Summary
Biz özel yapım bir şıkkı kullanılarak geliştirilmiş bir fare tibial oyalama osteogenesis modeli mevcut. Bir fare kullanımı bir analizi hedef olarak araştırma ilerlemek için avantajlıdır.
Abstract
Oyalama osteogenesis () iskelet doku rejenerasyonu hücre transplantasyonu olmadan içerir bir cerrahi işlemdir. Bir modeli aşağıdaki üç aşamadan oluşur: gecikme süresi aşamasından sonra osteotomi ve yerleşimini dış şıkkı; yavaş yavaş ve sürekli olarak ayrılmış kemik uçları neyin deli oyalama faz; ve konsolidasyon faz. Özel yapım bu şıkkı yapmak için kullanılan iki eksik akrilik reçine yüzük ve bir genişleme vida oluşur. İşlemi bir kalıp silikon izlenim malzeme ile yapım ve ısmarlama şık oluşturma başlatıldı. Diş reçine silikon izlenim malzemeden yapılmış kalıp dökülür ve ısmarlama şıkkı için gerekli eksik reçine halkaları oluşturmak için polimerize için izin verildi. Bu halkalar şeffaf reçine kullanarak bir genişleme vida ile tespit edildi. Bu yaklaşım ile oluşturulan özel şık fareler tibia bağlıydı. Tibia uzağından, 25 G iğneler bir çift kullanarak aygıt 27 G iğneler bir çift klemple, tespit edildi ve akrilik reçine. 5 gün sonra gecikme süresi, oyalama, 0.2 mm/12 h bir oranda başlatıldı. Uzatma 3.2 mm toplam bir boşluk ortaya çıkan 8 gün boyunca devam edildi. Fareler 4 hafta oyalama sonra kurban edildi. Oyalama boşluğu kemik oluşumu radyografi ve histoloji kullanılarak doğrulandı.
Introduction
Oyalama osteogenesis () bir iskelet bozuklukları, ekstremite uzunluk tutarsızlıklar, kemik defektleri ve uzuv deformiteleri1gibi çeşitli için kurulan tedavi yöntemidir. Bu benzersiz tedavi stratejisi "Ilizarov tarafından önerilen gerginlik stres prensibi" temel alır. Olgun kemik kurulan2olana Yöntem birkaç gün gecikme süresi, birkaç hafta için etkin oyalama ve konsolidasyon için birkaç ay için gerektirir.
Yerel hipoksik koşulları tıkanıklık nedeniyle kan akışı3,4 ve mekanik stimülasyon5,6 iyileşme sürecinde özellikle önemlidir. Hipoksi indüklenen angiogenez oksijen, besin, çözünür faktörler ve hücreleri yoluyla kan akışını yerel olarak doku onarımı için gerekli taşır. Uzatma işlemi tarafından mekanik stimülasyon mezenkimal kök hücre, kemik oluşumu, kalsifikasyon ve remodeling farklılaşma gibi biyolojik reaksiyonları neden olur. Seri tedavi sadece da yumuşak dokular, sinir, kas, kan damarları ve cilt dokular, kök hücre nakli için gerek kalmadan da dahil olmak üzere sert doku oluşumunu sağlar. Bu nedenle, bir modeli çeşitli dokularda yenilenme analiz etmek için mükemmel bir model olarak kabul edilir.
Tavşan ve köpek temel araştırma yapmak için en çok kullanılan hayvanlar vardır; Ancak, bu hayvanlar için birkaç analiz araçları mevcuttur. Daha ayrıntılı bir analiz bir fare modeli kullanımını kolaylaştırır. Nakavt fareler kullanarak deneyler için özellikle uygundur. Ancak, bir fare bir deneysel hayvan olarak kullanırken, bir uzantısı aygıt oluşturulmalıdır. Burada, biz mevcut bir fare tibial model özel yapım bir şık bir diş laboratuvar araç ve bir önceki çalışmada kullanılan tekniği kullanılarak oluşturulan kullanılarak geliştirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneylerin hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kuruluşumuzun tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Önce yordamı tüm aletleri sterilize.
1. özel şık oluşturmak için hazırlanması bir kalıp
- Parafin mumu (145 mm x 74 mm) bir levha ile şık, Evans balmumu carver kullanarak bir parçası olan iki eksik yüzük (dış çap, 20 mm; iç çapı, 10 mm), olun.
- 4 aynı adet olun. Gaz yakıcı ile ısıtılan bir balmumu spatula kullanın. Dört yüzük bir kalınlık, 5 mm. sağlamak alan genişleme vida ve iğne, 8 x 2 mm ve 5 mm x 2 mm sırasıyla Evans balmumu carver (Şekil 1A, 1B) ile yığın.
- Balmumu desen silikon izlenim malzeme embed ve reçine halkaları (Şekil 1C) için bir kalıp oluşturun.
- Silikon kür sonra izlenim malzemeleri (yaklaşık 5 dk oda sıcaklığında), balmumu desen temizleyin.
2. özel şık imalatı
- Vazelin ince ve eşit olarak silikon kalıp için geçerlidir. 3 g polimerizasyon diş reçine mix ve hemen silikon kalıp içine dökün. 5 min için oda sıcaklığında (RT) ayarlayın.
- Polimerli reçine yüzük kalıptan çıkarın ve bir karbür bar ve burr (yaklaşık 1 dakika) kaldırmak için bir diş micromotor Lehçe. İki reçine yüzük her ısmarlama şıkkı için gereklidir.
- Reçine halkalar (Şekil 1D) gerekli sayıda oluşturmak için yordamı yineleyin.
- Yaklaşık 2 mm reçine Yüzüklerin yardımcı programı balmumu ile düzeltmek için ve tamamen şeffaf reçine ile genişleme vida dışına güvenli bir boşluk bırakın. 5 min için reçine RT. ayarla Polimerizasyon tamamlandıktan sonra genişleme vida düğmesi (Şekil 1E) kaldırın.
3. cerrahi Protokolü
- 8 haftalık erkek fare kullanın.
- Anestezi mayi iğne medetomidine hidroklorid vasıl 0.3 mg/g, 4 mg/kg midazolam ve butorphanol tartarat 5 mg/kg vücut ağırlığı ile neden.
- Dikkatle tıraş ve cerrahi alan % 10 iyot solüsyonu ile dezenfekte edip sonra % 0.5 lidokain hidroklorür, sağ alt ekstremite yönetmek.
- Bacak No. 15 neşter ile daha düşük bir boyuna cilt kesi (yaklaşık 15 mm uzunluğunda) sağ olun. Açık açık tüm kapaklarini kaldırmak değil dikkat çekici temel kasları ayırın. Fibula kolayca ulaşmak için dışarıdan yaklaşım. Fibula makasla kesme.
- Ayak bileği dar ince steril forseps ile kavramak ve steril 27 G iğne topuk yaklaşık 5 mm'den kemik bir delik açmak için kullanın. İğne deri, kemik ve cilt bu sırayla nüfuz. İğne nüfuz eder, böylece iğne 15 mm ipucu ve kök nipper ile kesilmiş.
- Aynı şekilde, yaklaşık 2-3 mm proksimal başka bir delik açın. Ayak bileği tutun ve diz altında iki 25 G iğneler aynı şekilde geçirin. Sonra iğneler nüfuz, ipuçları ve kökleri nipper (Şekil 1F) ile kesti.
- Öyle ki uzantısı yönüne paralel ısmarlama şıkkı yerleştirin. İğneler ve aygıt Aygıt oluklar doldurmak için yeterli polimerizasyon diş reçine ile düzeltmek. Polimerizasyon (yaklaşık 5 dk) tamamlamak bekleyin (Şekil 1G).
- Çevre dokular zarar vermemeye dikkat et. Diaphysis tuzlu çözüm (1-2 mL) uygulanırken bir çok ince kesme diski kullanarak Tibia orta kesim.
- 4-0 naylon dikiş yarayla kapatın.
- Buprenorfin (0.1 mg/kg), subkutan enjeksiyon hemen ameliyat sonrası analjezi için ver. Buprenorfin ameliyat sonrası gün boyunca 7 ve gerektiği bundan sonra her 12 h devam.
4. oyalama Protokolü
Not: Gecikme süresi ve oyalama oranı üzerinde çeşitli raporlar vardır, ancak temsilcisi iletişim kuralları burada gösterilir.
- 5 gün sonra gecikme süresi, oyalama, 0.2 mm/12 h bir hızda başlatın. Uzantıları, hızlı büyümenin vida bağlı PIN kullanmak. Uzantısı vida (Şekil 1E) bağlı sarı ok yönünde hareket ettirmek toplu iğne.
- Anestezi sırasında uzantısı gerekli değildir. Küçük parmak ve palm ile kuyruk tutun ve işaret parmağı ve başparmak ile uzantısı aygıtını düzelt.
- Uzantısı (1/4 dönüş için 0.2 mm) gerçekleştirin. 3.2 mm toplam bir boşluk neden olur 8 gün boyunca uzatma devam edin.
5. analiz
- Radyografi Analizi: uzantısı tamamlanmasından sonra genel anestezi altında bilgisayarlı tomografi ile kemik rejenerasyon %2.0 isoflurane kullanarak değerlendirmek.
Not: Bakım Uzantısı aygıt konumu ile ilgili olarak alınması halinde, bunu bile bağlı aygıt ile basit radyografi ile değerlendirmek mümkün. - Histolojik Analizi: aparatı dikkatli bir şekilde çıkarın çok kırık oyalama sitesi örnekleme sırasında neden olarak değil. Örnek % 10 tarafsız tampon formalin oda sıcaklığında 24 h için fix. Morse'un çözüm (% 10 sodyum sitrat, %20 formik asit), gecede 4 ° C'de decalcify
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A ve 1B eksik halkalar (dış çapı, 20 mm iç çapı, 10 mm; kalınlığı, 5 mm) parafin ile mevcut. İki balmumu desen silikon izlenim malzeme içinde gömülü ve bir kalıp reçine halkaları (Şekil 1C) için kuruldu. Polimerli reçine hemen bu kalıp içine dökülür ve reçine halkalar (Şekil 1D) elde edilmiştir. Özel yapım bir şıkkı iki reçine yüzük ve bir genişleme vida (Şekil 1E) birleştiren oluşturuldu. Resim 2 A modelindeki oyalama sonra 4 hafta tipik radyografi bulguları sunar. Yeni oluşan kemik oyalama sitesinde gözlendi. Şekil 2B Hematoksilen ve eozin boyama sonuçları sunar. Yeni oluşan kemik köprü gözlendi ve yeni oluşan kemik kolayca yerel kemiğinden ayırt. Bu deneyde kullanılan 5 farelerde ameliyat sonrası enfeksiyon yoksa intraoperatif kırılma oldu.
Resim 1 : Özel yapım şıkkı. (A, B) Yüzük ün yaklaşık boyutları aşağıdaki gibidir: dış çap, 20 mm; iç çapı 10 mm; kalınlığı 5 mm. Genişleme vida (beyaz ok ucu) ve iğne (siyah ok ucu) için alanlarda güvenli. (C) balmumu deseni gömülü silikon izlenim malzeme. (D) tamamlandı reçine yüzük. (E) iki reçine yüzük ve genişleme vida reçine ile güvenli. (F) dört iğneler tibia proksimal ve distal metaphysis yerleştirilir. (G) oyalama cihaz yerleştirilen fare bacak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Radyolojik ve histolojik bulgular. (A)Radiologically, yeni oluşan kemik gözlenen oyalama sonra 4 hafta. (B) histolojik olarak, gap dolu ile yeni oluşan kemik (ölçek çubuğu 500 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Büyük bir hayvanı deneysel bir model olarak kullanıldığında, bir hazır uzatma cihazı kullanılabilir ve iyi fiksasyonu elde edilir ve uzatma işlemi ve uzantısı miktarını değerlendirmek kolaydır. Ancak, bir fare deneysel bir model olarak kullanıldığında, bazı veya tüm ekipman geliştirmek gereklidir. Isefuku ve ark. ve Tay vd. cihazın yaptı ve bir fare modeli7,8yaratılmıştır. Carvahjo ve ark. kabul hazır genişleme aygıt fiksasyonu içeren bir Yöntem (şık izlemek: KLS Martin) bir bağ ile9tel. Biz de mevcut ürünler için uzantısı aygıt kullanarak ve fiksasyon yöntemi oluşturulması bir fare modeli oluşturabilir. Bu yaklaşımın uzantısı aygıt üretmek, uzantısı gerçekleştirmek ve uzantısı miktarını değerlendirmek kolay yapar. Ayrıca, tibial segmental kusur manken aynı aygıtı kullanarak oluşturulmuş olabilir bekleniyor. Ayrıca, kusur uzunluğu 0.2 mm adımlarla ayarlanabilir ve bu nedenle cihazın çok yönlü olarak kabul edilir.
Böyle bir deneme tibia iğne iplik Teknik olarak zordur. Özellikle, tibia distal parçası çapı küçük olduğunu ve bazı eğitim iki iğne geçmek için gereklidir. Yeterli kemik kaydetti değil, iyi fiksasyonu elde olup olmadığını kontrol etmek gereklidir. İyi fiksasyonu elde etmek için belirli bir açıyla ve mümkün olduğu kadar geniş bir boşluk ile arasında iğne7,8iğne geçmek daha iyi olabilir. Ayrıca, iyileşme oranı ve şifa sırasında Histoloji osteotomi yöntemine göre değiştirir gibi belirli bir şekilde yordamı gerçekleştirmek gereklidir.
Deneysel hayvan boyutunu bu deney kısıtlayıcı bir faktör kabul edilebilir. Fare büyük olduğunda herhangi bir sorun vardır; çok küçük ise, ancak, ameliyat kendisi mümkün olmayabilir. Daha önce biz 4-hafta-yaşlı fareler kullanılan ve deneyler10herhangi bir sorun olmadan yapmak mümkün olduğunu. Değerlendirme süresi ile ilgili olarak uzantısı cihazlar sorunsuz kemik kesilmesinden sonra 42 gün öncesine kadar yüklü. Daha fazla gözlem yapılan değil gibi ancak, ek araştırma içinde belgili tanımlık gelecek gereklidir. Komplikasyonlar oluşumunu deneyler ilerleyen bir sorun olabilir. Kırık ameliyat sırasında yaklaşık 1 30 out of fareler ortaya çıkabilir. Benzer şekilde, ameliyat sonrası yara enfeksiyonu yaklaşık 1 30 out of fareler ortaya çıkabilir.
Sonuç olarak, özel yapım bir şıkkı kullanılarak geliştirilmiş fare tibial modeli sundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Bayan Makiko Kato bu çalışma tamamlamak için cesaret verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca deneysel hayvan bölümü ve tıbbi araştırma mühendislik, Nagoya Üniversitesi Lisansüstü Tıp Fakültesi, fareler konut için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
