Summary
Se presenta un modelo de osteogénesis de distracción tibial de ratón desarrollado utilizando un distractor por encargo. El uso de un ratón como un objetivo de análisis es ventajoso para el avance de la investigación.
Abstract
Distracción osteogénica (DO) es un procedimiento quirúrgico que implica la regeneración de los tejidos esqueléticos sin trasplante de la célula. Un modelo consta de las siguientes tres fases: la fase de latencia después de la osteotomía y colocación del distractor externo; la fase de distracción, en donde los extremos del hueso separado son gradualmente y continuamente distraídos; y la fase de consolidación. Este distractor por encargo usado para hacer está compuesto por dos anillos de resina acrílica incompleta y un tornillo de expansión. El proceso fue iniciado por hacer un molde con material de impresión de silicona y luego crear el distractor a medida. Resina dental fue vertida en el encofrado hecho de material de impresión de silicona, y fue permitido para polimerizar para crear los anillos de resina incompleta para el distractor a medida. Estos anillos se fijaban con un tornillo de expansión con resina transparente. El distractor a medida creado a través de este enfoque fue unido a la tibia de los ratones. La tibia era fijo al dispositivo usando un par de agujas de 25 G proximalmente, un par de agujas de 27 G distalmente y resina acrílica. Después de un período de latencia de 5 días, la distracción se inició a una velocidad de 0.2 mm/12 h. La prolongación fue continuada por 8 días, resultando en un espacio total de 3,2 mm. Los ratones fueron sacrificados 4 semanas después de la distracción. La formación del hueso en el hueco de distracción fue confirmada mediante radiografía y la histología.
Introduction
Distracción osteogénica (DO) es un método de tratamiento establecido para una variedad de trastornos esqueléticos, tales como las discrepancias de longitud de extremidades, defectos óseos y deformidades de extremidades1. Esta estrategia de tratamiento único se basa en el "principio de tensión-estrés" propuesto por Ilizarov. El método requiere varios días de latencia, distracción activa varias semanas y varios meses para la consolidación de hasta el hueso maduro formado2.
Las condiciones hipóxicas locales debido a la obstrucción de sangre flujo3,4 y5,de estimulación mecánica6 son particularmente importantes en el proceso de. Angiogénesis inducida por la hipoxia lleva oxígeno, nutrientes, factores solubles y células necesarias para la reparación de los tejidos localmente a través del flujo de sangre. Estimulación mecánica por la operación de extensión provoca reacciones biológicas como la diferenciación de células madre mesenquimales, formación del hueso, calcificación y remodelación. Tratamiento serial permite la formación de tejidos duros, sino también los tejidos blandos, incluyendo los nervios, músculos, vasos sanguíneos y tejidos de la piel, sin necesidad de trasplante de células madre. Por lo tanto, un modelo se considera un excelente modelo para el análisis de la regeneración de diversos tejidos.
Perros y conejos son los animales más utilizados en la investigación básica para hacer; sin embargo, hay algunas herramientas de análisis disponibles para estos animales. El uso de un modelo del ratón facilita un análisis más detallado. Es particularmente conveniente para los experimentos con ratones knockout. Sin embargo, al usar un ratón como un animal experimental, se debe crear un dispositivo de extensión. Aquí, presentamos un ratón tibial modelo desarrollado utilizando un distractor a medida creado utilizando una herramienta de laboratorio dental y técnica, que se ha utilizado en un estudio anterior.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de nuestra institución. Esterilizar todos los instrumentos antes del procedimiento.
1. preparación de un molde para crear el Distractor a medida
- Hacer dos anillos incompletos (diámetro exterior, 20 mm; diámetro interior, 10 mm), que forman parte del distractor, con una hoja de cera de parafina (145 mm x 74 mm) utilizando un carver cera de Evans.
- Hacer 4 de las mismas piezas. Use una espátula de cera calentada con un mechero de gas. Pila de los cuatro aros para un espesor de 5 mm proporciona espacio para el tornillo de la extensión y la aguja, 8 x 2 mm y 5 mm x 2 mm respectivamente con el escultor de cera Evans (figuras 1A, 1B).
- Incorporar patrones de cera en el material de impresión de silicona y crear un molde para los aros de resina (figura 1C).
- Después de curado el material de impresión de silicona (aproximadamente 5 min a temperatura ambiente), quite los patrones de cera.
2. producción del Distractor a medida
- Aplique petrolato fino y uniformemente en el molde de silicona. 3 g de la resina dental de polimerización de la mezcla y viértala inmediatamente en el molde de silicona. Set de 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Desmoldar el anillo de la resina polimerizada y pulirlo con una barra de carburo y un micromotor dental para quitar las rebabas (1 min.). Dos anillos de resina se requieren para cada distractor por encargo.
- Repita el procedimiento para crear la cantidad necesaria de anillos de resina (figura 1D).
- Deje una separación de unos 2 mm para fijar los anillos de resina con cera de utilidad y fije el tornillo de expansión totalmente con resina transparente. Establecer la resina por 5 min a TA. Cuando la polimerización se completa, quite la perilla de tornillo de expansión (figura 1E).
3. protocolo quirúrgico
- Uso de ratones machos de 8 semanas de edad.
- Inducir la anestesia con una inyección intraperitoneal de hidrocloruro de medetomidina en 0.3 mg/g, midazolam a 4 mg/kg y el tartrato de butorfanol en 5 mg/kg de peso corporal.
- Cuidadosamente afeitado y desinfectar la zona quirúrgica con solución de yodo al 10% y luego, administrar clorhidrato de lidocaína 0.5% en el miembro inferior derecho.
- Hacer una incisión cutánea longitudinal (aproximadamente 15 mm de longitud) en la parte derecha inferior de la pierna con un bisturí no. 15. Sin rodeos se separan los músculos, teniendo cuidado de no para quitar todos del periostio. Acercarse desde el exterior para llegar en el peroné. Corte el peroné con tijeras.
- Sujete el tobillo con estrechas finas pinzas estériles y utilizar una aguja de 27 G estéril hacer un orificio en el hueso alrededor de 5 mm desde el talón. La aguja debe penetrar en la piel, hueso y piel en ese orden. Cuando la aguja penetra, cortar la punta y la raíz con una pinza para que la aguja es de unos 15 mm.
- Hacer otro agujero de la misma manera, unos 2 – 3 mm proximal. Mantenga alrededor del tobillo y pasar dos agujas 25 G debajo de la rodilla de la misma manera. Después de que las agujas penetran, cortar las puntas y las raíces con una pinza (figura 1F).
- Coloque el distractor a medida que sea paralelo a la dirección de extensión. Fijar las agujas y el dispositivo con suficiente resina dental de polimerización para llenar las ranuras del aparato. Espere la polimerización completar (aproximadamente 5 min) (figura 1G).
- Tenga cuidado de no dañar los tejidos circundantes. Cortar la mitad de la diáfisis de la tibia utilizando un disco de corte muy fino mientras se aplica una solución salina (1 – 2 mL).
- Cerrar la herida con una sutura de nylon 4-0.
- Dar inyecciones subcutáneas de buprenorfina (0.1 mg/kg) para la analgesia inmediatamente después de la operación. Continuar cada 12 h por día postoperatorio 7 y, según sea necesario después de eso la buprenorfina.
4. distracción protocolo
Nota: Hay diversos informes sobre la tasa de distracción y período de latencia, pero aquí, se muestran los protocolos de representante.
- Después de un período de latencia de 5 días, iniciar la distracción a un ritmo de 0.2 mm/12 h. Para la extensión, utilice el perno conectado al tornillo de expansión rápida. Mueva el pasador en la dirección de la flecha amarilla conectada al tornillo de extensión (figura 1E).
- No es necesaria anestesia durante la extensión. Sujete la cola con el dedo meñique y la palma y fije el dispositivo de extensión con el índice y el pulgar.
- Realizar extensión (0,2 mm para 1/4 vuelta). Continuar alargando durante 8 días, que dará como resultado un espacio total de 3,2 mm.
5. Análisis
- Análisis de la radiografía: después de la terminación de la extensión, evaluar la regeneración ósea con tomografía computada bajo anestesia general mediante el uso de isoflurano de 2.0%.
Nota: Si se ha cuidado en cuanto a la posición del dispositivo de extensión, es posible evaluar con la radiografía simple aún con el dispositivo conectado. - Análisis histológico: Retire el aparato con cuidado para no causar un sitio de distracción de la fractura durante el muestreo. Fijar la muestra en formalina tamponada neutra 10% durante 24 h a temperatura ambiente. Descalcificación con solución de Morse (citrato de sodio 10%, 20% de ácido fórmico) durante la noche a 4 ° C.
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Representative Results
Figuras 1A y 1B presentan anillos incompletos (exterior de diámetro, 20 mm interior de diámetro, 10 mm; espesor, 5 mm) con cera de parafina. Dos patrones de la cera fueron embebidos en material de impresión de silicona, y se formó un molde para los aros de resina (figura 1C). Resina polimerizada se vierte inmediatamente en este molde, y anillos de resina fueron obtenidos (figura 1D). Un distractor a medida fue creado mediante la combinación de dos anillos de resina y un tornillo de expansión (figura 1E). Figura 2 A presenta radiografía típica resultados en 4 semanas después de la distracción en el modelo. Se observó hueso recién formado en el sitio de distracción. Figura 2B presenta el hematoxylin y la eosina tinción resultados. Se observó un puente de hueso recién formado, y el hueso recién formado se distinguen fácilmente del hueso nativo. No había fractura intraoperatoria o postoperatoria infección en los 5 ratones utilizado en este experimento.
Figura 1 : Distractor por encargo. (A, B) Las dimensiones aproximadas del anillo son los siguientes: diámetro externo, 20 mm; diámetro interno 10 mm; espesor, 5 mm. Se aseguran los espacios para el tornillo de la extensión (flecha blanca) y la aguja (flecha negra). (C) patrón de cera incrustado en el material de impresión de silicona. Terminado (D) anillos de resina. (E) los dos anillos de resina y el tornillo de expansión están asegurados con la resina. (F) de cuatro agujas se insertan en la metáfisis proximal y distal de la tibia. (G) dispositivo de distracción se coloca en la extremidad del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Resultados radiológicos e histológicos. (A) radiológico, hueso recién formado se observa 4 semanas después de la distracción. (B) histológico, la brecha se llena con recién formado del hueso (barra de escala = 500 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Cuando un animal de gran tamaño se utiliza como un modelo experimental, puede usarse un dispositivo de extensión del ready-made, y es fácil de obtener buena fijación y evaluar la operación de extensión sí mismo y la cantidad de extensión. Sin embargo, cuando un ratón se utiliza como un modelo experimental, es necesario desarrollar algunos o todo el equipo. Isefuku et al. y Tay et al dispositivo y crearon un ratón modelo7,8. Carvahjo et al. adoptó un método que implica la fijación de un dispositivo de expansión prefabricadas (pista distractor: KLS Martin) con una ligadura de alambre9. También podríamos crear un modelo del ratón usando los productos existentes para los dispositivos de la extensión y la elaboración de un método de fijación. Este enfoque sería fácil fabricar el dispositivo de extensión, realizar extensión y determinar la cantidad de extensión. Por otra parte, se espera que un defecto segmentario tibial modelo puede crearse utilizando el mismo dispositivo. Además, la longitud del defecto se puede ajustar en pasos de 0,2 mm, y por lo tanto, el dispositivo se considera versátil.
En tal experimento, es técnicamente difícil de enhebrar la aguja a través de la tibia. En particular, el diámetro de la parte distal de la tibia es pequeño y algo de entrenamiento es necesaria para pasar de dos agujas. Si no se observa suficiente hueso, es necesario comprobar si se obtiene buena fijación. Con el fin de obtener buena fijación, podría ser mejor pasar las agujas en un ángulo y con una brecha tan amplia como sea posible entre las agujas7,8. Además, como la tasa de curación y la histología durante la cura cambiaría según el método de osteotomía, es necesario llevar a cabo el procedimiento de una cierta manera.
El tamaño del animal experimental puede considerarse como un factor limitante de este experimento. No hay problemas cuando el ratón es grande; sin embargo, si es demasiado pequeño, la cirugía sí mismo no es posible. Anteriormente, se utilizan ratones de 4 semanas de edad y fueron capaces de realizar experimentos sin ningún problemas10. En relación con el período de evaluación, se podrían instalar dispositivos de extensión sin problemas hasta 42 días después de cortar el hueso. Sin embargo, como más no se realizaron observaciones, investigación adicional es necesaria en el futuro. La aparición de complicaciones puede ser un problema al avanzar experimentos. Fractura durante la cirugía puede ocurrir en aproximadamente 1 de 30 ratones. De manera similar, la infección postoperatoria de la herida puede ocurrir en aproximadamente 1 de 30 ratones.
En conclusión, presentamos un ratón tibial modelo desarrollado con un distractor por encargo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Sra. Makiko Kato para proporcionar estímulo a completar este estudio. También agradecemos a la división de animales de experimentación e investigación médica ingeniería, Nagoya University Graduate School of Medicine, para la vivienda de los ratones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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