את השרף במשך 5 דקות ב- RT. עם השלמת פלמור, להסיר את הידית בורג הרחבה (איור 1E).
3. ניתוח פרוטוקול
- השתמש עכברים זכרים בת שבוע 8.
- לגרום הרדמה עם זריקה בקרום הבטן של medetomidine הידרוכלוריד-0.3 מ"ג/g, midazolam ב 4 מ"ג/ק"ג, butorphanol tartrate ב 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
- בזהירות לגלח לחטא את האזור הכירורגי עם 10% יוד פתרון ו ואז לנהל 0.5% הידרוכלוריד לידוקאין-האיבר הימני התחתון.
- עושים אורכית העור חתך (כ 15 מ מ אורך) הנכון להוריד את הרגל עם איזמל מס 15. בלשון בוטה להפריד בין השרירים המשמשים כבסיס, מטפל לא כדי להסיר את כל קרום העצם. הגישה מבחוץ להגיע בקלות אל השוק. חותכים את השוק עם מספריים.
- לתפוס את הקרסול עם מלקחיים סטרילי דק וצר, והשתמש מחט סטרילית 27 G לעשות חור העצם כ 5 מ מ העקב. המחט צריך לחדור את העור, עצם ועור לפי הסדר הזה. כאשר המחט חודרת, לחתוך את העצה ושורש עם אוחז כך המחט הוא כ- 15 מ מ.
- לעשות חור נוסף באותו אופן, מקורב בסביבות 2-3 מ"מ. להחזיק מסביב לקרסול ולהעביר שתי מחטים 25 גרם מתחת לברך באופן זהה. לאחר לחדור המחטים, לחתוך את עצות ושורשים עם אוחז (איור 1F).
- מניחים את distractor בהזמנה אישית כך הוא מקביל לכיוון הרחבה. לתקן את המחטים ואת המכשיר עם שרף שיניים מספיק הפילמור למלא את החריצים של המכשיר. לחכות הפילמור להשלמת (כ- 5 דקות) (איור 1G).
- להיזהר לא לפגוע הרקמות הסובבות. חותכים באמצע diaphysis של עצם השוקה באמצעות דיסק חיתוך דק מאוד תוך יישום של תמיסת מלח (1 – 2 מ"ל).
- לסגור את הפצע בתפר ניילון 4-0.
- לתת זריקות תת עורית של הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) נגד כאבים מיד לאחר הניתוח. המשך הבופרנורפין כל 12 שעות לאחר הניתוח היום 7 ונחוץ גם לאחר מכן.
4. פרוטוקול הסחת דעת
הערה: ישנם דיווחים שונים על השהיית קצב תקופת של הסחת דעת, אבל כאן, נציג פרוטוקולים מוצגים.
- לאחר תקופה זמן השהיה של 5 ימים, להתחיל הסחת דעת בשיעור של 0.2 מ מ/12 שעות. סיומת, שימוש ה-pin המצורפת את הבורג ההתרחבות המהירה. להזיז את הסיכה בכיוון החץ הצהוב קשורה הבורג סיומת (איור 1E).
- הרדמה אין צורך בתקופת הארכה. שתחזיק את הזנב עם האצבע הקטנה, דקל, לתקן את המכשיר הרחבה עם לאצבע ואת האגודל.
- לבצע הרחבה (0.2 מ"מ עבור התור 1/4). המשך הארכת במשך 8 ימים, אשר יניבו רווח כולל של 3.2 מ מ.
5. ניתוח
- רדיוגרפיה ניתוח: לאחר סיומו של הרחבה, להעריך את התחדשות העצם עם טומוגרפיה בהרדמה כללית על ידי שימוש איזופלוריין 2.0%.
הערה: אם יש להגדיר את הוקדשה לגבי המיקום של המכשיר סיומת, זה אפשרי להעריך את זה עם רדיוגרפיה פשוטה אפילו עם המכשיר מחובר. - ניתוח היסטולוגית: להסיר את המנגנון בזהירות כדי לא לגרום שבר הסחת דעת אתר במהלך הדגימה. לתקן את הדגימה בפורמלין במאגר נייטרלי 10% במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. Decalcify לילה עם הפתרון של מורס (10% סודיום ציטרט, 20% חומצה פורמית) ב 4 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דמויות 1A ו- 1B להציג טבעות לא שלם (החיצוני קוטר, 20 מ מ הפנימי קוטר, 10 מ"מ; עובי, 5 מ מ) פרפין. שתי תבניות שעווה הוטבעו בחומר הרושם סיליקון, נוצרה תבנית עבור הטבעות שרף (איור 1C). שרף polymerized נשפך מיד לתוך זה עובש, שרף טבעות התקבלו (איור 1D). Distractor בהזמנה אישית נוצר על ידי שילוב של שתי טבעות שרף ובורג הרחבה (איור 1E). איור 2 A מציג ממצאים טיפוסיים רדיוגרפיה-4 שבועות לאחר הסחת דעת במודל. עצם שהוקם נצפתה באתר הסחת דעת. איור 2B מציגה את hematoxylin אאוזין מכתים תוצאות. גשר שהוקם עצמות נצפתה, העצם שהוקם יכול להבחין בקלות בין עצם מקורי. היה אין שבר פוסט ניתוחית או זיהום לאחר הניתוח בעכברים 5 השתמשו בניסוי זה.
איור 1 : Distractor בהזמנה אישית. (A, B) הממדים משוער של הטבעת הם כדלקמן: הקוטר החיצוני, 20 מ מ; הקוטר הפנימי, 10 מ מ; עובי, 5 מ מ. הרווחים עבור הרחבת בורג (חץ לבן) ומחט (חץ שחור) מאובטחים. (ג) דפוס שעווה מוטבע בחומר הרושם סיליקון. (ד) הושלם שרף טבעות. שרף (E) השני אגרופים, הבורג הרחבה מאובטחים עם שרף. (F) 4 מחטים מוכנסים metaphysis הפרוקסימלית ו דיסטלי של עצם השוקה. (G) מכשיר הסחת דעת להציב האיבר העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ממצאים רדיולוגי, היסטולוגית. (א) Radiologically, שהוקם העצם הוא ציין 4 שבועות לאחר הסחת דעת. (B) בהיסטולוגיה, הפער הוא מלא שזה עתה נוצר עצם (סולם בר = 500 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר חיה גדולה משמשת כמודל ניסויי, ניתן להשתמש בהתקן הרחבה מוכנות מראש, קל להשיג קיבוע טוב ולהעריך את פעולת ההרחבה עצמו ואת הסכום סיומת. עם זאת, כאשר עכבר משמשת כמודל ניסויי, יש צורך לפתח חלק או את כל הציוד. . Isefuku et al. , טיי. ואח הפך המכשיר ויצרו העכבר מודל7,8. . Carvahjo et al. אימצה שיטה מעורבים קיבוע של התקן הרחבה מוכנות (מעקב אחר distractor: גיבוי KLS מרטין) עם חבל תיל9. נוכל גם ליצור מודל דו העכבר באמצעות מוצרים קיימים עבור התקני הרחבה מהחששות שיטה קיבעון. גישה זו את זה קל לייצר את המכשיר סיומת, לבצע הרחבה, וכן להעריך את הסכום הרחבה. יתר על כן, צפוי כי מודל פגם סגמנטלי הטיביאלי עלול להיווצר תוך שימוש באותו ההתקן. בנוסף, ניתן להתאים את אורך הפגם בשלבים של 0.2 מ מ, ונחשב לפיכך, המכשיר צדדי.
ב. ניסוי כזה, קשה מבחינה טכנית לשרשר את המחט דרך עצם השוקה. בפרט, הקוטר של החלק הדיסטלי של עצם השוקה הוא קטן, קצת אימונים נדרש לעבור שתי מחטים. אם עצם מספיק. הוא לא מפורסם, זה הכרחי לבדוק קיבוע טוב מתקבל. על מנת לקבל קיבוע טוב, אולי עדיף לעבור את המחטים בזווית ועם פער רחבה ככל האפשר בין מחטים7,8. בנוסף, כפי שיעור ריפוי, היסטולוגיה במהלך הריפוי. ישתנה בהתאם לשיטת osteotomy זה צורך לבצע את ההליך בצורה מסוימת.
הגודל של החיה ניסיוני יכול להיחשב כגורם המגביל את הניסוי הזה. ישנן בעיות כאשר העכבר גדול; עם זאת, אם הוא קטן מדי, מהניתוח עצמו לא ייתכן. בעבר, השתמשו בעכברים בת 4 בשבוע, היו מסוגלים לבצע ניסויים ללא כל בעיות10. לגבי תקופת ההערכה, יכול להתקין התקני הרחבה ללא בעיות עד 42 ימים לאחר חיתוך העצם. עם זאת, כמו עוד תצפיות לא יוצרו, מחקר נוסף הכרחי בעתיד. המופע של סיבוכים עלול להיות בעיה בעת קידום ניסויים. שבר במהלך הניתוח עלול להתרחש כ 1 מתוך 30 עכברים. בדומה לכך, זיהום הפצע שלאחר הניתוח עלול להתרחש כ 1 מתוך 30 עכברים.
לסיכום, הצגנו העכבר הטיביאלי לעשות מודל שפותח באמצעות distractor בהזמנה אישית...
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים גב' Makiko קאטו על מתן עידוד כדי להשלים את המחקר הזה. אנו מודים גם את הדיוויזיה של חיות ניסוי רפואי מחקר הנדסי, נאגויה בוגר בית הספר לרפואה של אוניברסיטת, על הדיור של עכברים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
