Summary
Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.
Abstract
Il sistema immunitario è una componente essenziale di un cuore sano. Il miocardio è sede di una popolazione ricca dei sottoinsiemi delle cellule immuni differenti con compartimentazione funzionale sia durante stato stazionario diverse forme di infiammazione. Fino a poco tempo, lo studio delle cellule immunitarie nel cuore ha richiesto l'uso di microscopia o protocolli di digestione poco sviluppati, che fornito di sensibilità sufficiente durante l'infiammazione severa, ma erano tranquillamente in grado di identificano piccoli — ma chiave — popolazioni di cellule durante lo stato stazionario. Discutiamo qui, un metodo semplice combinazione enzimatica (collagenasi, ialuronidasi e DNasi) e digestione meccanica del cuore murino preceduta da somministrazione intravascolare di anticorpi fluorescente etichettati per differenziare piccolo ma inevitabile contaminanti intravascolare delle cellule. Questo metodo genera una sospensione di cellule vitali isolate che può essere analizzato tramite flusso cytometry per fenotipizzazione di identificazione e quantificazione, o ulteriormente purificate con fluorescenza-attivato delle cellule l'ordinamento o la separazione di biglie magnetiche per studi di analisi o in vitro trascrizionali. Includiamo un esempio di una dettagliata analisi citofluorimetrica per differenziare la chiave del macrofago e popolazioni di cellule dendritiche del cuore. Per un esperimento di dimensione medio (10 cuori) il completamento della procedura richiede 2 – 3 h.
Introduction
Diverse forme di stress del miocardio o danno, inclusi ischemico (ischemia riperfusione o infarto del miocardio) e non-ischemica (ipertensione o miocardite), promuovere il reclutamento di cellule infiammatorie con riparatore e protettivo, ma anche Proprietà patogene. Già nel 1891, Romberg descritto in primo luogo la presenza di infiltrati cellulari nel miocardio dei pazienti infettati con il tifo e la scarlattina1. Tuttavia, lo studio dettagliato delle cellule immuni cardiache richiesto lo sviluppo di tecniche più avanzate di immunofenotipizzazione. Di conseguenza, solo recentemente abbiamo iniziato a capire che una popolazione eterogenea di cellule del sistema immunitario con ruoli di manutenzione essenziali durante stato stazionario risiede all'interno del miocardio.
L'istologia è stato ed è tuttora, il metodo più comune per caratterizzare le cellule immuni cardiache durante l'infiammazione. Tuttavia, mentre l'istologia rappresenta un prezioso strumento diagnostico, suo utilizzo nello studio delle cellule immuni cardiache ha limitazioni importanti. Le cellule immunitarie che risiedono nel miocardio rappresentano una percentuale molto piccola delle cellule totali e sono più o meno uniformemente distribuite in uno spazio immenso proporzionalmente. Allo stesso modo, diverse forme di infiammazione cardiaca, quali miocardite virale, mostrano modelli focali di infiammazione. Questo significa che l'analisi accurata del sistema immunitario del cuore richiedono spesso più alti gradi di campionamento istologico, l'aumento del costo per ridurre i pregiudizi. Inoltre, l'istologia fornisce una quantità molto limitata di informazioni utilizzabili nell'identificazione delle cellule (ad es. numero di parametri). Con un numero sempre crescente di sottoinsiemi di cellule che richiedono l'utilizzo di più indicatori di espressione (compresi gli indicatori di superficie, fattori di trascrizione o molecole secrete), citometria a flusso si è affermata come il più potente strumento per immunophenotyping, a causa di alto-rendimento e basso costo.
L'uso di tecniche di immunophenotyping dipende strettamente lo sviluppo di protocolli di digestione efficiente che ha permesso per l'analisi di singole cellule di un gran numero di cellule. Lo sviluppo di protocolli esaustivi di estrazione delle cellule ha aperto una nuova finestra di opportunità nello studio della immunologia cardiaco. Attraverso la combinazione di digestione, citometria a flusso e trascrittomica, le principali popolazioni di macrofagi e cellule dendritiche che risiedono nel cuore sono stati caratterizzati2,3. La popolazione più abbondante di cellule immuni cardiache durante allo stato stazionario sono CD64++ MerTK macrofagi, che possono essere ulteriormente suddivisi sulla base di loro espressione di CCR2 o CD11c2. CCR2+ macrofagi hanno origine dal midollo osseo adulto ematopoiesi, considerando che la maggior parte di CCR2 macrofagi– , che possono esprimere livelli elevati o bassi di MHC-II, sono principalmente di origine prenatale. I macrofagi hanno funzioni chiave come riparazione4 e la rimozione di detriti5 durante la ferita o sostenere connettività elettrica6 in regime stazionario. Durante diverse forme di infiammazione si verificano un importante afflusso di Ly6CCiao MHC-IIlo CD64int monociti, che più successivamente differenziarsi in Ly6CCiao CCR2+ macrofagi2,7 . Una popolazione significativamente più piccola, ma importante, di cellule che risiedono nel miocardio di individui in buona salute è composto di cellule dendritiche8,9. I due sottoinsiemi principali di cardiaca convenzionale DCs (cDCs) sono stati recentemente caratterizzati: cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs svolgono un ruolo importante nella difesa contro l'infezione8 , ma può anche promuovere la auto-ferita durante l'infiammazione, in particolare durante l'infarto miocardico9.
Qui, descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di cellule immuni cardiache vitali dal miocardio del mouse. Il metodo combina digestione enzimatica e meccanica con una filtrazione di cella-setaccio per ottenere una sospensione di singola cellula che può essere analizzata, o ulteriormente purificata, tramite flusso cytometry ordinamento o arricchimento di biglie magnetiche. Misurazioni accurate delle cellule del miocardio extravascular richiedono aspersione cardiaca al fine di rimuovere eventuali contaminanti dal flusso sanguigno del microvasculature cardiaco. Inoltre, vi presentiamo un passaggio facoltativo di etichettatura intravascolare delle cellule immuni che possono essere utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule del miocardio da contaminanti intravascolare, basati sul Galkina et al protocollo10. Infine, presentiamo un'analisi di citometria a flusso di base per identificare le principali sottopopolazioni macrofago e cDC.
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Protocol
Dichiarazione etica: questo protocollo è stato esaminato e approvato dal comitato di cura degli animali alla rete di salute dell'Università (Toronto, Canada) ed è in conformità con il Consiglio canadese su Animal Care.
1. preparazione buffer
- Preparare il tampone di HBB (di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS), siero bovino 2% calore inattivato, 0,2% di sieroalbumina bovina). Aggiungere 10 mL di calore inattivato siero bovino e 1 g di albumina di siero bovino a 500 mL di HBSS. Filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,2 µm e conservare a 4 ° C.
- Preparare il tampone di FACS (tampone fosfato salino (PBS), inattivato con calore 2% di siero bovino, 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, pH 8.0)). Aggiungere inattivato con calore 10 mL siero bovino e 1 mL di EDTA 0,5 M a 500 mL di PBS. Filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,2 µm e conservare a 4 ° C.
Nota: Soluzioni possono essere memorizzati a 4 ° C per 1 mese.
2. etichettatura dei leucociti circolanti
- Asetticamente preparare l'iniezione di CD45 anti-topo con 1 µ g di anticorpo diluito in soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) per un volume finale di iniezione di 200 µ l/mouse. Volume di carico in una siringa di insulina 28,5 G e tenere lontano dalla luce.
Nota: Utilizzare due diversi fluorocromo-labelled anti-CD45 anticorpi per differenziare l'intravascolare (macchiato attraverso somministrazione endovenosa) dalla macchiatura intracardiaco (macchiato dopo digestione; Vedi punto 4). -
Pre-riscaldare i topi (8 – 12 settimane vecchie) esponendo la coda ad una lampada di calore rosso per 5 min.
Attenzione: Non surriscaldare l'animale. Tenere la lampada a una distanza di sicurezza (> 30 cm).- Trattenere l'animale in posizione sternale utilizzando un dispositivo appropriato. Esporre e stabilizzare la coda con la mano non-dominante di immobilizzare la base della coda con l'indice e il dito medio e la regione metà distale della coda con il pollice e il dito anulare.
Attenzione: Non applicare troppa forza sulla punta della coda come la pelle può essere tirata fuori. Inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto nella vena. Tenere l'ago parallelo alla vena in ogni momento, come è facile da forare la vena.
Nota: Sangue entrino nella siringa può verificarsi ed è un segno di una bella iniezione. Piegare l'ago con un angolo di 90° può facilitare la somministrazione endovenosa. Confermare con il vostro ufficio di sicurezza come piegatura aghi possono rappresentare un pericolo. - Iniettare per via endovenosa 200 µ l nella vena caudale. Il fluido deve fluire facilmente e temporaneamente deselezionare la vena.
Attenzione: Non forzare liquido in se si incontra resistenza. Questo è segno di smarrimento dell'ago. - Consentire l'anticorpo di circolare per 5 min prima umanamente eutanasia del mouse.
- Trattenere l'animale in posizione sternale utilizzando un dispositivo appropriato. Esporre e stabilizzare la coda con la mano non-dominante di immobilizzare la base della coda con l'indice e il dito medio e la regione metà distale della coda con il pollice e il dito anulare.
3. cuore isolando e digestione
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Eutanasia topi usando CO2 o di altra procedura istituzionalmente accettato l'eutanasia.
- Per CO2 eutanasia, posizionare il mouse nella camera CO2 e impostare la velocità di riempimento al 20% del volume camera al minuto (cioè, se la camera è 10 L, riempimento a 2 L/min). Eseguire per 2 min e monitor mouse fino a quando la respirazione è cessato.
- Spegnere la CO2 e lasciare il mouse per un ulteriore 1-2 minuti verificare respirazione ha smesso prima di aprire la camera ed eseguire un pizzico di punta per confermare che il mouse è morto prima di procedere per elaborare il mouse.
- Spruzzare il mouse con etanolo al 70%. Sollevare la pelle all'addome e sezionare il mouse tagliando lungo l'inizio della linea ventrale mediana a livello dei fianchi fino allo sterno. Aprire l'addome e spostare il fegato per esporre il diaframma.
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Tagliare il diaframma, quindi le costole su entrambi i lati della linea mediana, facendo attenzione ad evitare di perforare i polmoni e il cuore.
- Esporre il cuore da peeling schiena le costole, quindi primo taglio gli atrii di sinistro seguiti da atri destro.
Attenzione: Usare cautela quando si tagliano gli atrii, garantendo che arterie o vene non sono ferite, come questo può ridurre l'efficienza del lavaggio il sangue contenuto negli organi. - Irrorare il cuore con 15 – 20 mL di PBS freddo utilizzando una siringa da 60 mL con ago 21 G e PBS freddo. Delicatamente afferrare la base del cuore con la pinzetta e inserire l'ago nel ventricolo di sinistra vicino all'apice. Ripetere la procedura nel ventricolo di destra. Un'iniezione corretta si traduce in bianchi polmoni e fegato pallido.
Nota: Perfusione deve essere eseguita entro 5 minuti dopo l'eutanasia per evitare la coagulazione del sangue, che può contaminare gli organi di interesse con cellule circolanti.
- Esporre il cuore da peeling schiena le costole, quindi primo taglio gli atrii di sinistro seguiti da atri destro.
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Tenere la base del cuore con il forcipe e delicatamente tirare il cuore, quindi staccare il cuore dal taglio delle arterie polmonari principali e vene, aorta e il sacco pericardico.
- Pulire il cuore tenendo delicatamente il cuore tra il dito indice e il pollice in un tovagliolo di carta pulito privo di lanugine e tirare fuori gli atrii ed i resti delle principali arterie e vene e qualsiasi altri contaminanti con il forcipe.
Nota: Garantire la totalità degli atrii è rimosso e non altri tessuti, quali il polmone o vasi sanguigni, sono presenti come questi tessuti hanno loro proprie cellule immunitarie residente. Il polmone, in particolare, ha una popolazione di grandi cellule immuni che possa mascherare le popolazioni più piccole di quelle all'interno del miocardio.
- Pulire il cuore tenendo delicatamente il cuore tra il dito indice e il pollice in un tovagliolo di carta pulito privo di lanugine e tirare fuori gli atrii ed i resti delle principali arterie e vene e qualsiasi altri contaminanti con il forcipe.
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Mettere il cuore in un piatto di plastica di 5cm con 50 µ l di PBS freddo.
- Tritare il cuore utilizzando forbici per dissezione curve fino a quando non ci sono nessun pezzi visibili e ha una consistenza liscia.
Nota: Provare a mantenere il cuore in una area contenuta del piatto durante il tagliere per minimizzare la perdita di tessuto. - Trasferimento thetrituratedheart tessuto usando il forcipe curvo in provetta da 2 mL microcentrifuga con di 800 µ l freddo Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM).
- Tritare il cuore utilizzando forbici per dissezione curve fino a quando non ci sono nessun pezzi visibili e ha una consistenza liscia.
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Aggiungere 450 U/mL ofcollagenase io, 60 U/mL di ialuronidasi tipo S e 60 U/mL di dnasi-I per ogni campione.
- Incubare i campioni a 37 ° C in un agitatore oscillante a 50 giri/min per 45 – 60 min.
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Dopo la digestione, brevemente campioni di vortice (20 s) e collocare immediatamente sul ghiaccio per mantenere i campioni a 4 ° C.
- Utilizzo di una pipetta da 1 mL, pipettare campioni su e giù fino a quando i campioni di tessuto sono omogenei e non intasare la punta della pipetta.
Nota: Definizione di un determinato numero di volte per pipettare può aumentare riproducibilità. Se i cuori non sono digeriti in modo ottimale, pezzi del miocardio possono ostruire la pipetta. Macinazione delicatamente la punta della pipetta contro il tubo del microcentrifuge aiuterà a omogeneizzare i grandi pezzi di tessuto.
- Utilizzo di una pipetta da 1 mL, pipettare campioni su e giù fino a quando i campioni di tessuto sono omogenei e non intasare la punta della pipetta.
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Pre-bagnato un colino di cella µm 40 collocato su una provetta conica da 50 mL con 1 mL di HBB freddo.
- Aggiungere il campione omogeneizzato al filtro e lavare attraverso versando lentamente 12 – 14 mL di HBB freddo.
- Trasferire campioni filtrati in una provetta conica di etichettati 15ml e conservare a 4 ° C.
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Centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il sovranatante.
- Lisare cellule rosse del sangue aggiungendo 1 mL di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per ogni campione. Risospendere i campioni nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Una volta completata la lisi, aggiungere 5 – 8 mL di freddo di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) per interrompere il hemolysis.
- Centrifugare i campioni a gper 400 x 5 min a 4 ° C. Aspirare il sovranatante.
- Aggiungere 1 mL di tampone di FACS per ogni campione e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga etichettati 1,5 mL.
Nota: Il protocollo può essere sospesa qui per fino a 2 h con campioni conservati a 4 ° C.
4. flusso Cytometry macchiatura e analisi
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Centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min a 4 ° C.
- Per ridurre il legame non specifico anticorpo, diluire 1: 100 anti-CD16/CD32 e monocito Blocker (01:20) (vedere Tabella materiali) contabilizzazione per 50 µ l FACS per campione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Preparare la contabilità di diluizione (1: 250 per ogni anticorpo) anticorpo 50 µ l di FACS per campione.
Nota: Un colorante di redditività può essere incluso nell'anticorpo cocktail al fine di escludere le cellule morte. In alternativa, l'esclusione di piccole dimensioni di analisi del flusso può essere usato (Figura 1C e D). - Senza lavaggio, aggiungere 50 µ l di mix master anticorpo per ogni campione e mescolare.
- Incubare i campioni a 4 ° C per 30 min al buio.
- Aggiungere 600 µ l FACS per ciascun campione per lavare e centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min a 4 ° C.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 300 µ l FACS. Mantenere i campioni a 4 ° C al buio.
Nota: Alcuni coloranti di vitalità, come DAPI, richiedono la macchiatura entro 10 min prima dell'esecuzione di citometria a flusso. - Analizzare mediante citometria a flusso (Vedi figure 1 e 2) all'interno dei seguenti 3 h. Se un tempo più lungo è richiesto, a breve termine fissazione utilizzando un paraformaldeide bassa concentrazione (0,5 – 1% in PBS) è consigliato per preservare la macchiatura.
Nota: Si consiglia di filtrare campioni attraverso un colino di cella di 40 µm prima dell'analisi di citometria a flusso avviare al fine di prevenire l'ostruzione della fluidica del citofluorimetro.
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Representative Results
Fin qui, nessun buon metodo è stato progettato per isolare le cellule immuni da altri componenti di cellula cardiaca, come cardiomiociti. Quindi, analisi della sospensione singola cellula cardiaca tramite flusso cytometry richiedono un pre-gating con CD45 per identificare le popolazioni delle cellule immuni, seguite dalla singola cella e piccola dimensione esclusione gating (Figura 1A). In alternativa, una vitalità colorazione possono essere effettuata per escludere le cellule morte. Esclusione di piccole dimensioni e attuabilità della tintura colorazione rappresentano metodi quasi equivalenti per escludere le cellule morte (Figura 1B e 1 D). Si consiglia vivamente di procedere con l'anticorpo che macchia presto dopo la procedura di digestione e mantenere sempre la sospensione cellulare a 4 ° C, come la vitalità delle cellule può decadere. Questa procedura è in genere produce circa 80 – 90% delle cellule immuni vitali.
Il miocardio ospita una variegata Colonia di cellule immunitarie, molti dei quali sono ancora in attesa di identificazione e caratterizzazione. Macrofagi, identificati come CD64+ le cellule, sono la principale popolazione immune del cuore, che rappresenta 60 – 70% di tutte le cellule immunitarie (Figura 1C, in alto). La digestione di un cuore murino adulto produce circa 3 – 5 x 104 macrofagi, a seconda delle dimensioni del cuore. Macrofagi cardiaci possono essere ulteriormente suddivisi basata sulla loro espressione di CD11c o CCR2 e i loro livelli di MHC-II2.
L'altre sottopopolazione immune cardiaca che è stata caratterizzata bene sono cellule dendritiche convenzionali. DCs convenzionali sono CD64– cellule quello intermedio espresso a livelli elevati di MHC-II e alti livelli di CD11c (Figura 1 C, in basso). Queste cellule possono essere ulteriormente suddivisa in base alla loro espressione di CD103 o CD11b8,9. DCs rappresentano una molto più piccola sottopopolazione cardiaca rispetto ai macrofagi. La digestione di un cuore murino adulto produce tra 150 e 500 DCs di ogni sottoinsieme.
L'aspersione del cuore con PBS freddo è essenziale nell'identificazione di popolazioni di cellule immunitarie all'interno del miocardio. Tuttavia, aspersione imperfetta può aumentare la quantità di contaminanti intravascolare dei campioni, che conduce a bias importante che può essere basata su cambiamenti periferici (sangue) piuttosto che cambiamenti cardiaci si infiltra in. In questi casi, la somministrazione intravascolare di anticorpi fluorescenti-labelled anti-CD45, che etichette tutte le cellule immunitarie che circola attraverso macro e microcircolo (Figura 2A), può aiutare a differenziare le cellule del miocardio da contaminanti intravascolare. Figura 2 B Mostra un esempio di un cuore imperfettamente irrorato in cui il 20% delle cellule immuni sono contaminanti intravascolare. D'importanza, questo livello di contaminazione ha poco effetto sul macrofago e analisi DC, dal momento che queste cellule sono trovate raramente nel sangue (Figura 2D).
L'uso di citometria a flusso di una sospensione di singola cellula del miocardio consente lo studio delle sottopopolazioni piccole del cuore. Ad esempio, la carenza del fattore di trascrizione BATF3 ha dimostrata di prevenire lo sviluppo di CD103 maturo+ DCs in parecchi tessuti11. Per studiare se questo vale anche nel caso del miocardio, sospensioni unicellulare di cellule cardiache da 8 – 15-settimana-vecchio BATF3-carenti o controllo littermates (in fondo C57BL/6) sono state analizzate mediante citometria a flusso. Dovuto le piccole dimensioni delle popolazioni e il numero di marcatori necessari per differenziare i sottoinsiemi di DC, istologia non avrebbe potuto fornire potenza sufficiente per l'analisi di raggiungere una risposta definitiva. Tuttavia, utilizzando l'analisi di citometria a flusso per confrontare le cellule immunitarie del miocardio di selvaggio-tipo contro un topi Batf3- / - , una mancanza di CD103+ DCs può essere confermata in quest'ultimo (Figura 3A e B). Inoltre, abbiamo osservato che BATF3-carenza non ha alterato significativamente la composizione delle altre popolazioni cardiache (Figura 3C e D). Questi risultati esemplificano il grado di sensibilità che può essere ottenuto utilizzando questo metodo combinato di digestione enzimatica e meccanica per ottenere una sospensione di singola cellula.
Figura 1 : Gating strategia per i macrofagi cardiaci e DCs. I cuori isolati dai topi C57BL/6 sono stati digeriti come descritto, e sospensione unicellulare è stata analizzata tramite flusso cytometry. (A) Gating di CD45 + live singoletto cellule cardiache. Utilizzare le etichette CD45 per identificare le cellule immuni dall'omogeneizzato cardiaco singola cella, che include molto alti livelli di cellule non immune (cioè, cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti). Escludere i doppietti confrontando SSC-H vs SSC-A seguito di FSC-H vs FSC-A. Nota: Qualsiasi altro confronto tra SSC-A, SSC-H e SSC-W o FSC-A, FSC-H e FSC-W sono allo stesso modo utile. Selezione delle celle in tensione può essere effettuata escludendo cellule molto piccole (cancello di SSC-H vs FSC-H). (B) confronto dell'esclusione di cellula morta utilizzando redditività vs dimensione macchiatura (DAPI). (C) Gating strategia per l'identificazione dei macrofagi cardiaci (CD11b+ CD64+ cellule) e DCs (CD64– MHC-IICiao CD11c+). Macrofagi cardiaci possono essere ulteriormente classificati basato sulla loro espressione di MHC-II e CD11c. DCs cardiaco può essere suddiviso il diagrammi rappresentativi (D) di DAPI + cellule morte all'interno del macrofago e DC basati sulla loro espressione di CD103 o CD11b. compartimenti dopo l'esclusione di piccole dimensioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Etichettatura di intravascolare delle cellule contaminanti. (A) confronto dell'intravascolare CD45 etichettatura dei neutrofili di anima e Ly6CCiao monociti in anticorpo anti-CD45 trattati (rosso) o topi non trattati (blu). (B) identificazione dei contaminanti intravascolare in una preparazione cardiaca mediante l'etichettatura CD45 intravascolare. (C) flusso rappresentante trame delle cellule del miocardio e intravascolare. (D) rappresentante appezzamenti di cellule identificate all'interno del macrofago e scomparti DC dopo amministrazione di i.v. di anti-CD45. Si noti che i macrofagi e DCs sono esclusivamente extravascular. Intravascolare contaminanti in genere sono i linfociti, monociti e neutrofili2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Quantificazione dei macrofagi cardiaci e DCs in topi carenti di BATF3. (A) tra gli appezzamenti di flusso rappresentativi di DCs cardiaco in Batf3+ + e Batf3- / - topi. (B) quantificazione della DCs cardiaco in Batf3+ + e Batf3- / - topi. Si noti l'assenza di CD103+ DCs in Batf3- / - topi. (C e D) quantificazione dei macrofagi cardiaci (MF) in Batf3+ + e Batf3- / - topi. Barre di errore rappresentano SEM. Red simboli rappresentano singoli animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Infiammazione del miocardio, o miocardite, è una caratteristica delle malattie cardiovascolari più. Tuttavia, il miocardio non è privo di propri componenti immuni negli Stati di non-malattia. Durante stato stazionario, molte cellule immunitarie risiedono nel miocardio e svolgono un ruolo essenziale di manutenzione e protezione. La caratterizzazione di queste diverse popolazioni di cellule non sarebbe stato possibile senza i metodi come quello presentato in questo protocollo.
Una combinazione di digestione meccanica ed enzimatica del miocardio consente l'isolamento di una sospensione di singola cellula che può essere utilizzata in combinazione con altri metodi di analisi, come l'isolamento di flusso cytometry o immunomagnetica perlina. Diverse considerazioni per quanto riguarda il presente metodo devono tener conto. In primo luogo, tutte le nostre analisi si riferiscono alle popolazioni all'interno del miocardio; escludiamo gli atri dalla nostra analisi come queste sono tessuti specializzati con proprie idiosincrasie. In secondo luogo, la quantità di enzimi utilizzati sono espressi come unità di attività per aiutare nell'organizzazione del digestioni usando gli enzimi da altre fonti. Tuttavia, ottimizzazione empirica della concentrazione finale di enzimi e il tempo di digestione è altamente raccomandato, come limita l'enzima può ridurre significativamente il rendimento delle celle e troppo digestione possa influenzare drasticamente la vitalità. In terzo luogo, il passaggio facoltativo che coinvolgono la somministrazione intravascolare di anticorpi coniugati è particolarmente indicato quando si studia popolazioni rari nel miocardio normale (ad esempio, linfociti, monociti e neutrofili)2 o in circostanze Quando i numeri delle popolazioni nel sangue possono cambiare (Monocitosi, Granulocitosi o linfocitosi) che può dare una falsa impressione di cambiamenti all'interno del miocardio che devono essere confermati mediante questo metodo o, in alternativa, la microscopia. Tuttavia, questo passo è di limitata utilità quando si analizzano i macrofagi o DCs maturo, come queste cellule sono trovate raramente in quantità significative nel sangue (Figura 2D). È importante ottimizzare la quantità di anticorpo amministrato e il tempo di incubazione prima di sacrificare il mouse, come a lungo termine incubazione può consentire per alcuni diffusione dell'anticorpo nel cuore, soprattutto in un miocardio infiammata. Infine, è molto importante essere meticoloso nell'isolamento del cuore, eliminando i resti delle principali arterie, vene e o qualunque altro tessuto, come il polmone. Questi tessuti di contaminante hanno altamente elevati numeri di cellule immunitarie che possono facilmente mascherare le popolazioni indigene del miocardio.
È molto importante eseguire l'esclusione delle cellule morte, se utilizzando coloranti di attuabilità o attraverso l'esclusione di piccole dimensioni durante l'analisi di citometria a flusso, come la digestione (o danno tissutale in modelli di malattia) può causare una quantità relativamente grande di cellule morte. Abbiamo confrontato l'efficienza di esclusione di cellula morta dimensioni e utilizzando un'etichetta di redditività (Figura 1B e D), dimostrando la loro equivalenza nei pressi. D'importanza, l'esclusione di dimensione non può essere utilizzato dopo la fissazione e la permeabilizzazione come questa procedura riduce notevolmente le dimensioni della cella.
Anche se autofluorescenza è raramente un problema per identificare cardiaci macrofagi mediante citometria a flusso, questo rappresenta un problema più importante quando si cerca di caratterizzare l'espressione di alcuni marcatori, soprattutto con fluorocromi eccitati da ad alta energia ( più breve) lunghezze d'onda luminose (350-500 nm). In questi esperimenti, è consigliabile utilizzare controlli di isotipo, evitare i laser blu e violetto (isotiocianato di fluoresceina, ficoeritrina, Pacific Blue/Brilliant Violet 421) e utilizzare fluorocromi con emissioni superiore a 600 nm, ad esempio allophycocyanin.
L'uso di protocolli come quello presentato qui stanno diventando sempre più importante in quanto un numero crescente di letteratura sta identificando il ruolo di intensità e tipo di infiammazione nella valutazione e che caratterizzano gli esiti della malattia cardiovascolare. Questo metodo consente livelli elevati di caratterizzazione delle cellule che l'istologia. Per esempio, l'utilizzo delle tracce di lignaggio ammessi per l'identificazione dello diversi sottoinsiemi di macrofagi con loro programmato diverse funzioni2. Allo stesso modo, questo metodo può essere usato per studiare le risposte delle cellule T durante l'infiammazione del miocardio e combinato con stimolazione ex vivo per studiare di polarizzazione delle cellule T8.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'istituti canadesi di ricerca sanitaria (148808 e 148792), SE è stata sostenuta da un Heart and Stroke Foundation, premio personale dall'ufficio provinciale di Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre per ricerca di cuore e Peter Munk Centro cardiaco. XCC detiene un Fellowship di Banting CIHR. LA tiene un cuore & Stroke/Richard Patricia Studentship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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