Summary
ويقدم هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة عزل والتعرف على والتحديد الكمي للخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب الفئران أثناء حالة ثابتة أو التهاب. البروتوكول يجمع الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها مزيد من التدفق الخلوي.
Abstract
جهاز المناعة عنصر أساسي لصحة القلب. عضلة القلب موطن لعدد سكان الأغنياء من مجموعات فرعية مختلفة من الخلية المناعية مع التقسيم الوظيفي أثناء حالة ثابتة وأشكال مختلفة من التهاب السواء. حتى وقت قريب، دراسة الخلايا المناعية في القلب المطلوب استخدام الفحص المجهري أو تحديد بروتوكولات المتقدمة سوء الهضم، التي قدمت ما يكفي حساسية أثناء التهاب حاد ولكن لم يتمكنوا من ثقة الصغيرة – لكن الرئيسية – السكان الخلايا أثناء حالة ثابتة. هنا، نحن نناقش أسلوب بسيط الجمع الانزيمية (كولاجيناز والبروتين السكري المثبط الدناز) والهضم الميكانيكي من قلوب مورين يسبقه الإدارة داخل الأوعية المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة التفريق بين الصغيرة ولكن لا مفر منه خلية داخل الأوعية الملوثات. ينشئ هذا الأسلوب تعليق خلايا قابلة للحياة المعزولة التي يمكن تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد الهوية، فينوتيبينج والقياس الكمي، أو تنقية كذلك مع الأسفار تنشيط الخلية فرز أو فصل حبة المغناطيسي النسخي دراسات التحليل أو في المختبر . وندرج مثال لتحليل تدفق خطوة بخطوة سيتوميتريك التفريق بين مفتاح بلعم والسكان الخلايا الجذعية للقلب. لتجربة حجم متوسط (10 قلوب) يتطلب انتهاء الإجراء ح 2 – 3.
Introduction
أشكال مختلفة من احتشاء عضلة القلب من الإجهاد أو الإصابة، بما في ذلك الدماغية (ضخه الاسكيمية أو احتشاء عضلة القلب) وغير الدماغية (ارتفاع ضغط الدم أو التهاب العضلة القلبية)، تشجيع تعيين الخلايا الملتهبة مع الترميمي والحماية، لكن أيضا الخصائص المسببة للأمراض. أقرب 1891، رومبيرغ أول وصف وجود تتسرب الخلوية في عضلة القلب للمرضى المصابين ب التيفوس والحمى القرمزية1. بيد أن الدراسة التفصيلية للخلايا المناعية القلب يتطلب تطوير تقنيات أكثر تطورا إيمونوفينوتيبينج. نتيجة لذلك، إلا في الآونة الأخيرة قد بدأنا على فهم أن عدد سكان متنوعة من الخلايا المناعية مع أدوار الصيانة الضرورية أثناء حالة ثابتة يتواجد داخل عضلة القلب.
وقد علم الأنسجة، ولا يزال، الأسلوب الأكثر شيوعاً لتوصيف الخلايا المناعية القلب أثناء التهاب. ومع ذلك، حين علم الأنسجة يمثل أداة قيمة لتشخيص، استخدامه في دراسة الخلايا المناعية القلب قد القيود الهامة. تمثل نسبة ضئيلة جداً من مجموع الخلايا الخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب وهي أكثر أو أقل موزعة في مساحة كبيرة نسبيا. وبالمثل، تظهر عدة أشكال من التهاب القلب، مثل فيروسي التهاب العضلة القلبية، أنماط التنسيق من التهاب. وهذا يعني أن التحليل الدقيق للنظام المناعي للقلب غالباً ما تتطلب درجة أعلى من أخذ عينات نسيجية، زيادة التكلفة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك، يوفر علم الأنسجة كمية محدودة جداً من المعلومات يمكن استخدامها في تحديد الخلية (مثل عدد المعلمات). مع عدد متزايد من أي وقت مضى من مجموعات فرعية الخلية التي تتطلب استخدام عدة علامات التعبير (بما في ذلك علامات السطحية أو عوامل النسخ أو جزيئات يفرزها)، التدفق الخلوي أثبتت أنها أقوى أداة إيمونوفينوتيبينج، سبب منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية.
باستخدام تقنيات إيمونوفينوتيبينج يتوقف عن كثب على تطوير كفاءة الهضم البروتوكولات التي تسمح بتحليل خلايا مفردة لإعداد كبيرة من الخلايا. وضع بروتوكولات شاملة لاستخراج خلية فتح نافذة جديدة من الفرص في دراسة علم المناعة القلب. من خلال المزيج من الهضم، والتدفق الخلوي وترانسكريبتوميكس، كان السكان الرئيسية في الضامة، والخلايا الجذعية الذين يقيمون في القلب تتسم2،3. السكان الأكثر وفرة من الخلايا المناعية القلب أثناء حالة ثابتة هي CD64+ميرتك+ الضامة، التي يمكن تقسيمها استناداً إلى التعبير عنها من CCR2 أو CD11c2. CCR2+ الضامة تنبع من هيماتوبويسيس نخاع العظام الكبار، بينما الأغلبية من CCR2 الضامة– ، التي يمكن أن تعبر عن مستويات عالية أو منخفضة من MHC-ثانيا، هم أساسا من أصل قبل الولادة. الضامة المهام الرئيسية مثل إصلاح4 وإزالة الحطام5 أثناء الإصابة أو دعم الربط الكهربائي6 في حالة مستقرة. خلال أشكال مختلفة من التهاب يحدث تدفقا هاما من Ly6Cمرحبا MHC-ثانيالو CD64int وحيدات، التي تفرق في وقت لاحق في Ly6Cمرحبا CCR2+ الضامة2،7 . عدد سكانها الخلايا المقيمين في عضلة القلب الأشخاص الأصحاء أصغر بكثير، ولكن المهم، يتكون من الخلايا الجذعية8،9. واتسمت مؤخرا المجموعات الرئيسية اثنين من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية القلب (المؤلفان): cDC1 (CD103+ وحدات تحكم المجال Dc) و cDC2 (CD11b+ وحدات تحكم المجال Dc). وحدات تحكم المجال Dc تلعب أدواراً هامة في الدفاع ضد العدوى8 ولكن يمكن أيضا أن تعزز المتمتعة بالحكم الذاتي-الإصابة أثناء التهاب، لا سيما أثناء احتشاء عضلة القلب9.
وهنا يصف لنا طريقة بسيطة لعزل الخلايا المناعية القلب قابلة للاستمرار من الماوس عضلة القلب. الأسلوب يجمع بين الهضم الأنزيمي والميكانيكية مع خلية-مصفاة ترشيح بغية الحصول على تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها، أو كذلك تنقيته، التدفق الخلوي الفرز أو تخصيب حبة المغناطيسية. تتطلب قياسات دقيقة لخلايا عضلة القلب اكسترافاسكولار القلب نضح من أجل إزالة الملوثات المحتملة من مجرى الدم ميكروفاسكولاتوري القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم خطوة اختيارية لوسم منتثر داخل الأوعية للخلايا المناعية التي يمكن استخدامها لزيادة التفرقة بين خلايا عضلة القلب من الملوثات داخل الأوعية، على أساس بروتوكول et al. البندقية10. وأخيراً، نقدم تحليل تدفق أساسية الخلوي لتحديد الفئات السكانية الفرعية بلعم ومركز السيطرة على الأمراض الرئيسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تم استعراض هذا البروتوكول والتي أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان" في "الشبكة الصحية جامعة" (تورنتو، كندا)، وامتثالا "المجلس الكندي للعناية بالحيوان".
1. إعداد المخزن المؤقت
- إعداد المخزن المؤقت لسداسي البروم ثنائي الفينيل (موازنة الملح الحل (حبس هانك)، مصل بقرى الحرارة 2% معطل، ألبومين المصل البقري 0.2%). قم بإضافة 10 مل حرارة إبطال ز 1 من ألبومين المصل البقري إلى 500 مل هبس والمصل البقري. تصفية تعقيم من خلال فلتر 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إبطال الحرارة 2% مصل بقرى 1 ملم حمض الإيثيلين (يدتا، pH 8.0)). إضافة الحرارة 10 مل إبطال المصل البقري و 1 مل من 0.5 م أدتا إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية تعقيم من خلال فلتر 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الحلول عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
2-وضع العلامات لتعميم الكريات البيضاء
- أسيبتيكالي إعداد الماوس المضادة حقن CD45 مع 1 ميكروغرام من جسم مخفف في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) لوحدة تخزين نهائي حقن 200 ميليلتر/الماوس. تحميل وحدة التخزين في محقن الأنسولين ز 28.5 والابتعاد عن الضوء.
ملاحظة: استخدام اثنين من الأجسام المضادة مختلفة تسمى fluorochrome المضادة-CD45 أجل منتثر داخل الأوعية (الملون من خلال الإدارة رابعا) التفريق بين من تلطيخ intracardiac (ملون بعد الهضم؛ راجع الخطوة 4). -
قبل الحارة الفئران (8-12 أسابيع من العمر) وذلك بتعريض الذيل إلى مصباح أحمر حرارة لمدة 5 دقائق.
تنبيه: لا أسخن الحيوان. يبقى المصباح على مسافة آمنة (> 30 سم).- كبح جماح هذا الحيوان في موقف القصية باستخدام جهاز مناسب. فضح واستقرار الذيل باليد غير المهيمنة بشل حركة قاعدة الذيل مع الفهرس والإصبع الأوسط والمنطقة منتصف القاصي الذيل مع الإبهام والبنصر.
تنبيه: لا تنطبق كثيرا قوة في طرف الذيل كما يمكن سحب الجلد. أدخل الإبرة مع المجسم مشطوف الحواف التي تواجه في هذا السياق. تبقى الإبرة موازية لهذا السياق في جميع الأوقات كما أنه من السهل ثقب في الوريد.
ملاحظة: قد تحدث الدم إدخال المحاقن وهو علامة على حقنه جيدة. يمكن الانحناء الإبرة بزاوية 90 درجة لتيسير الإدارة رابعا. تأكيد مع مكتب السلامة الخاصة بك كما الإبر الانحناء قد تمثل خطرا. - ضخ 200 ميليلتر عن طريق الوريد في الوريد الذيل. السائل ينبغي أن تتدفق بسهولة ومؤقتا واضحة في السياق.
تنبيه: لا قوة السائل في إذا تم الوفاء بالمقاومة. وهذا دليل على فقدان الإبرة. - السماح بجسم مضاد لتعميم لمدة 5 دقائق قبل يوثانيزينج إنسانية الماوس.
- كبح جماح هذا الحيوان في موقف القصية باستخدام جهاز مناسب. فضح واستقرار الذيل باليد غير المهيمنة بشل حركة قاعدة الذيل مع الفهرس والإصبع الأوسط والمنطقة منتصف القاصي الذيل مع الإبهام والبنصر.
3-قلب عزل والهضم
-
Euthanize CO2 باستخدام الماوس أو بواسطة الإجراء القتل الرحيم المقبولة من الناحية الأخرى.
- ضع الماوس في الدائرة2 CO CO2 القتل الرحيم، وتعيين معدل التعبئة إلى 20 في المائة حجم الدائرة للدقيقة الواحدة (أي، إذا كانت الدائرة هي 10 لتر، التعبئة في 2 لتر في الدقيقة). تشغيل للماوس 2 دقيقة ومراقبة حتى توقف التنفس.
- إيقاف CO2 واترك الماوس للحد أدنى 1-2 إضافية تضمن توقف التنفس قبل فتح الدائرة وأداء قرصه تو لتأكيد الماوس ميت قبل الشروع في عملية الماوس.
- رذاذ الماوس مع الإيثانول 70%. رفع الجلد في البطن وتشريح الماوس بالقطع على طول خط الوسط البطني بداية على مستوى الوركين حتى القص. فتح البطن ونقل الكبد لفضح الحجاب الحاجز.
-
قطع الحجاب الحاجز، ثم الأضلاع على جانبي خط الوسط، مع الحرص على تجنب ثقب في الرئتين والقلب.
- فضح القلب تقشير مرة أخرى على أضلاعه، ثم قطع الأول تليها الاذينين الأيسر الاذينين الأيمن.
تنبيه: كن حذراً عند قطع الاذينين، ضمان وأصيب لا الشرايين أو الأوردة، كهذا يمكن أن يقلل من كفاءة التنظيف الدم الوارد في الأجهزة. - نتخلل القلب مع 15 – 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة استخدام المحاقن 60 مل مزودة بإبرة ز 21 وبرنامج تلفزيوني الباردة. بلطف فهم قاعدة القلب بالملقط وأدخل الإبرة في البطين الأيسر قرب القمة. كرر الإجراء في البطين الأيمن. النتائج حقن مناسبة في الأبيض الرئتين والكبد شاحبة.
ملاحظة: ينبغي إجراء نضح خلال 5 دقائق بعد القتل الرحيم تفاديا تخثر الدم، التي يمكن أن تلوث أجهزة الاهتمام بتعميم خلايا.
- فضح القلب تقشير مرة أخرى على أضلاعه، ثم قطع الأول تليها الاذينين الأيسر الاذينين الأيمن.
-
اضغط قاعدة القلب بالملقط ولطف سحب القلب، ثم فصل القلب بقطع الشرايين الرئوية الرئيسية والاوردة والشريان الاورطي وكيس التامور.
- تنظيف القلب بعقد القلب بين الإبهام والأصابع الفهرس بلطف بمنشفة ورقية نظيفة خالية من الوبر وسحب قبالة الاذينين وبقايا الشرايين الرئيسية وعروق وأي ملوثات أخرى مع الملقط.
ملاحظة: تأكد من إزالة بأكملها الاذينين ولا أنسجة أخرى، مثل الرئة أو الأوعية الدموية، وموجودة كهذه الأنسجة الخاصة بهم الخلايا المناعية المقيم. الرئة خاصة يبلغ عدد سكانها كبير خلايا المناعية التي يمكن أن تخفي السكان أصغر من تلك التي تدخل عضلة القلب.
- تنظيف القلب بعقد القلب بين الإبهام والأصابع الفهرس بلطف بمنشفة ورقية نظيفة خالية من الوبر وسحب قبالة الاذينين وبقايا الشرايين الرئيسية وعروق وأي ملوثات أخرى مع الملقط.
-
مكان القلب في طبق بلاستيك 5 سم مع 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
- تخطر على قلب استخدام مقص تشريح منحنية حتى هناك لا أجزاء مرئية ولها وجود اتساق سلس.
ملاحظة: محاولة لإبقاء القلب في منطقة وارد في الطبق أثناء تقطيع للتقليل من فقدان الأنسجة. - نقل الأنسجة ثيتريتوراتيدهيرت باستخدام الملقط منحنى في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع النسر المتوسط تعديل (دميم في 800 ميليلتر الباردة دولبيكو).
- تخطر على قلب استخدام مقص تشريح منحنية حتى هناك لا أجزاء مرئية ولها وجود اتساق سلس.
-
إضافة 450 U/mL أوفكولاجيناسي الأول، 60 يو/مليلتر من البروتين السكري المثبط نوع أنا-S و 60 يو/مليلتر من الدناز-الأول لكل عينة.
- احتضان عينات في 37 درجة مئوية في شاكر هزاز 50 لفة في الدقيقة لمدة 45 – 60 دقيقة.
-
بعد الهضم، بإيجاز دوامة عينات (20 ق) ثم ضع فورا على الجليد الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية.
- استخدام بيبيتور 1 مل، "الماصة؛" عينات صعودا ونزولاً حتى عينات الأنسجة تكون متجانسة ولا تسد نصيحة ماصة.
ملاحظة: تحديد عدد محدد من المرات "الماصة؛" قد يزيد من إمكانية تكرار نتائج. إذا لم يتم هضمها القلوب على الوجه الأمثل، قد يعرقل قطعة من عضلة القلب الماصة. بلطف طحن نصيحة ماصة ضد أنبوب ميكروسينتريفوجي سيساعد على تجانسه قطعة أكبر من الأنسجة.
- استخدام بيبيتور 1 مل، "الماصة؛" عينات صعودا ونزولاً حتى عينات الأنسجة تكون متجانسة ولا تسد نصيحة ماصة.
-
قبل الرطب 40 ميكرومتر خلية مصفاة توضع في أنبوب 50 مل مخروطية مع 1 مل من البرد سداسي البروم ثنائي الفينيل.
- إضافة نموذج المتجانس للتصفية وتغسل من خلال بصب 12 – 14 مل الباردة سداسي البروم ثنائي الفينيل ببطء.
- نقل العينات التي تمت تصفيتها إلى أنبوب مخروطي توسم 15 مل والحفاظ على 4 درجة مئوية.
-
عينات من أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح قبالة المادة طافية.
- خلايا الدم الحمراء بإضافة 1 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت لكل عينة. ريسوسبيند عينات من فورتيكسينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- وبمجرد الانتهاء من تفسخ، إضافة 5 – 8 مل من متوازن الملح الحل (حبس البرد هانك) لوقف انحلال الدم.
- الطرد المركزي عينات في غفور 400 x 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح قبالة المادة طافية.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي توسم 1.5 مل.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا ليصل إلى 2 حاء مع العينات المخزنة في 4 درجات مئوية.
4-التدفق الخلوي تلطيخ والتحليل
-
عينات من أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- للحد من جسم غير محدد ملزم، تضعف من 1: 100 المضادة-CD16/CD32 و "مانع الوحيدات" (01:20) (انظر الجدول للمواد) في حساب 50 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إعداد حصر تمييع (1: 250 لكل جسم) جسم 50 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة.
ملاحظة: يمكن تضمين صبغة بقاء في جسم كوكتيل بغية استبعاد الخلايا الميتة. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون الاستبعاد صغيرة الحجم بتحليل تدفق المستخدمة (الشكل 1ج ود). - دون الغسيل، إضافة 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي الأجسام المضادة لكل عينة وخلط.
- احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- إضافة 600 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة لغسل والطرد المركزي عينات من 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح قبالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية. الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية في الظلام.
ملاحظة: تتطلب بعض الأصباغ البقاء، مثل DAPI، تلطيخ داخل 10 دقيقة قبل تشغيل التدفق الخلوي. - تحليل من خلال التدفق الخلوي (انظر الأرقام 1 و 2) ضمن ح 3 المقبل. إذا كان وقت أطول التثبيت المطلوبة وقصيرة الأجل باستخدام بارافورمالدهيد تركيز منخفض (0.5 – 1% في برنامج تلفزيوني) يوصي بالحفاظ على تلطيخ.
ملاحظة: من المستحسن جداً لتصفية عينات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر قبل بدء التدفق الخلوي التحليل منعا لعرقلة فلويديكس سيتوميتير تدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حتى الآن، لا توجد طريقة جيدة قد صمم لعزل الخلايا المناعية من مكونات القلب خلية أخرى، مثل كارديوميوسيتيس. ومن ثم يتطلب تحليلاً لتعليق خلية مفردة القلب بالتدفق الخلوي النابضة مسبقاً مع CD45 تحديد السكان الخلايا المناعية، وتليها خلية مفردة، وصغر حجم الاستبعاد النابضة (الشكل 1أ). بدلاً من ذلك، يمكن أن يؤديها تلطيخ صلاحية استبعاد الخلايا الميتة. صغر حجم الاستبعاد وصلاحية صبغ تلطيخ تمثل أساليب يعادل تقريبا استبعاد الخلايا الميتة (الشكل 1ب ود 1). ينصح بالمضي قدما في جسم تلطيخ قريبا بعد إجراء عملية الهضم، ودائما بتعليق خلية في 4 درجات مئوية، كما قد تسوس صلاحية الخلايا. عادة ينتج هذا الإجراء حوالي 80 – 90% خلايا المناعية قابلة للحياة.
عضلة القلب منازل مستعمرة متنوعة للخلايا المناعية، كثير منها من لا يزال في انتظار تحديد وتوصيف. الضامة، اعتبرت CD64+ الخلايا، وهم السكان المناعية الرئيسية من القلب، وتمثل 60-70% من جميع الخلايا المناعية (الشكل 1جمن أعلى). غلة الهضم قلب مورين الكبار عن 3 – 5 × 104 الضامة، تبعاً لحجم القلب. ويمكن تقسيم الضامة القلب كذلك استناداً إلى التعبير عنها CD11c أو CCR2، ومستويات الثاني MHC2.
يتدنى مأمن القلب الأخرى التي تميزت أيضا بالخلايا الجذعية التقليدية. وحدات تحكم المجال Dc التقليدية هي CD64– الخلايا أن متوسط صريحة إلى مستويات عالية من MHC-ثانيا، ومستويات عالية من CD11c (الشكل 1 ج، أسفل). ويمكن تقسيم هذه الخلايا كذلك استناداً إلى التعبير عنها من8،CD103 أو CD11b9. وتمثل وحدات تحكم المجال Dc يتدنى القلب أصغر كثيرا مقارنة بالضامة. غلة الهضم قلب مورين الكبار بين 150 و 500 وحدات تحكم المجال Dc لكل مجموعة فرعية.
ضروري التروية للقلب مع برنامج تلفزيوني الباردة عند تحديد الخلية المناعية السكان داخل عضلة القلب. ومع ذلك، قد يزيد ناقصة التروية كميات الملوثات داخل الأوعية في العينات، مما يؤدي إلى تحيز الهامة التي يمكن أن تعتمد على التغيرات المحيطية (الدم) بدلاً من التغييرات في تتسرب القلب. في هذه الحالات، يمكن أن تعليمات إدارة منتثر داخل الأوعية الأجسام CD45 مكافحة المسمى فلوري، الذي تسمية كافة الخلايا المناعية المتداولة عن طريق الكلي وميكروفاسكولاتوري (الشكل 2ألف)، التفريق بين خلايا عضلة القلب من الملوثات داخل الأوعية. الشكل 2 ب يبين مثال قلب ناقص perfused التي هي 20% خلايا المناعية الملوثات داخل الأوعية. الأهم من ذلك، هذا المستوى من التلوث له تأثير يذكر على بلعم وتحليل العاصمة، حيث نادراً ما توجد هذه الخلايا في الدم (الشكل 2د).
يسمح استخدام التدفق الخلوي لتعليق خلية مفردة لعضلة القلب لدراسة الجمهرات الفرعية الصغيرة للقلب. على سبيل المثال، قد تبين نقص عامل النسخ BATF3 لمنع تطوير ناضجة CD103+ وحدات تحكم المجال Dc في عدة أنسجة11. ومن أجل دراسة إذا كان هذا صحيحاً أيضا في حالة عضلة القلب، حللت تعليق خلية واحدة فقط من خلايا القلب من 8 – 15 أسبوع من العمر BATF3-تعاني من نقص أو ليتيرماتيس عنصر التحكم (في الخلفية C57BL/6) استخدام التدفق الخلوي. نظراً لقلة عدد السكان وعدد العلامات اللازمة للتفريق بين المجموعات DC، علم الأنسجة يمكن أن لا قدمت ما يكفي من القوة لتحليل للتوصل إلى إجابة نهائية. ومع ذلك، باستخدام تحليل التدفق الخلوي مقارنة الخلايا المناعية لعضلة القلب من البرية من نوع مقابل Batf3--/-- فئران، نقص CD103+ وحدات تحكم المجال Dc يمكن تأكيدها في الأخير (الشكل 3أ وب). وباﻹضافة إلى ذلك، لاحظنا أن عوز BATF3 لم تغير إلى حد كبير تكوين السكان القلب الأخرى (الشكل 3جيم ودال). هذه النتائج تمثل درجة الحساسية التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا الأسلوب مجتمعة من الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتحقيق تعليق خلية مفردة.
الشكل 1 : النابضة استراتيجية الضامة القلب ووحدات تحكم المجال Dc- قلوب معزولة من الفئران C57BL/6 تم هضمها كما هو موضح، وتعليق خلية مفردة تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي. (أ) Gating CD45 + القميص يعيش خلايا القلب. استخدام CD45 وضع العلامات لتحديد الخلايا المناعية من هوموجيناتي القلب وحيد الخلية، التي تتضمن مستويات عالية جداً من الخلايا المناعية غير (أي، كارديوميوسيتيس، وخلايا بطانية والليفية). استبعاد دوبليتس عن طريق مقارنة مقابل ح ال SSC SSC-A متبوعاً بمقابل منتدى التعاون الأمني-ح منتدى التعاون الأمني-ألف. ملاحظة: أي مقارنة أخرى بين SSC-أ وال SSC-ح و SSC-ث أو منتدى التعاون الأمني-أ، منتدى التعاون الأمني-ح ومنتدى التعاون الأمني-ث مفيدة كذلك. يمكن أن يؤديها مجموعة خلايا الحية باستثناء خلايا صغيرة جداً (بوابة مقابل منتدى التعاون الأمني-ح ح ال SSC). (ب) مقارنة بين الخلية ميتة استبعاد استخدام حجم مقابل بقاء تلطيخ (DAPI). (ج) استراتيجية لتحديد الضامة القلب النابضة (CD11b+ CD64+ الخلايا) ووحدات تحكم المجال Dc (CD64– الثاني MHCمرحبا CD11c+). ويمكن تصنيف الضامة القلب كذلك استناداً إلى التعبير عن MHC والثانية ويمكن تقسيم CD11c. "القلب وحدات تحكم المجال Dc" يستند إلى التعبير عنها من CD103 أو CD11b. (د) قطع تمثيلية DAPI + الخلايا الميتة داخل بلعم والعاصمة المقصورات بعد استبعاد صغيرة الحجم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : وسم منتثر داخل الأوعية خلايا الملوثات. معاملة المقارنة (A) وضع العلامات داخل الأوعية CD45 العَدلات الدم و Ly6Cمرحبا وحيدات في الأجسام المضادة-CD45 (أحمر) أو غير معاملة الفئران (أزرق). (ب) تحديد الملوثات داخل الأوعية في إعداد القلب بوضع العلامات CD45 منتثر داخل الأوعية. (ج) تدفق الممثل المؤامرات لخلايا عضلة القلب وداخل الأوعية. (د) قطع الممثل المسمى الخلايا داخل بلعم والمقصورات DC بعد مكافحة CD45 رابعا الإدارة. نلاحظ أن الضامة ووحدات تحكم المجال Dc اكسترافاسكولار حصرا. عادة ما تكون الملوثات داخل الأوعية اللمفاويات، وحيدات والعدلات2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التحديد الكمي للقلب الضامة ووحدات تحكم المجال Dc في الفئران التي تفتقر إلى BATF3- (أ) قطع تدفق الممثل القلب وحدات تحكم المجال Dc في Batf3+ + و Batf3--/-- الفئران. (ب) التحديد الكمي للقلب وحدات تحكم المجال Dc في Batf3+ + و Batf3--/-- الفئران. ملاحظة عدم وجود CD103+ وحدات تحكم المجال Dc في Batf3--/-- الفئران. (ج ود) القياس الكمي للقلب الضامة (وسط) في Batf3+ + و Batf3--/-- الفئران. أشرطة الخطأ تمثل الأحمر sem. رموز تمثل الحيوانات الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التهاب عضلة القلب، أو التهاب العضلة القلبية، ميزة لأمراض القلب والأوعية الدموية أكثر. بيد أن عضلة القلب لا يخلو من مكوناته المناعية في الحالات غير المرضية. أثناء حالة ثابتة، العديد من الخلايا المناعية الموجودة في عضلة القلب ولعب أدوار أساسية لصون وحماية. لم يكن وصف هؤلاء السكان متنوعة من الخلايا الممكنة دون أساليب مثل تلك الواردة في هذا البروتوكول.
مزيج من الهضم الميكانيكي والانزيميه لعضلة القلب تصاريح عزلة تعليق خلية واحدة فقط يمكن استخدامها بالاقتران مع أساليب أخرى للتحليل، مثل التدفق الخلوي أو إيمونوماجنيتيك حبة العزلة. ويجب مراعاة عدة اعتبارات تتعلق بالأسلوب الحالي. أولاً، جميع تحليلاتنا تشير إلى السكان داخل عضلة القلب؛ أننا نستبعد اتريا من تحليلنا أن هذه هي الأنسجة المتخصصة مع الخصوصيات الخاصة به. ثانيا، يتم التعبير عن كميات الإنزيمات تستخدم كوحدات النشاط للمساعدة في إنشاء ديجيستيونس باستخدام الإنزيمات من مصادر أخرى. ومع ذلك، الأمثل التخبريه النهائي تركيز الإنزيمات ووقت الهضم ينصح بشدة، كما يحد من الإنزيم يمكن أن تقلل إلى حد كبير العائد الخلية والكثير الهضم يمكن أن يؤثر بشدة على البقاء. ثالثا، خطوة اختيارية تشمل الإدارة داخل الأوعية من الأجسام المضادة الموسومة ينصح خاصة عند دراسة السكان غير المألوف في عضلة القلب طبيعية (مثل اللمفاويات، وحيدات أو العَدلات)2 ، أو في ظل الظروف عندما قد تتغير أرقام السكان في الدم (البيضاء، أو جرانولوسيتوسيس، أو يلاحظ) التي قد تعطي انطباعا خاطئا من التغييرات داخل عضلة القلب التي تحتاج إلى التأكد من استخدام هذا الأسلوب أو، بدلاً من ذلك، الفحص المجهري. ومع ذلك، هذه الخطوة لفائدة محدودة عند تحليل الضامة أو DCs ناضجة، كما نادراً ما توجد هذه الخلايا بكميات كبيرة في الدم (الشكل 2د). من المهم تحسين كمية الأجسام المضادة التي تديرها وفترة الحضانة قبل التضحية بالماوس، كالمدى الطويل الحضانة يمكن أن تسمح لبعض الأجسام المضادة نشرها في القلب، ولا سيما في عضلة القلب ملتهبة. أخيرا، من المهم جداً نكون دقيقين في عزلة القلب، والقضاء على بقايا الشرايين الرئيسية، وعروق واو أي أنسجة أخرى، مثل الرئة. يكون ارتفاع هذه الأنسجة الملوث جداً إعداد من الخلايا المناعية التي يمكن بسهولة قناع السكان الأصليين احتشاء عضلة القلب.
أنه من المهم جداً إجراء استبعاد الخلايا الميتة، سواء باستخدام الأصباغ البقاء أو من خلال استبعاد صغيرة الحجم أثناء تحليل التدفق الخلوي، الهضم (أو تلف الأنسجة في نماذج المرض) يمكن أن تسبب كمية كبيرة نسبيا من الخلايا الميتة. ونحن قد مقارنة كفاءة الخلية ميتة الاستبعاد من حيث الحجم واستخدام صلاحية تسمية (الشكل 1ب ود)، مما يدل على تكافؤها القريب. الأهم من ذلك، لا يمكن استخدام حجم الاستبعاد بعد التثبيت وبيرميبيليزيشن بهذا الإجراء يقلل كثيرا من حجم الخلية.
على الرغم من أن أوتوفلوريسسينسي نادراً ما مشكلة تحديد الضامة القلب باستخدام التدفق الخلوي، وهذا يمثل مشكلة أكثر أهمية عندما تحاول أن تميز التعبير عن بعض علامات، لا سيما مع فلوروتشروميس متحمس بالطاقة العالية ( موجات الضوء أقصر) (350 – 500 نانومتر). في هذه التجارب، فإنه ينصح بشدة استخدام عناصر تحكم ايستب وتجنب الليزر الأزرق والبنفسجي (fluorescein isothiocyanate، فيكوريثرين، المحيط الهادئ الأزرق/بريليانت البنفسجي 421) واستخدام فلوروتشروميس مع انبعاثات أعلاه 600 نانومتر، مثل اللوفيكوسيانين.
استخدام البروتوكولات كتلك المعروضة هنا أصبحت أكثر أهمية ككمية متزايدة من الأدب هو تحديد دور كثافة ونوع من التهاب في تقييم ووصف نتائج أمراض القلب والأوعية الدموية. هذا الأسلوب يسمح بمستويات أعلى من خصائص الخلية من الأنسجة. على سبيل المثال، استخدام تتبع النسب المسموح بها لتحديد مجموعات فرعية مختلفة أونتوجينيكالي من الضامة مع وظائف مختلفة المبرمجة على2. وبالمثل، يمكن استخدامها لدراسة ردود الخلية T أثناء التهاب عضلة القلب وجنبا إلى جنب مع السابقين فيفو التحفيز لدراسة الخلية تي الاستقطاب8هذا الأسلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (148808 و 148792)، وأيده سراج الدين القلب ومؤسسة السكتة الدماغية، ومنح الموظفين من مكتب مقاطعة أونتاريو، وآذار/مارس من الدايمات، تيد روجرز مركز بحوث القلب ومونك بيتر مركز القلب. XCC حاصل على "زمالة بانتنغ استوفوا". لوس أنجليس يحمل القلب والسكتة الدماغية/ريتشارد لور منحة جائزة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
