Summary
Este protocolo apresenta um método simples e eficiente de isolar, identificar e quantificar as células imunes que residem no miocárdio de ratos durante o estado estacionário ou inflamação. O protocolo combina digestão enzimática e mecânica para a geração de uma suspensão de célula única que pode ser mais analisada por citometria de fluxo.
Abstract
O sistema imunológico é um componente essencial de um coração saudável. O miocárdio é lar de uma população rica de subconjuntos de células imunes diferentes com compartimentalização funcional tanto durante o estado estacionário e diferentes formas de inflamação. Até recentemente, o estudo de células do sistema imunológico no coração exigido o uso da microscopia ou protocolos de digestão mal desenvolvidos, que forneceu suficiente sensibilidade durante inflamação grave, mas com confiança não foram capazes de identificam pequenas — mas chave — populações de células durante o estado estacionário. Aqui, vamos discutir um método simples que combina enzimática (colagenase, hialuronidase e DNAse) e digestão mecânica de corações murino precedidas pela administração intravascular de fluorescente etiquetado anticorpos para diferenciar pequenas mas inevitável contaminantes de célula intravascular. Este método gera uma suspensão de células viáveis isoladas que podem ser analisados por citometria de fluxo para identificação, fenotipagem e quantificação, ou ainda mais purificado com fluorescência-ativado da pilha classificação ou separação magnética do grânulo para estudos de análise ou em vitro transcricionais. Nós incluímos um exemplo de uma análise de cytometric do fluxo passo a passo para diferenciar o macrófago chave e populações de células dendríticas do coração. Para uma experiência de tamanho média (10 corações) a conclusão do procedimento requer 2 a 3 h.
Introduction
Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina1. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a entender que uma população diversa de células do sistema imunológico com funções essenciais de manutenção durante o estado estacionário reside dentro do miocárdio.
Histologia tem sido e ainda é, o método mais comum para caracterizar pilhas imunes cardíacas durante a inflamação. No entanto, enquanto histologia representa uma valiosa ferramenta de diagnóstico, sua utilização no estudo de células do sistema imunológico cardíacas tem limitações importantes. As células imunitárias que residem no miocárdio representam uma proporção muito pequena das células totais e são mais ou menos uniformemente distribuídas em um espaço proporcionalmente imenso. Da mesma forma, várias formas de inflamação cardíaca, tais como miocardite viral, apresentam padrões focais de inflamação. Isto significa que uma análise precisa do sistema imunológico do coração muitas vezes exige graus mais elevados de amostragem histológica, aumentando o custo para reduzir o preconceito. Além disso, a histologia fornece uma quantidade muito limitada de informações utilizáveis na identificação de células (por exemplo, o número de parâmetros). Com um número sempre crescente de subconjuntos de célula que exigem o uso de vários marcadores de expressão (incluindo os marcadores de superfície, fatores de transcrição ou moléculas secretadas), citometria de fluxo estabeleceu-se como a ferramenta mais poderosa para immunophenotyping, devido ao baixo custo e alta produtividade.
O uso de técnicas de immunophenotyping é estreitamente dependente do desenvolvimento de protocolos de digestão eficiente que permitiu para análise de single-células de um grande número de células. O desenvolvimento de protocolos exaustivos de extração de célula aberta uma nova janela de oportunidades no estudo da imunologia cardíaca. Através da combinação de digestão, citometria de fluxo e transcriptomics, as grandes populações de macrófagos e células dendríticas, que reside no coração foram caracterizadas2,3. A população mais abundante de células do sistema imunológico cardíacas durante estado estacionário são CD64+MerTK+ macrófagos, que podem ser divididos com base na sua expressão de CCR2 ou CD11c2. CCR2+ macrófagos originam hematopoiese adulta da medula óssea, Considerando que a maioria dos CCR2– macrófagos, que podem expressar os níveis de altos ou baixos de MHC-II, são principalmente de origem pré-natal. Os macrófagos funções chave como reparo4 e remoção de detritos5 durante lesão ou suportando conectividade elétrica6 em estado estacionário. Durante diferentes formas de inflamação ocorrer um afluxo importante de Ly6COi MHC-IIEis CD64int monócitos, que mais tarde se diferenciar em Ly6COi CCR2+ macrófagos2,7 . Uma população significativamente menor, mas importante, de células que residem no miocárdio de indivíduos saudáveis é composta de células dendríticas8,9. Recentemente foram caracterizados os dois subconjuntos principais de DCs convencionais cardíacas (conjuntos): cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempenham um papel importante na defesa contra infecção8 mas também podem promover a auto-lesão durante a inflamação, particularmente durante o infarto do miocárdio9.
Aqui, descrevemos um método simples para o isolamento das células imunes cardíacas viáveis de miocárdio de rato. O método combina digestão enzimática e mecânica com uma filtração de célula-filtro para obter uma suspensão de célula única que pode ser analisada, ou ainda mais purificada, pela classificação de citometria de fluxo ou enriquecimento magnética do grânulo. Medições precisas de células do miocárdio extravascular necessitam de perfusão cardíaca para remover possíveis contaminantes da corrente sanguínea da microvasculatura cardíaca. Além disso, apresentamos um passo opcional de rotulagem intravascular de células do sistema imunológico que podem ser usadas para diferenciar ainda mais as células do miocárdio de contaminantes intravasculares, com base no protocolo et al Galkina10. Finalmente, apresentamos uma análise de citometria de fluxo básico para identificar as principais subpopulações de macrófagos e cDC.
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Protocol
Declaração de ética: Este protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de cuidado Animal na rede de saúde da Universidade (Toronto, Canadá) e está em conformidade com o Conselho canadense no cuidado Animal.
1. preparação buffer
- Prepare o tampão HBB (Hank está equilibrado sal solução (HBSS), soro bovino de calor 2% inactivada, 0,2% de albumina de soro bovino). Adicione 10 mL de calor inativada soro bovino e 1 g de albumina de soro bovino de 500 mL de HBSS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C.
- Preparar o tampão de FACS (tampão fosfato salino (PBS), inactivados por calor de 2% de soro bovino, 1mm de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, pH 8.0)). Adicione inactivados por calor de 10ml de soro bovino e 1 mL de EDTA 0,5 M para 500 mL de PBS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C.
Nota: Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por até 1 mês.
2. rotulagem de leucócitos em circulação
- Assepticamente prepare injeção de CD45 anti-rato com 1 µ g de anticorpo diluído em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) para um volume final de injeção de 200 µ l/mouse. Carregar o volume em uma seringa de insulina 28,5 G e manter-se longe da luz.
Nota: Use dois anticorpos anti-CD45 marcado com fluorocromo diferente a fim de diferenciar o intravascular (manchado através da administração i.v.) a coloração intracardíaco (manchado após digestão; consulte a etapa 4). -
Pré-aquecer ratos (8-12 semanas de idade), expondo a cauda de uma lâmpada de calor vermelho por 5 min.
Cuidado: Não superaqueça o animal. Manter a lâmpada a uma distância segura (> 30 cm).- Contenha o animal na posição esternal, utilizando um dispositivo apropriado. Expor e estabilizar o rabo com a mão não dominante por imobilizando a base da cauda com o índice e o dedo médio e região médio-distal da cauda com o polegar e o dedo anelar.
Atenção: Não aplique demasiada força na ponta da cauda como a pele pode ser puxada para. Introduza a agulha com o bisel voltado para cima na veia. Manter a agulha paralelamente à veia em todos os momentos como é fácil para punção da veia.
Nota: Introduzir a seringa de sangue pode ocorrer e é um sinal de uma boa injeção. Dobrar a agulha a um ângulo de 90° pode facilitar a administração intravenosa. Confirme com seu escritório de segurança como agulhas dobra podem representar um perigo. - 200 µ l por via intravenosa Injecte na veia da cauda. O líquido deverá fluir facilmente e temporariamente a veia.
Cuidado: Não force fluido em se encontrar resistência. Isso é sinal de má colocação da agulha. - Permitir que o anticorpo a circular por 5 min antes humanamente eutanásia do mouse.
- Contenha o animal na posição esternal, utilizando um dispositivo apropriado. Expor e estabilizar o rabo com a mão não dominante por imobilizando a base da cauda com o índice e o dedo médio e região médio-distal da cauda com o polegar e o dedo anelar.
3. coração isolando e digestão
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Eutanásia em ratos usando CO2 ou por outro procedimento de eutanásia institucionalmente aceitos.
- Para eutanásia de CO2 , posicione o mouse na câmara de CO2 e definir a taxa de preenchimento de 20% do volume da câmara por minuto (ou seja, se a câmara estiver 10L, preenchimento a 2 L/min). Executado por 2 min e monitor do mouse até respiração cessou.
- Desligue o CO2 e deixar o mouse de um adicional 1-2 min. Certifique-se de respiração cessou antes de abrir a câmara e executar uma pitada de dedo do pé para confirmar que o mouse está morto antes de prosseguir para processar o mouse.
- Pulverize o mouse com etanol a 70%. Levante a pele do abdômen e dissecar o mouse por corte ao longo do início da linha média ventral a nível dos quadris até o esterno. Abrir o abdômen e mover o fígado para expor o diafragma.
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Corte o diafragma e, em seguida, as costelas de ambos os lados da linha média, tendo o cuidado de evitar perfurar os pulmões e o coração.
- Expor o coração por peeling volta as costelas e, em seguida, corte primeiro os átrios esquerdos seguidos dos átrios direito.
Cuidado: Tenha cuidado ao cortar os átrios, garantindo não artérias ou veias estão lesionadas, como isto pode diminuir a eficiência da lavagem do sangue contido nos órgãos. - Perfundir o coração com 15-20 mL de PBS frio usando uma seringa de 60 mL equipada com uma agulha 21G e PBS frio. Delicadamente, segure a base do coração com fórceps e insira a agulha no ventrículo esquerdo perto do ápice. Repita o procedimento no ventrículo direito. Uma injeção adequada resulta em brancos pulmões e fígado pálido.
Nota: A perfusão deve ser realizada dentro de 5 minutos após eutanásia para evitar a coagulação do sangue, que pode contaminar os órgãos de interesse com células de circulação.
- Expor o coração por peeling volta as costelas e, em seguida, corte primeiro os átrios esquerdos seguidos dos átrios direito.
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Segurar a base do coração com fórceps e gentilmente puxe o coração, em seguida, desanexar o coração cortando as principais artérias pulmonares e veias, aorta e o saco pericárdico.
- Limpar o coração, delicadamente segurando o coração entre o polegar e o dedo indicador em uma toalha de papel limpa fiapos e puxar os átrios e os restos de artérias e veias e de outros contaminantes com fórceps.
Nota: Certifique-se a totalidade dos átrios é removida e outros tecidos, tais como o pulmão ou dos vasos sanguíneos, estão presentes como estes tecidos têm suas próprias células imunes residentes. O pulmão, em particular, tem uma população de grandes células imunes que pode mascarar as populações menores daqueles dentro do miocárdio.
- Limpar o coração, delicadamente segurando o coração entre o polegar e o dedo indicador em uma toalha de papel limpa fiapos e puxar os átrios e os restos de artérias e veias e de outros contaminantes com fórceps.
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Coloque o coração em um prato de plástico de 5 cm com 50 µ l de PBS frio.
- Picar o coração usando tesouras de dissecação curvas até existem pedaços visíveis e tem uma consistência suave.
Nota: Tente manter o coração em uma área isolada do prato durante a cortar para minimizar a perda de tecido. - Tecido de thetrituratedheart de transferência usando pinça curva para tubo de microcentrifuga de 2 mL com a 800 µ l frio Dulbecco modificado águia médio (DMEM).
- Picar o coração usando tesouras de dissecação curvas até existem pedaços visíveis e tem uma consistência suave.
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Adicionar 450 U/mL ofcollagenase I, 60 U/mL de hialuronidase tipo S e 60 U/mL de DNase-I para cada amostra.
- Incube as amostras a 37 ° C, num balanço agitador a 50 rpm para 45 – 60 min.
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Depois da digestão, brevemente amostras de vórtice (20 s) e coloque imediatamente no gelo para manter as amostras em 4 ° C.
- Usando uma pipeta de 1 mL, pipete amostras acima e para baixo até que as amostras de tecido são homogêneas e não entupir a ponta da pipeta.
Nota: A definição de um número específico de vezes para pipetar pode aumentar a reprodutibilidade. Se os corações não são otimamente digeridos, pedaços de miocárdio podem obstruir a pipeta. Moedura suavemente a ponta da pipeta contra o tubo microcentrifuga ajudará a homogeneizar os pedaços maiores de tecido.
- Usando uma pipeta de 1 mL, pipete amostras acima e para baixo até que as amostras de tecido são homogêneas e não entupir a ponta da pipeta.
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Pre-molhado um coador de célula 40 µm colocado em um tubo cônico de 50 mL com 1 mL de frio HBB.
- Adicionar a amostra homogeneizada para o filtro e lave através de derramando lentamente 12 – 14 mL de frio HBB.
- Transferir amostras filtradas para um tubo cônico de 15ml rotulados e manter a 4 ° C.
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Centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
- Lyse pilhas de sangue vermelhas, adicionando 1 mL de tampão de lise de amónio-cloreto de potássio (ACK) para cada amostra. Resuspenda as amostras vortexing e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
- Uma vez que Lise foi concluído, adicione 5 – 8 mL de frio do Hank equilibrado sal solução (HBSS) para parar a hemólise.
- Centrifugar as amostras na faz 400 x 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de tampão de FACS para cada amostra e transferir para um tubo de microcentrifugadora rotulados de 1,5 mL.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui para até 2 h com amostras armazenadas a 4 ° C.
4. fluxo Cytometry manchando e análise
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Centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C.
- Para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos, diluir 1: 100 anti-CD16/CD32 e bloqueador de monócitos (01:20) (ver Tabela de materiais) contabilização de 50 µ l FACS, por exemplo. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
- Prepare a contabilização de diluição (1: 250 para cada anticorpo) Anticorpo de 50 µ l de FACS por amostra.
Nota: Uma tintura de viabilidade pode ser incluída no coquetel do anticorpo para eliminar as células mortas. Como alternativa, exclusão de tamanho pequeno por análise de fluxo pode ser usado (Figura 1C e D). - Sem lavar, adicione 50 µ l de mistura de mestre de anticorpo para cada amostra e misture.
- Incube as amostras a 4 ° C por 30 min no escuro.
- Adicione 600 FACS µ l de cada amostra para lavar e centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C.
- Aspire o sobrenadante e ressuspender em 300 µ l FACS. Mantenha as amostras em 4 ° C, no escuro.
Nota: Alguns corantes de viabilidade, como o DAPI, exigem a coloração dentro de 10 min antes da execução de citometria de fluxo. - Análise por citometria de fluxo (ver figuras 1 e 2) dentro da próxima 3h. Se um tempo maior é a fixação necessária, a curto prazo, usando um paraformaldeído de baixa concentração (0,5-1% em PBS) é recomendada para preservar a coloração.
Nota: É altamente recomendável para filtrar amostras através de um filtro de célula de 40 µm antes da análise de citometria de fluxo iniciar para evitar obstrução do fluidics do citômetro de fluxo.
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Representative Results
Até à data, nenhum bom método foi projetado para isolar as células imunes de outros componentes da célula cardíaca, tais como cardiomyocytes. Portanto, análise da suspensão por citometria de fluxo cardíaco única célula requer um pre-gating com CD45 para identificar as populações de células imunes, seguidas por uma única célula e tamanho pequeno exclusão associada (Figura 1A). Alternativamente, uma coloração de viabilidade pode ser realizada para excluir as células mortas. Exclusão de tamanho pequeno e coloração de tintura de viabilidade representam quase equivalentes métodos para eliminar as células mortas (Figura 1B e 1 D). É altamente recomendável para prosseguir com o anticorpo que mancha logo após o processo de digestão e sempre manter a suspensão de eritrócitos a 4 ° C, conforme a viabilidade das células pode deteriorar. Este procedimento normalmente produz cerca de 80-90% de células viáveis do sistema imunológico.
O miocárdio abriga uma colônia diversa das células imunes, muitos dos quais estão ainda pendentes de identificação e caracterização. Macrófagos, identificados como CD64+ células, são a maior população imune do coração, que representam 60-70% de todas as células do sistema imunológico (Figura 1C, top). A digestão de um coração adulto murino produz sobre 3 – 5 x 104 macrófagos, dependendo do tamanho do coração. Os macrófagos cardíacos podem ser subdivididos com base em sua expressão de CD11c ou CCR2 e seus níveis de MHC-II2.
A outra subpopulação imune cardíaca que tem sido bem caracterizada são células dendríticas convencionais. DCs convencionais são CD64– células que expresso intermediário para níveis elevados de MHC-II e altos níveis de CD11c (Figura 1 C, inferior). Estas células podem ser divididas com base na sua expressão de CD11b ou CD1038,9. DCs representam uma muito menor subpopulação cardíaca em comparação com os macrófagos. A digestão de um coração murino adulto produz entre 150 e 500 DCs de cada subconjunto.
Perfusão do coração com PBS frio é essencial ao identificar populações de células imunes dentro do miocárdio. No entanto, perfusão imperfeito pode aumentar as quantidades de contaminantes intravasculares nas amostras, levando a viés importante que podem ser baseado em alterações periféricas (sangue) ao invés de mudanças nos infiltrados cardíacas. Nestes casos, administração intravascular de anti-CD45 fluorescente etiquetado anticorpos, que rotula a todas as células imunes circulantes através de macroe a microvasculatura (Figura 2A), pode ajudar a diferenciar células do miocárdio de contaminantes intravasculares. Figura 2 B mostra um exemplo de um coração imperfeitamente perfundido em que 20% das células do sistema imunológico são contaminantes intravasculares. Importante, neste nível de contaminação tem pouco efeito sobre macrófagos e análise de DC, uma vez que estas células são raramente encontradas no sangue (Figura 2D).
O uso da citometria de fluxo de uma suspensão única célula do miocárdio permite o estudo das pequenas subpopulações do coração. Por exemplo, a deficiência do fator de transcrição BATF3 foi mostrada para impedir o desenvolvimento de maduro CD103+ DCs em vários tecidos11. A fim de estudar se isto também é verdade no caso do miocárdio, suspensões de célula única de células cardíacas de 8 – 15 semanas de idade BATF3-deficiente ou controle littermates (no fundo C57BL/6) foram analisadas utilizando a citometria de fluxo. Devido ao tamanho pequeno da população e número de marcadores necessários para diferenciar os subconjuntos de DC, histologia não poderia ter fornecido a energia suficiente para análise para chegar a uma resposta definitiva. No entanto, usando análise de citometria de fluxo para comparar as células imunitárias do miocárdio do selvagem-tipo contra um ratos Batf3- / - , a falta de CD103+ DCs pode ser confirmada no último (Figura 3A e B). Além disso, observou-se que BATF3-deficiência não alterou significativamente a composição de outras populações cardíacas (Figura 3C e D). Estes resultados exemplificam o grau de sensibilidade que pode ser alcançado usando esse método combinado de digestão enzimática e mecânica para conseguir uma suspensão de célula única.
Figura 1 : Gating estratégia para macrófagos cardíacos e DCs. Corações isoladas de camundongos C57BL/6 foram digeridas conforme descrito, e suspensão de célula única foi analisada por citometria de fluxo. (A) Gating de CD45 + células cardíacas singlet ao vivo. Use a CD45 rotulagem para identificar células do sistema imunológico da célula cardíaca homogeneizado, que inclui níveis muito elevados de células não-imune (i.e., cardiomyocytes, células endoteliais e fibroblastos). Excluir parelhas comparando-se SSC-H vs CCD-A seguido pelo FSC-H vs FSC-A. Nota: Qualquer outra comparação entre SSC-A, SSC-H e SSC-W ou FSC-A, FSC-H e FSC-W são igualmente úteis. Seleção de células vivas pode ser executada por excluindo células muito pequenas (portão de SSC-H vs FSC-H). (B) comparação de exclusão de célula morta usando a viabilidade de vs tamanho coloração (DAPI). (C) Gating estratégia para identificação de macrófagos cardíacas (CD11b+ CD64+ células) e DCs (CD64– MHC-IIOi CD11c+). Macrófagos cardíacos podem ser mais classificados com base em sua expressão de MHC-II e CD11c. DCs cardíaca pode ser subdividido com base em sua expressão de CD103 ou CD11b. (D) a parcela representativa de DAPI + células mortas dentro do macrófago e DC compartimentos após a exclusão de tamanho pequeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Rotulagem de intravascular de células contaminantes. (A) comparação da rotulagem de CD45 intravascular de sangue neutrófilos e Ly6COi monócitos no anticorpo anti-CD45 tratados (vermelho) ou não-tratados de ratos (azuis). (B) identificação de contaminantes intravasculares em uma preparação cardíaca por meio de rotulagem intravascular de CD45. (C) fluxo representativo parcelas das células do miocárdio e intravasculares. (D) parcelas representativas de células marcadas dentro do macrófago e compartimentos de DC após a administração de soro anti-CD45. Observe que os macrófagos e DCs são exclusivamente extravascular. Intravasculares contaminantes são, tipicamente, linfócitos, monócitos e neutrófilos2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Quantificação de macrófagos cardíacos e DCs em camundongos deficientes em BATF3. (A) a parcela de fluxo representativo de DCs cardíacas em Batf3+ + e Batf3- / - ratos. (B) quantificação de DCs cardíacas em Batf3+ + e Batf3- / - ratos. Observe a ausência de CD103+ DCs em Batf3- / - ratos. (C e D) quantificação de macrófagos cardíacas (MF), em Batf3+ + e Batf3- / - ratos. Barras de erro representam SEM. Red símbolos representam animais individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Inflamação do miocárdio ou miocardite, é uma característica das doenças cardiovasculares mais. No entanto, o miocárdio não é desprovida de seus próprios componentes imunes nos Estados de não-doença. Durante o estado estacionário, muitas células do sistema imunológico residem no miocárdio e desempenham o papel essencial de manutenção e proteção. A caracterização dessas diversas populações de células não teria sido possível sem métodos como o apresentado neste protocolo.
Uma combinação de digestão enzimática e mecânica do miocárdio permite o isolamento de uma suspensão de célula única que pode ser usado em combinação com outros métodos de análise, tais como isolamento de fluxo cytometry ou Fima do grânulo. Várias considerações sobre o presente método devem ser tomadas em conta. Em primeiro lugar, todos nossas análises se referir às populações dentro do miocárdio; excluímos os átrios de nossa análise, como estes são tecidos especializados, com suas próprias idiossincrasias. Em segundo lugar, as quantidades de enzimas utilizadas são expressas em unidades de atividade para ajudar na configuração de digestões usando enzimas provenientes de outras fontes. No entanto, otimização de empírico da concentração final de enzimas e o tempo de digestão é altamente recomendada, como limitar a enzima pode reduzir significativamente o rendimento de célula e muita digestão pode afetar drasticamente a viabilidade. Em terceiro lugar, a etapa opcional envolvendo a administração intravascular de anticorpos rotulados é especialmente recomendada quando estuda populações incomuns no miocárdio normal (como linfócitos, monócitos e neutrófilos)2 ou sob circunstâncias Quando o número de populações no sangue pode mudar (monocitose, granulocytosis ou linfocitose) que pode dar uma falsa impressão de mudanças dentro do miocárdio que precisa ser confirmada usando este método ou, alternativamente, a microscopia. No entanto, esta etapa é de utilidade limitada ao analisar os macrófagos ou DCs maduros, como estas células são raramente encontradas em quantidades significativas no sangue (Figura 2D). É importante otimizar a quantidade de anticorpo administrada e o tempo de incubação antes de sacrificar o mouse, como longo prazo incubação pode permitir alguns difusão de anticorpos para o coração, especialmente em um miocárdio inflamado. Finalmente, é muito importante ser meticuloso no isolamento do coração, eliminando restos de grandes artérias, veias e ou quaisquer outros tecidos, tais como o pulmão. Estes tecidos contaminantes altamente têm elevados números de células do sistema imunológico que podem facilmente mascarar as populações indígenas do miocárdio.
É muito importante para realizar a exclusão de células mortas, se usando corantes de viabilidade ou por exclusão de tamanho pequeno, durante a análise de citometria de fluxo, como a digestão (ou dano tecidual em modelos de doença) pode causar uma quantidade relativamente grande de células mortas. Compararam a eficácia da exclusão de célula morta por tamanho e usando um rótulo de viabilidade (Figura 1B e D), demonstrando sua equivalência de perto. Exclusão de tamanho importante, não pode ser usado após a fixação e permeabilização como este procedimento reduz significativamente o tamanho da célula.
Apesar de autofluorescência raramente é um problema para identificar os macrófagos cardíacos utilizando citometria de fluxo, isto representa um problema mais importante ao tentar caracterizar a expressão de alguns marcadores, especialmente com fluorochromes animados por (de alta energia comprimentos de luz mais curtos) (350-500 nm). Nesses experimentos, é altamente recomendável usar controles isotype, evitar os lasers azuis e violetas (isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, Pacific Blue/brilhante violeta 421) e usar fluorochromes com emissões acima de 600 nm, tais como allophycocyanin.
O uso de protocolos como o apresentado neste documento são cada vez mais importante como uma quantidade crescente de literatura é identificar o papel da intensidade e do tipo de inflamação na avaliação e caracterizando os resultados da doença cardiovascular. Esse método permite que níveis mais elevados de caracterização de célula que histologia. Por exemplo, o uso de rastreamento de linhagem possibilitou a identificação de ontogenically diferentes subconjuntos de macrófagos com suas funções programadas diferentes2. Da mesma forma, este método pode ser usado para estudar as respostas de células T durante a inflamação do miocárdio e combinado com ex vivo de estimulação para estudar a polarização de célula T8.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (148808 e 148792), SE foi apoiado por um coração e Stroke Foundation, o prêmio do pessoal do escritório Provincial de Ontário, March of Dimes, Ted Rogers Centre para a investigação de coração e o Peter Munk Centro cardíaco. Xavier possui um CIHR Banting Fellowship. LA tem um coração & Stroke/Richard Lewar Studentship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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