Summary
Este protocolo presenta un método sencillo y eficaz para aislar, identificar y cuantificar las células inmunes que reside en el miocardio de ratones durante el estado estacionario o inflamación. El protocolo combina la digestión enzimática y mecánica para la generación de una suspensión unicelular que puede ser más analizada por citometría de flujo.
Abstract
El sistema inmune es un componente esencial de un corazón sano. El miocardio es hogar de una rica población de subconjuntos diferentes de célula inmune con compartimentación funcional durante el estado estacionario y durante diferentes formas de la inflamación. Hasta hace poco, el estudio de las células inmunes en el corazón requiere el uso de la microscopía o protocolos de digestión mal desarrollados, que proporcionaron suficiente sensibilidad durante la inflamación severa pero no pudieron con confianza identifican pequeños — pero clave — las poblaciones de células durante el estado estacionario. Aquí, discutimos una combinación simple método enzimático (colagenasa, hialuronidasa y ADNasa) y digestión mecánica de corazones murino precedido por la administración intravascular de anticuerpos fluorescente etiquetado para diferenciar pequeños pero inevitable contaminantes intravascular de la célula. Este método genera una suspensión de células viables aisladas que pueden ser analizadas por citometría de flujo para identificación, phenotyping y cuantificación, o más purificado con clasificación celular activado por fluorescencia o la separación magnética de grano para transcripcionales estudios análisis o in vitro . Incluimos un ejemplo de un análisis de citometría de flujo de paso a paso para distinguir las poblaciones de células dendríticas del corazón y macrófagos clave. Para un experimento de tamaño medio (10 corazones) la terminación del procedimiento requiere de 2-3 h.
Introduction
Diferentes formas de estrés miocárdico o lesiones, incluyendo isquémico (isquemia reperfusión o infarto de miocardio) y no isquémica (hipertensión o miocarditis), promover el reclutamiento de células inflamatorias con reparadora y protectora, sino también propiedades patógenas. Ya en 1891, Romberg describió por primera vez la presencia de infiltrados celulares en el miocardio de pacientes infectados por el tifus y la fiebre escarlata1. Sin embargo, el estudio detallado de las células inmunes cardiacas requiere el desarrollo de las técnicas más avanzadas de immunophenotyping. En consecuencia, sólo recientemente hemos empezado a entender que una población diversa de células inmunes con papeles de mantenimiento esencial durante el estado estacionario en el miocardio.
La histología ha sido y sigue siendo, el método más común para caracterizar a las células inmunes cardiacas durante la inflamación. Sin embargo, mientras que la histología representa una valiosa herramienta de diagnóstico, su uso en el estudio de las células inmunes cardiacas tiene limitaciones importantes. Las células inmunes que reside en el miocardio representan una proporción muy pequeña de las células totales y son más o menos uniformemente distribuidas en un espacio proporcionalmente enorme. Del mismo modo, varias formas de inflamación cardiaca, como la miocarditis viral, muestran patrones focal de inflamación. Esto significa que un análisis minucioso del sistema inmune del corazón requieren a menudo grados más altos de toma de muestras histológicas, aumentando el costo para reducir el sesgo. Por otra parte, la histología proporciona una cantidad muy limitada de información útil en la identificación de la célula (por ejemplo, el número de parámetros). Con un creciente número de subconjuntos de la célula que requieren la utilización de múltiples marcadores de expresión (incluyendo marcadores de superficie, factores de transcripción o moléculas secretadas), citometría de flujo se ha consolidado como la herramienta más potente para Inmunofenotipificación, debido al bajo costo y alto rendimiento.
El uso de técnicas de immunophenotyping depende estrechamente en el desarrollo de protocolos de digestión eficiente que permitió para el análisis de células individuales de un gran número de células. El desarrollo de exhaustivos protocolos de extracción de la célula abre una nueva ventana de oportunidades en el estudio de la inmunología cardiaca. A través de la combinación de digestión, citometría de flujo y la transcriptómica, las principales poblaciones de macrófagos y células dendríticas que residen en el corazón han sido caracterizados2,3. La población más abundante de las células inmunes cardiacas durante el estado estacionario son CD64++ de MerTK los macrófagos, que pueden dividir más a fondo en su expresión de CCR2 o CD11c2base. CCR2+ macrófagos se originan de la hematopoyesis de la médula ósea adulta, mientras que la mayoría de CCR2 los macrófagos– , que pueden expresar altos o bajos niveles de MHC-II, son principalmente de origen prenatal. Los macrófagos realizan funciones claves como reparación4 y retiro de escombros5 lesiones o apoyando la conectividad eléctrica6 en estado estacionario. Durante diferentes formas de la inflamación se producen una importante afluencia de Ly6CHola MHC-IIlo CD64int monocitos, que más tarde se diferencian en Ly6CHola CCR2+ los macrófagos2,7 . Una población perceptiblemente más pequeña, pero importante, de las células que residen en el miocardio de los individuos sanos se compone de células dendríticas8,9. Los dos subconjuntos principales de DCs convencionales cardiacas (CDC) se han caracterizado recientemente: cDC1 (CD103+ DCs) y cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempeñan papeles importantes en la defensa contra la infección8 pero también pueden promover uno mismo-lesión durante la inflamación, particularmente durante el infarto de miocardio9.
Aquí, describimos un método simple para el aislamiento de las células inmunes cardíacas viables de miocardio de ratón. El método combina la digestión enzimática y mecánica con filtración celular-colador para obtener una suspensión unicelular que puede ser analizada, o más purificada, por clasificación de citometría de flujo o enriquecimiento de grano magnético. Las medidas exactas de células del miocardio extravasculares requieren perfusión cardiaca con el fin de eliminar los posibles contaminantes del torrente sanguíneo de la microcirculación cardiaca. Además, presentamos un paso opcional del etiquetado intravascular de células inmunes que pueden utilizarse para distinguir aún más células del miocardio de contaminantes intravasculares, basados en el Galkina et al protocolo10. Por último, presentamos un análisis de citometría de flujo básico para identificar las principales subpoblaciones de macrófagos y cDC.
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Protocol
Declaración de ética: este protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la red de salud universitaria (Toronto, Canadá) y está de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.
1. preparación de buffer
- Preparar el tampón HBB (de Hank balanceado sal solución (HBSS), suero bovino inactivado por calor 2%, albúmina de suero bovino 0,2%). Añadir 10 mL de calor inactiva el suero bovino y 1 g de albúmina de suero bovino a 500 mL de HBSS. Filtro de esterilización a través de un filtro μm 0.2 y almacenar a 4 ° C.
- Preparar el tampón FACS (tampón de fosfato salino (PBS), 2% calor inactiva el suero bovino, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, pH 8.0)). Añadir inactivado de calor de 10 mL de suero bovino y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 500 mL de PBS. Filtro de esterilización a través de un filtro μm 0.2 y almacenar a 4 ° C.
Nota: Las soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.
2. etiquetado de leucocitos que circulan
- Preparar asépticamente inyección de CD45 anti ratón con 1 μg de anticuerpo diluido en tampón de fosfato estéril salino (PBS) para un volumen de inyección final de 200 μL/ratón. Volumen de carga en una jeringa de insulina 28,5 G y mantener lejos de la luz.
Nota: Utilice dos anticuerpos anti-CD45 marcado con fluorocromo diferente para distinguir el intravascular (teñido a través de la administración de i.v.) de la tinción intracardiaco (manchado después de la digestión; ver paso 4). -
Caliente previamente ratones (8 – 12 semanas) exponiendo la cola a una lámpara de calor rojo durante 5 minutos.
ADVERTENCIA: No recaliente el animal. Mantenga la lámpara a una distancia segura (> 30 cm).- Refrenar el animal en posición esternal utilizando un dispositivo apropiado. Exponer y estabilizar la cola con la mano no dominante por inmovilizar la base de la cola con el índice y el dedo medio y la región medio-distal de la cola con el pulgar y el dedo anular.
PRECAUCIÓN: No aplique demasiada fuerza en la punta de la cola ya que la piel puede ser halada. Inserte la aguja con el bisel hacia arriba en la vena. Mantenga la aguja paralela a la vena en todo momento ya que es fácil punzar la vena.
Nota: Sangre en la jeringa puede ocurrir y es un signo de una buena inyección. Doblar la aguja a un ángulo de 90° puede facilitar la administración de i.v.. Confirme con su oficina de seguridad como agujas de flexión pueden representar un peligro. - Inyectar por vía intravenosa 200 μL en la vena de la cola. El líquido debe fluir fácilmente y eliminar temporalmente la vena.
PRECAUCIÓN: No fuerce el líquido en si encuentra resistencia. Esto es signo de mala colocación de la aguja. - Permiten el anticuerpo a circular durante 5 minutos antes humanamente euthanizing ratón.
- Refrenar el animal en posición esternal utilizando un dispositivo apropiado. Exponer y estabilizar la cola con la mano no dominante por inmovilizar la base de la cola con el índice y el dedo medio y la región medio-distal de la cola con el pulgar y el dedo anular.
3. corazón de aislamiento y la digestión
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Eutanasia a ratones con CO2 o por cualquier otro procedimiento de eutanasia institucionalmente aceptado.
- Eutanasia de CO2 , coloque el ratón en la cámara de CO2 y la tasa de utilización a 20% del volumen por minuto (es decir, si la cámara es de 10 L, llenado en 2 L/min). Funcionar durante 2 min y monitor ratón hasta que ha dejado de respirar.
- Apague el CO2 y dejar el ratón un adicional 1-2 min Asegúrese de que ha dejado de respirar antes de abrir la cámara y realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar que el ratón está muerto antes de proceder a procesar el ratón.
- Rocíe el ratón con etanol al 70%. Levante la piel en el abdomen y diseccionar el ratón cortando a lo largo del principio de la línea media ventral a nivel de las caderas hasta el esternón. Abrir el abdomen y mover el hígado para exponer el diafragma.
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Cortar el diafragma y las costillas en ambos lados de la línea media, siendo cuidadoso para evitar pinchar los pulmones y el corazón.
- Exponer el corazón por peeling espalda las costillas, luego corte primero las aurículas izquierdas seguidas de la aurícula derecha.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al cortar las aurículas, asegurando arterias ni venas no se lesionan, como esto puede disminuir la eficacia del lavado de la sangre contenida en los órganos. - Inundar el corazón con 15 – 20 mL de PBS frío utilizando una jeringa de 60 mL con una aguja de 21 G y PBS frío. Suavemente Sujete la base del corazón con unas pinzas e Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo cerca del ápice. Repita el procedimiento en el ventrículo derecho. Una correcta inyección resulta en blanco pulmones y hígado pálido.
Nota: La perfusión debe realizarse en 5 minutos después de la eutanasia para evitar la coagulación de la sangre, que puede contaminar los órganos de interés con las células circulantes.
- Exponer el corazón por peeling espalda las costillas, luego corte primero las aurículas izquierdas seguidas de la aurícula derecha.
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Sostenga la base del corazón con unas pinzas y suavemente tire el corazón, luego separar el corazón mediante la reducción de las principales arterias pulmonares y las venas, aorta y el saco pericárdico.
- Limpiar el corazón sosteniendo suavemente el corazón entre los dedos del índice y el pulgar en una toalla de papel limpio libre de pelusas y extraiga las aurículas y los restos de las arterias principales y venas y otros contaminantes con el fórceps.
Nota: Asegúrese de retira la totalidad de las aurículas y no otros tejidos como el pulmón o los vasos sanguíneos, están presentes como estos tejidos tienen sus propias células inmunes residentes. En particular, el pulmón tiene una población grande de la célula inmune que puede enmascarar a las poblaciones más pequeñas de ésos dentro del miocardio.
- Limpiar el corazón sosteniendo suavemente el corazón entre los dedos del índice y el pulgar en una toalla de papel limpio libre de pelusas y extraiga las aurículas y los restos de las arterias principales y venas y otros contaminantes con el fórceps.
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Coloque el corazón en un recipiente plástico de 5 cm con 50 μl de PBS frío.
- Picar el corazón usando tijeras disección curvas hasta que no hay piezas visibles y tiene una consistencia suave.
Nota: Trate de mantener el corazón en un área de contenido del plato en picar para minimizar la pérdida de tejido. - Transferencia de tejido de thetrituratedheart usando fórceps curvado en el tubo de microcentrífuga de 2 mL con de 800 μl frío Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM).
- Picar el corazón usando tijeras disección curvas hasta que no hay piezas visibles y tiene una consistencia suave.
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Añadir 450 U/mL ofcollagenase I, 60 U/mL de hialuronidasa tipo I-S y 60 U/mL de DNasa-I para cada muestra.
- Incubar las muestras a 37 ° C en un agitador oscilante a 50 rpm durante 45 – 60 minutos.
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Después de la digestión, brevemente muestras de vórtice (20 s) y colocar inmediatamente en hielo para mantener las muestras a 4 ° C.
- Utilizando una pipeta de 1 mL, pipetear las muestras hacia arriba y hacia abajo hasta que las muestras de tejido son homogéneas y no obstruir la punta de la pipeta.
Nota: Definir un número específico de veces para pipeta puede aumentar la reproducibilidad. Si el corazón no se digiere óptimamente, piezas del miocardio pueden obstruir la pipeta. Pulir suavemente la punta de la pipeta contra el tubo de microcentrífuga ayudará a homogeneizar los trozos más grandes de tejido.
- Utilizando una pipeta de 1 mL, pipetear las muestras hacia arriba y hacia abajo hasta que las muestras de tejido son homogéneas y no obstruir la punta de la pipeta.
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Humedezca previamente un filtro de celular de 40 μm a un tubo cónico de 50 mL con 1 mL de frío HBB.
- Añada la muestra homogeneizada en el filtro y lavar a través vertiendo lentamente 12 – 14 mL de frío HBB.
- Transferencia de muestras de filtrado a un tubo cónico de 15 mL con y guardar a 4 ° C.
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Centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire de sobrenadante.
- Lyse células de sangre rojas añadiendo 1 mL de tampón de lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) para cada muestra. Resuspender las muestras con un vórtex e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Una vez que ha completado la lisis, agregar 5 – 8 mL de frío de Hank balanceado sal solución (HBSS) para detener la hemólisis.
- Centrifugar las muestras a gfor 400 x 5 min a 4 ° C. Aspire de sobrenadante.
- Añadir 1 mL de tampón FACS a cada muestra y su traslado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con.
Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí para un máximo de 2 h con las muestras almacenadas a 4 ° C.
4. flujo Cytometry de tinción y análisis
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Centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Para reducir el atascamiento no específico anticuerpo, diluido 1: 100 anti-CD16/CD32 y bloqueador de monocitos (1:20) (véase Tabla de materiales) que representa el 50 FACS μl por muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Preparar la contabilidad de dilución (1: 250 para cada anticuerpo) del anticuerpo para 50 μl de FACS por muestra.
Nota: Un tinte de viabilidad puede incluirse en el cóctel de anticuerpos para excluir las células muertas. Por otra parte, exclusión de tamaño pequeño por análisis de flujo puede ser usado (figura 1C y D). - Sin lavar, agregar 50 μl de mezcla principal anticuerpo para cada uno de la muestra y mezclar.
- Incubar las muestras a 4 ° C por 30 min en la oscuridad.
- Añadir 600 μl FACS a cada muestra para lavar y centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL FACS. Mantener las muestras a 4 ° C en la oscuridad.
Nota: Algunos colorantes de viabilidad, como DAPI, requieren tinción dentro de 10 minutos antes de ejecutar la citometría de flujo. - Analizar mediante citometría de flujo (ver figuras 1 y 2) dentro de lo próximo 3 h. Si más tiempo es necesario, a corto plazo fijación utilizando un paraformaldehido de baja concentración (0.5 – 1% en PBS) se recomienda para preservar la coloración.
Nota: Se recomienda filtrar las muestras por un colador de célula 40 μm antes de análisis de citometría de flujo iniciar para evitar la obstrucción de los fluidos de la citometría de flujo.
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Representative Results
Hasta la fecha, ningún buen método ha sido diseñado para aislar las células inmunes de otras componentes de la célula cardiaca, como cardiomiocitos. Por lo tanto, el análisis de la suspensión de la célula cardiaca mediante citometría de flujo requiere la sincronización con CD45 para identificar las poblaciones de células inmunitarias, seguidas por celular único y pequeño tamaño exclusión bloquea (figura 1A). Alternativamente, una tinción de viabilidad se puede realizar para excluir las células muertas. Exclusión de tamaño pequeño y coloración de tinte de viabilidad representan métodos casi equivalentes a excluir las células muertas (figura 1B y 1 D). Se recomienda a proceder con el anticuerpo tinción pronto después del procedimiento de digestión y mantenga la suspensión de células a 4 ° C, como la viabilidad de las células puede decaer. Este procedimiento produce típicamente 80-90% de las células inmunes viables.
El miocardio contiene una diversa Colonia de células inmunes, muchos de los cuales están aún pendientes de identificación y caracterización. Macrófagos, identificados como CD64+ las células, son la población inmune importante del corazón, que representa el 60 – 70% de todas las células inmunitarias (figura 1C, arriba). La digestión de un corazón murino adulto rinde acerca de 3 – 5 x 104 macrófagos, dependiendo del tamaño del corazón. Macrófagos cardiacos pueden además subdividirse en base a su expresión de CD11c o CCR2 y sus niveles de MHC-II2.
La otra subpoblación inmune cardiaca que se ha caracterizado bien son células dendríticas convencionales. DCs convencionales son CD64– células que expresa intermedios a altos niveles de MHC-II y altos niveles de CD11c (figura 1 C, abajo). Estas células pueden dividir más a fondo en base a su expresión de CD103 o CD11b8,9. DCs representan mucho más pequeña subpoblación cardiaca en comparación con los macrófagos. La digestión de un corazón murino adulto produce entre 150 y 500 DCs de cada subconjunto.
Perfusión del corazón de PBS frío es esencial identificar las poblaciones de células inmunitarias en el miocardio. Sin embargo, perfusión imperfecta puede aumentar las cantidades de contaminantes intravasculares en las muestras, llevando a importantes sesgos que pueden basarse en cambios periféricos (sangre) en lugar de cambios en el infiltra cardiaco. En estos casos, la administración intravascular de anticuerpos etiquetados fluorescentes anti-CD45, que etiquetas de todas las células inmunes circulantes a través de la macro y microcirculación (figura 2A), puede ayudar a diferenciar las células miocardio de contaminantes intravasculares. Figura 2 B muestra un ejemplo de un corazón mal perfundido en el que el 20% de las células inmunes son contaminantes intravasculares. Lo importante, este nivel de contaminación tiene poco efecto en macrófagos y el análisis de la DC, puesto que estas células se encuentran raramente en la sangre (figura 2D).
El uso de citometría de flujo de una suspensión de la célula del miocardio permite el estudio de las subpoblaciones pequeñas del corazón. Por ejemplo, la deficiencia del factor de transcripción BATF3 se ha demostrado para prevenir el desarrollo de CD103 maduros+ DCs en varios tejidos11. Para estudiar si esto también es cierto en el caso del miocardio, suspensiones de la célula de células cardíacas de 8 – 15 semanas de edad BATF3-deficiente o control hermanos de camada (en fondo de C57BL/6) se analizaron mediante citometría de flujo. Debido al tamaño pequeño de la población y el número de marcadores necesarios para diferenciar los subconjuntos de DC, histología podría no proporcionaron suficiente potencia para el análisis llegar a una respuesta definitiva. Sin embargo, utilizando análisis de citometría de flujo para comparar las células inmunes del miocardio de tipo salvaje versus un ratones Batf3- / - , la falta de CD103+ DCs puede confirmarse en el último (figura 3A y B). Además, se observó que la deficiencia de BATF3 no alterar significativamente la composición de otras poblaciones cardiacas (figura 3C y D). Estos resultados ilustran el grado de sensibilidad que puede lograrse mediante el uso de este método combinado de digestión enzimática y mecánica para lograr una suspensión unicelular.
Figura 1 : Compuerta estrategia para macrófagos cardiacos y DCs. Corazón aislado de ratones C57BL/6 fueron digeridos como se describe, y suspensión unicelular fue analizada por citometría de flujo. (A) Gating de CD45 + singlete en células cardíacas. Utilice etiquetado CD45 para identificar las células inmunes de la célula cardiaca homogeneizado, que incluye niveles muy elevados de células no inmunes (es decir, cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos). Excluir dobletes comparando SSC-H vs SSC-A seguido vs H FSC FSC-A. Nota: Cualquier otra comparación entre SSC-A, SSC-H y SSC-W o FSC-A, H FSC y FSC-W son igualmente útiles. Selección de células vivas se puede realizar mediante la exclusión de células muy pequeñas (SSC-H vs H FSC la puerta). (B) comparación de la exclusión de células muertas con viabilidad de vs tamaño coloración (DAPI). (C) estrategia para la identificación de los macrófagos cardiacos que bloquean (CD11b+ CD64+ las células) y DCs (CD64– MHC-IIHola CD11c+). Los macrófagos cardiacos pueden clasificarse más basado en la expresión de MHC-II y CD11c. cardiaca DCs puede ser subdividido basado en su expresión de CD103 o CD11b (D) parcelas representativas de DAPI + células muertas dentro del macrófago y DC compartimientos después de la exclusión de tamaño pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Etiquetado de intravascular de células contaminantes. (A) comparación del etiquetado de CD45 intravasculares de neutrófilos de la sangre y Ly6CHola monocitos en anticuerpos anti-CD45 tratados (rojo) o ratones (azul) no tratados. (B) identificación de contaminantes intravasculares en una preparación cardiaca mediante el etiquetado de CD45 intravascular. (C) flujo representativo de parcelas de las células miocardio e intravasculares. (D) parcelas representativas de células marcadas dentro del macrófago y compartimientos DC después de la administración i.v. de anti-CD45. Tenga en cuenta que los macrófagos y DCs son exclusivamente extravasculares. Intravasculares contaminantes suelen ser linfocitos, monocitos y neutrófilos2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Cuantificación de macrófagos cardiacos y DCs en ratones deficientes de BATF3. Diagramas de flujo representativo (A) de DCs cardiacas en Batf3+ / + y Batf3- / - ratones. (B) cuantificación de DCs cardiacas en Batf3+ / + y Batf3- / - ratones. Tenga en cuenta la ausencia de CD103+ DCs en ratones- / - Batf3. (C y D) cuantificación de cardiacas macrófagos (MF) en Batf3+ / + y Batf3- / - ratones. Barras de error representan rojo SEM. símbolos representan animales individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Inflamación miocardio o la miocarditis, es una característica de las enfermedades cardiovasculares más. Sin embargo, el miocardio no está desprovista de sus propios componentes inmunes en Estados no patológicos. Durante el estado estacionario, muchas células inmunes residen en el miocardio y desempeñan las funciones esenciales de mantenimiento y protección. La caracterización de estas diversas poblaciones de células no habría sido posible sin métodos como la que se presenta en el presente Protocolo.
Una combinación de digestión mecánica y enzimática del miocardio permite el aislamiento de una suspensión unicelular que puede utilizarse en combinación con otros métodos de análisis, tales como aislamiento de flujo cytometry o Inmunomagnética grano. Varias consideraciones en relación con el presente método deben tomarse en cuenta. En primer lugar, todos nuestros análisis se refieren a las poblaciones dentro del miocardio; se excluyen los atrios de nuestro análisis ya que son tejidos especializados con su propia idiosincrasia. En segundo lugar, las cantidades de enzimas que se expresan como unidades de actividad para ayudar en la configuración de las digestiones con enzimas de otras fuentes. Sin embargo, optimización empírica de la concentración final de las enzimas y el tiempo de digestión es muy recomendable, como limitar la enzima puede reducir significativamente el rendimiento de la célula y demasiado la digestión puede afectar drásticamente la viabilidad. En tercer lugar, el paso opcional, que implica la administración intravascular de los anticuerpos etiquetados recomienda especialmente al estudiar poblaciones infrecuentes en el miocardio normal (como los linfocitos, monocitos o neutrófilos)2 o en circunstancias Cuando el número de poblaciones en la sangre puede cambiar (monocytosis, granulocytosis o linfocitosis) que pueden dar una falsa impresión de cambios en el miocardio que deben confirmarse mediante este método o, alternativamente, microscopia. Sin embargo, este paso es de utilidad limitada cuando se analizan los macrófagos o DCs madurados, como estas células se encuentran raramente en cantidades significativas en la sangre (figura 2D). Es importante optimizar la cantidad de anticuerpo administrado y el tiempo de incubación antes de sacrificar el ratón, como larga incubación puede permitir algunos difusión de anticuerpo en el corazón, especialmente en un miocardio inflamado. Por último, es muy importante ser meticuloso en el aislamiento del corazón, eliminando restos de grandes arterias, venas y otros tejidos como el pulmón. Estos tejidos contaminantes altamente han elevado número de células inmunes que pueden fácilmente enmascarar a las poblaciones indígenas del miocardio.
Es muy importante para llevar a cabo la exclusión de las células muertas, ya sea utilizando tintes de viabilidad o por exclusión de tamaño pequeño durante el análisis de citometría de flujo, como la digestión (o daño tisular en modelos de la enfermedad) puede causar una cantidad relativamente grande de células muertas. Hemos comparado la eficacia de la exclusión de células muertas por el tamaño y el uso de una etiqueta de viabilidad (figura 1B y D), demostrando su equivalencia cerca. Lo importante, exclusión de tamaño no puede utilizarse después de la fijación y permeabilización como este procedimiento reduce significativamente el tamaño de la célula.
Aunque autofluorescencia es raramente un problema para identificar macrófagos cardiacos mediante citometría de flujo, esto representa un problema más importante cuando se trata de caracterizar la expresión de algunos marcadores, especialmente con fluorocromos excitados por alta energía ( ondas de luz más cortos) (350 – 500 nm). En estos experimentos, se recomienda utilizar controles de isotipo, evitar los láseres azules y violetas (isotiocianato de fluoresceína, la ficoeritrina, Pacífico azul/brillante violeta 421) y usar fluorocromos con emisiones por encima de 600 nm, como allophycocyanin.
El uso de protocolos como la que se presenta en este documento son cada vez más importante como una cantidad creciente de literatura es identificar la función de la intensidad y tipo de inflamación en la evaluación y caracterización de los resultados de las enfermedades cardiovasculares. Este método permite mayores niveles de caracterización de la célula que la histología. Por ejemplo, el uso de seguimiento de linaje permitida la identificación de ontogenically diferentes subconjuntos de macrófagos con sus diferentes funciones programadas2. Del mismo modo, este método puede ser utilizado para estudiar las respuestas de células T durante la inflamación miocardio y combinado con el ex vivo estímulo para el estudio de la polarización de la célula de T8.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación salud (148808 y 148792), SE contó con un corazón y un movimiento Fundación, premio personal de la Oficina Provincial de Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre para la investigación del corazón y el Peter Munk Centro cardíaco. XCC tiene una beca de Banting CIHR. LA sostiene un corazón & movimiento/Richard Lewar beca premio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
