Summary
Vi presenterar en tibial distraktion osteogenesis musmodell utvecklas med hjälp av en skräddarsydd distraktor. Användningen av en mus som ett analys-mål är fördelaktigt för att främja forskning.
Abstract
Distraktion osteogenesis (DO) är ett kirurgiskt ingrepp som innebär att skelettet vävnadsregeneration utan stamcellstransplantation. En-modellen består av följande tre faser: latens fasen efter osteotomi och placering av den externa distraktor; fasen distraktion, vari separerade benändarna är gradvis och kontinuerligt distraherad; och en konsolideringsfas. Denna skräddarsydda distraktor används för DO består av två ofullständiga akrylharts ringar och en expansion skruv. Processen inleddes genom att göra en mögel med silikon avtrycksmaterial och sedan skapa den skräddarsydda distraktor. Dental kåda var hälls i formen tillverkad av silikonmaterial intryck, och det var tillåtet att polymerisera för att skapa ofullständiga harts ringar krävs för den skräddarsydda distraktor. Dessa ringar var fast med en expansion skruven med transparent harts. Den skräddarsydda distraktor skapas via detta tillvägagångssätt var fäst vid skenbenet av möss. Skenbenet var fast till enheten med ett par av 25 G injektionsnålar proximalt, ett par 27 G nålar distalt, och akrylharts. Efter en latens på 5 dagar inleddes distraktion med en hastighet av 0,2 mm/12 h. Förlängningsstycket fortsattes i 8 dagar, vilket resulterar i en total lucka på 3,2 mm. Mössen offrades 4 veckor efter distraktion. Benbildning i distraktion klyftan bekräftades med både röntgen och histologi.
Introduction
Distraktion osteogenesis (DO) är en etablerad behandlingsmetod för en mängd sjukdomar, såsom avvikelser lem längd, ben defekter och lem missbildningar1. Denna unika behandlingsstrategi är baserad på ”spänning-stress principen” Ilizarov har föreslagit. Metoden kräver flera dagar för latens, flera veckor för aktiva distraktion och flera månader för konsolidering tills den mogna ben är bildade2.
De lokala hypoxisk förhållandena på grund av blockering av blod flöde3,4 och mekanisk stimulering5,6 är särskilt viktiga i läkningsprocessen av. Hypoxi-inducerad angiogenes transporterar syre, näringsämnen, lösliga faktorer och celler nödvändiga för vävnad reparera lokalt genom blodflödet. Mekanisk stimulering av förlängning drift orsakar biologiska reaktioner såsom differentiering av mesenkymala stamceller, benbildning, förkalkning och remodeling. Seriell behandling tillåter bildandet av inte bara hårda vävnader men också mjuka vävnader, inklusive nerver, muskler, blodkärl och hudvävnader, utan behov av stamcellstransplantation. Därför anses en modell vara en utmärkt modell för att analysera regenerering av olika vävnader.
Kaniner och hundar är de vanligaste djuren i grundforskning för DO; Det finns dock några analysverktyg som är tillgängliga för dessa djur. Det underlättar en mer detaljerad analys av en musmodell för. Det är särskilt lämplig för experiment med knockoutmöss. När du använder en mus som experimentella djur, bör dock en förlängning enhet skapas. Här utvecklade presenterar vi en mus tibial modell med hjälp av en skräddarsydd distraktor som skapats med ett tandtekniskt laboratorium verktyg och teknik som har använts i en tidigare studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av djur vård och användning kommittén av vår institution. Sterilisera alla instrument före ingreppet.
1. beredning av en mögel för att skapa den skräddarsydda distraktor
- Göra två ofullständiga ringar (ytterdiameter, 20 mm, inre diameter, 10 mm), som är en del av den distractor, med ett ark av paraffinvax (145 x 74 mm) använder en Evans vax carver.
- Gör 4 av samma bitar. Använd vax spatel värms med en gasbrännare. Stapla de fyra ringarna för en tjocklek på 5 mm. ge utrymme för expansion skruv och nål, 8 x 2 mm och 5 mm x 2 mm respektive med den Evans vax carver (figurerna 1A, 1B).
- Bädda in vaxet mönster i silikon intryck materialet och skapa en mögel för harts ringar (figur 1C).
- Efter härdning silikon avtrycksmaterial (ca 5 min i rumstemperatur), ta bort vax mönster.
2. produktion av den skräddarsydda distraktor
- Applicera vaselin tunt och jämnt till silikon mögel. Blanda 3 g polymerisation dental harts och omedelbart Häll det i en gjutform. Ställ för 5 min i rumstemperatur (RT).
- Ta bort polymeriserat harts ringen från mögel och putsa den med en hårdmetallbom och en dental mikromotor ta bort råeggen (ca 1 min). Två harts ringar krävs för varje skräddarsydda distraktor.
- Upprepa proceduren för att skapa det nödvändiga antalet harts ringar (figur 1D).
- Lämna en lucka på ca 2 mm att fixa harts ringar med verktyget vax och säkra utsidan av expansion skruven helt med transparent harts. Ställa in kådan för 5 min på RT. När polymerisation är klar, ta bort expansion skruv vredet (figur 1E).
3. kirurgiska protokoll
- Använd 8 veckor gamla manliga möss.
- Inducera anestesi med en intraperitoneal injektion av Medetomidin hydroklorid på 0,3 mg/g, midazolam på 4 mg/kg och butorfanol tartrat vid 5 mg/kg kroppsvikt.
- Omsorgsfullt rakar och desinficera det kirurgiska området med 10% jodlösning, och sedan administrera 0,5% lidokain hydroklorid på den högra nedre extremiteten.
- Gör en längsgående huden snitt (ca 15 mm i längd) höger lägre ben med nr 15 skalpell. Rakt på sak separata underliggande musklerna, utan att ta bort alla periostet. Strategi från utsidan för att enkelt nå fibula. Skär vadben med sax.
- Förstå fotleden med smala tunn steril pincett, och använda en steril 27 G nål för att göra ett hål i benet ca 5 mm från hälen. Nålen ska tränga in i hud, ben och hud i den ordningen. När nålen tränger, skär spets och roten med en tång så att nålen är ca 15 mm.
- Gör ett annat hål på samma sätt, ca 2 – 3 mm proximalt. Håll runt ankeln och passera två 25 G injektionsnålar under knät på samma sätt. Efter nålar penetrera, skär tips och rötter med en tång (figur 1F).
- Placera den skräddarsydda distraktor så att den är parallell med förlängning riktning. Fixa de nålar och enhet med tillräckligt polymerisation dental harts att fylla spåren i enheten. Vänta för polymerisation att slutföra (ca 5 min) (figur 1G).
- Var noga med att inte skada omgivande vävnader. Skär i mitten av diaphysis av skenbenet med mycket tunn skära skiva samtidigt som en saltlösning (1 – 2 mL).
- Nära såret med en 4-0 nylon sutur.
- Ge subkutana injektioner av buprenorfin (0,1 mg/kg) för smärtlindring direkt efter operation. Fortsätt buprenorfin varje 12 h genom postoperativ dag 7 och vid behov därefter.
4. distraktion protokoll
Obs: Det finns olika rapporter på den latens period- och distraktion, men här, representativt protokoll visas.
- Efter en latens på 5 dagar, börja distraktion i en takt av 0,2 mm/12 h. För förlängning, använda den PIN-kod som bifogas snabb expansion skruven. Flytta stiftet i riktning mot den gula pilen bifogas förlängning skruven (figur 1E).
- Anestesi är inte nödvändigt under förlängningen. Håll svansen med lillfingret och palm och fixa förlängning enheten med pekfingret och tummen.
- Utföra förlängning (0,2 mm för 1/4 varv). Att fortsätta förlänga i 8 dagar, vilket resulterar i en total lucka på 3,2 mm.
5. analys
- Radiografi analys: efter slutförandet av förlängning, utvärdera ben regenerering med datortomografi under narkos med hjälp av 2,0% isofluran.
Obs: Om vård har fattats när det gäller placeringen av enhetens förlängning, är det möjligt att utvärdera det med enkla radiografi även med den enhet som är ansluten. - Histologisk analys: ta bort apparaten försiktigt så att inte orsaka en fraktur distraktion webbplats under provtagning. Fixa provet i 10% neutral buffrad formalin för 24 h i rumstemperatur. Om avkalkning med Morses lösning (10% natriumcitrat, 20% myrsyra) över natten vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurerna 1A och 1B presenterar ofullständig ringar (yttre diameter, 20 mm, inre diameter, 10 mm, tjocklek 5 mm) med paraffin vax. Två vax mönster var inbäddade i silikon avtrycksmaterial, och en form för harts ringar (figur 1C) bildades. Polymeriserat kåda var omedelbart hälls i detta mögel och harts ringar erhölls (figur 1D). En skräddarsydd distraktor skapades genom att kombinera två harts ringar och en expansion skruven (figur 1E). Figur 2 A presenterar typiska radiografi resultat på 4 veckor efter distraktion i modellen. Nybildade benet observerades på webbplatsen distraktion. Figur 2B presenterar hematoxylin och eosin färgning resultat. En nybildade benet bro observerades, och det nybildade benet kan lätt skiljas från infödda benet. Det fanns ingen intraoperativ fraktur eller postoperativ infektion i de 5 möss som används i detta experiment.
Figur 1 : Skräddarsydda distraktor. (A, B) De ungefärliga dimensionerna av ringen är följande: yttre diameter, 20 mm. innerdiameter 10 mm; tjocklek 5 mm. Utrymmen för expansion skruv (vit pil) och nål (svart pil) är säkrade. (C) vax mönster inbäddade i silikon intryck materialet. (D) slutfört harts ringar. (E), två harts ringar och expansion skruven är säkrade med harts. (F) fyra nålar infogas i proximala och distala metaphysis av skenbenet. (G) distraktion enheten placeras i mus extremiteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Radiologiska och histologiska fynd. (A) radiologiskt, nybildade benet observeras 4 veckor efter distraktion. (B) histologiskt, klyftan är fylld med nybildade benet (skalstapeln = 500 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När ett stort djur som en experimentell modell, en färdiga förlängning enhet kan användas, och det är lätt att få bra fixering och bedöma själva förlängning operationen och beloppet som förlängning. När en mus används som en experimentell modell, är det dock nödvändigt att utveckla vissa eller alla av utrustningen. Isefuku et al. och Tay et al. gjorde enheten och skapade en mus modell7,8. Carvahjo et al. antog en metod som omfattar fixering av en färdiga expansionsanordning (spåra distraktor: KLS Martin) med en ligatur tråd9. Vi kan också skapa en musmodell för använder befintliga produkter för förlängning enheter och utforma en metod för fixering. Detta tillvägagångssätt skulle göra det lätt att tillverka förlängning enheten, utföra förlängning och bedöma mängden förlängning. Dessutom förväntas att en tibial segmentell defekt modell kan skapas med hjälp av samma enhet. Dessutom längd av defekten kan justeras i steg om 0,2 mm och således enheten anses vara mångsidig.
I sådant experiment är det tekniskt svårt att trä nålen genom skenbenet. I synnerhet diametern av den distala delen av tibia är liten, och viss utbildning krävs för att passera två nålar. Om tillräckligt med ben inte noteras, är det nödvändigt att kontrollera huruvida bra fixering erhålls. För att få bra fixering, kan det vara bättre att passera nålar i vinkel och med en lucka som är så bred som möjligt mellan de nålar7,8. Dessutom, eftersom graden av healing och histologin under läkningen skulle förändras enligt metoden för osteotomi, är det nödvändigt att utföra proceduren på ett visst sätt.
Storleken på det experimentella djuren kan betraktas som en begränsande faktor för detta experiment. Det finns inga problem när musen är stort; dock om det är för liten, eventuellt operation själv inte. Tidigare vi använde 4 veckor gamla möss och kunde utföra experiment utan någon problem10. När det gäller utvärderingsperioden, kunde förlängning enheter installeras utan problem fram till 42 dagar efter styckning benet. Som ytterligare observationer inte gjordes, är ytterligare forskning dock nödvändigt i framtiden. Förekomsten av komplikationer kan vara ett problem när framåt experiment. Fraktur under operation kan uppstå hos ungefär 1 av 30 möss. Likaså kan postoperativ sårinfektion uppstå hos ungefär 1 av 30 möss.
Sammanfattningsvis, presenterade vi en tibial musmodell utvecklas med hjälp av en skräddarsydd distraktor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ms. Makiko Kato för att ge uppmuntran att slutföra denna studie. Vi tackar också den uppdelning av försöksdjur och medicinsk forskning teknik, Nagoya University Graduate School of Medicine, som inkvartering för möss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
