Summary
Этот протокол предоставляет простой и эффективный метод, чтобы изолировать, выявлять и количественно иммунные клетки, проживающих в миокарде мышей при установившемся или воспаления. Протокол сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение для поколения подвеска одну ячейку, которая может быть далее проанализирован подачей cytometry.
Abstract
Иммунная система является важным компонентом здорового сердца. Миокарда является домом для богатых населения различных иммунных клеток подмножеств с функциональной сегментации, как при стационарном, так и в ходе различных форм воспаления. До недавнего времени, исследование иммунных клеток в самом сердце требует использование микроскопии или слабо развита пищеварение протоколы, которые представили достаточно чувствительности во время тяжелое воспаление, но смогли уверенно выявить небольшие — но ключа — население клетки в стационарном состоянии. Здесь мы рассмотрим простой метод комбинирования ферментативный (коллагеназа, гиалуронидаза и DNAse) и механических переваривания мышиных сердца предшествует внутрисосудистого администрации дневно помечены антител к дифференцировать малые но неизбежным внутрисосудистые клеток загрязнений. Этот метод создает подвеска изолированных жизнеспособных клеток, которые могут быть проанализированы проточной цитометрии для идентификации, фенотипа и количественной оценки, или Далее очищенный с сортировки активирован флуоресценции клеток или разделения магнитный шарик для транскрипционный анализ анализ или в пробирке исследования. Мы включить пример анализа гранулярных пошаговые потока дифференцировать ключевых макрофаги и дендритные клетки населения сердца. Для среднего размера эксперимента (10 сердца) завершение процедуры требует 2-3 ч.
Introduction
Различные формы миокарда стресса или травмы, включая ишемического (ишемии-реперфузии или инфаркт миокарда) и не связанная с ИБС (гипертонии или миокардит), поощрять набор воспалительных клеток с репаративные и защитные, но и патогенные свойства. Еще в 1891 Ромберга впервые описал наличие клеточных инфильтратов в миокарде больных, инфицированных тифа и скарлатина1. Однако детальное изучение сердца иммунных клеток требует разработки методов более продвинутые Иммунофенотипирование. Как следствие только недавно мы начали понимать, что разнообразие населения иммунных клеток с важным поддержание роли при установившемся находится в миокарде.
Гистология был и до сих пор является наиболее распространенным методом характеризовать сердечной клетки иммунной системы во время воспаления. Однако хотя Гистологическая картина представляет собой ценный инструмент диагностики, его использование в изучении сердечной иммунных клеток имеет важные ограничения. Иммунные клетки, проживающих в миокарде представляют собой весьма незначительную часть общего числа клеток и более или менее равномерно распределены в пропорционально необъятный космос. Аналогично некоторые формы сердца воспаления, таких как вирусный миокардит, показывают координационных структур воспаления. Это означает, что точный анализ иммунной системы сердца часто требуют более высокой степени гистологической выборки, увеличивая стоимость снижения отклонений. Кроме того гистология обеспечивает очень ограниченное количество полезной информации в ячейки идентификации (например , количество параметров). С постоянно растущим числом подмножеств клеток, которые требуют использования нескольких маркеров выражение (в том числе поверхностных маркеров, факторы транскрипции или выделяется молекул) проточной цитометрии зарекомендовал себя как самый мощный инструмент для иммунофенотипирование, Благодаря низкой стоимости и высокой пропускной способности.
Использование методов Иммунофенотипирование тесно зависит от развития эффективного переваривания протоколов, разрешенных для одного клетки анализа большого числа клеток. Разработка исчерпывающие протоколы клетки добычи открыл новое окно возможностей в исследовании сердца иммунологии. Благодаря сочетанию пищеварение, проточной цитометрии и transcriptomics основных популяций макрофаги и дендритные клетки, проживающих в самом сердце были характерны2,3. Наиболее распространенным населения сердечной иммунных клеток во время устойчивого состояния являются CD64+MerTK+ макрофаги, которые могут быть далее разделены на основе их выражения CCR2 или CD11c2. CCR2+ макрофаги происходят от взрослого костного кроветворения, тогда как большинство из CCR2– макрофаги, которые выражают высокий или низкий уровень MHC-II, в основном дородовой происхождения. Макрофаги выполняют ключевые функции, такие как ремонт4 и удаления мусора5 во время травмы или поддержки электрические подключения6 в стационарном состоянии. Во время различных форм воспаления происходят важные приток Ly6CПривет MHC-IIЛо CD64int моноцитов, который позже дифференцироваться в Ly6CПривет CCR2+ макрофаги2,7 . Значительно меньше, но важно, популяция клеток, проживающих в миокарде здоровых людей состоит из дендритные клетки8,9. Два основных подмножества сердечной обычных DCs (cDCs) недавно характеризовались: cDC1 (CD103+ DCs) и cDC2 (CD11b+ DCs). РСУ играют важную роль в обороне против инфекции8 , но могут также способствовать самоповреждения во время воспаления, особенно во время инфаркта миокарда9.
Здесь мы опишем простой метод для изоляции жизнеспособных сердца иммунных клеток от мыши миокарда. Метод сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение с фильтрацией клетки фильтр для того, чтобы получить одну ячейку подвеска, которая может быть проанализирована, или неразделимая, поток цитометрии сортировки или магнитный шарик обогащения. Точные измерения внесосудистой клеток миокарда требуют сердца перфузии для удаления возможных загрязнений из крови сердца microvasculature. Кроме того мы представляем необязательный шаг внутрисосудистого маркировки иммунных клеток, которые могут использоваться для дальнейшего дифференцировать миокарда клетки от внутрисосудистого загрязняющих веществ, основанный на Галкина et al. протокол10. Наконец мы представляем основной поток cytometry анализ для выявления основных субпопуляций макрофагов и cDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: этот протокол был рассмотрен и утвержден Комитетом по уход животных на университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада) и в соответствии с канадского Совета по лечению животных.
1. буфер подготовка
- Подготовьте ГБД буфера (Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS), 2% тепла инактивированная бычьим сывороточным, 0,2% альбумина bovine сыворотки). Добавьте 10 мл тепла инактивированная бычьим сывороточным и 1 g бычьим сывороточным альбумином в 500 мл HBSS. Фильтр стерилизовать через фильтр 0.2 мкм и хранить при 4 ° C.
- Подготовка буфера СУИМ (фосфат буфер солевой раствор (PBS), 2% тепла инактивированная бычьим сывороточным, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, рН 8,0)). Добавьте 10 мл тепла инактивированная бычьим сывороточным и 1 мл раствора ЭДТА 0,5 М до 500 мл ФСБ. Фильтр стерилизовать через фильтр 0.2 мкм и хранить при 4 ° C.
Примечание: Решения могут храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца.
2. Маркировка циркулирующих лейкоцитов
- Асептически Подготовьте анти мыши CD45 введения с 1 мкг антител, разбавленных в стерильных фосфатный буфер (PBS) для окончательного инъекции объем 200 мкл/мыши. Эквивалентный объем в шприц инсулина 28,5 G и хранить вдали от света.
Примечание: Используйте два разных флюрохром, меченного анти CD45 антитела для того чтобы продифференцировать внутрисосудистый (витражи через и.в. администрации) от внутрисердечной окрашивания (витражи после переваривания; см. шаг 4). -
Предварительно теплой мышей (8-12 недель), подвергая хвост, чтобы лампа Красная жара за 5 мин.
Предупреждение: Не перегревать животного. Держите лампу на безопасном расстоянии (> 30 см).- Удержать животное в грудины позицию с помощью соответствующего устройства. Разоблачить и стабилизировать хвост с рукой недоминирующих, иммобилизирующие основание хвоста с индекс и средним пальцем и середине дистальной части региона хвост с большой палец и палец кольцо.
Предупреждение: Не применять слишком много сил на кончике хвоста как кожа может быть вытащил Выкл. Вставьте иглу с наклонной вверх в Вену. Держите иглы параллельно вен во все времена, как это легко для прокола Вены.
Примечание: Кровь, набора в шприц может произойти и является признаком хорошего инъекции. Изгиб иглу под углом в 90° может облегчить и.в. администрации. Подтвердите ваш офис безопасности как изгиб иглы могут представлять опасность. - Inject 200 мкл внутривенно в Вену хвост. Жидкость должна течь легко и временно снимите Вену.
Предупреждение: Не заставляйте жидкости в если сопротивление. Это признак неправильного иглы. - Разрешить антитела распространить за 5 мин до гуманно euthanizing мыши.
- Удержать животное в грудины позицию с помощью соответствующего устройства. Разоблачить и стабилизировать хвост с рукой недоминирующих, иммобилизирующие основание хвоста с индекс и средним пальцем и середине дистальной части региона хвост с большой палец и палец кольцо.
3. сердце изоляции и пищеварение
-
Усыпить мышей с использованием CO2 или другие процедуры институционально признанных эвтаназии.
- Для CO2 эвтаназии поместите указатель мыши в камере CO2 и установите скорость заполнения до 20% объема камеры в минуту (т.е., если палата-10 Л, заполните 2 Л/мин). Запуск монитора и 2 мин мыши пока перестала дышать.
- Выключить CO2 и оставьте мышь для дополнительных 1-2 мин обеспечить дыхание прекратила перед открытием камеры и выполняют мыс Пинч, чтобы подтвердить, что мышь мертв прежде для обработки мыши.
- Спрей мыши с 70% этиловом спирте. Снять кожу на животе и вскрыть мыши путем разрезания вдоль вентральной срединной начала на уровне бедер до грудины. Откройте живота и переместить печени подвергать диафрагмы.
-
Вырежьте диафрагмы, то ребра по обе стороны от средней линии, стараясь избежать проколов в легких и сердце.
- Разоблачение сердца, пилинг назад ребра, а затем вырезать первой левого предсердия следуют правый предсердий.
ВНИМАНИЕ: Соблюдайте осторожность при резки предсердия, обеспечивая не артерий или вен получают травмы, как это может снизить эффективность промывки крови, содержащиеся в органах. - Perfuse сердце с 15 – 20 мл холодного PBS с помощью 60 мл шприца с иглой 21 G и холодной PBS. Аккуратно понять основание сердца с щипцами и вставить иглу в левый желудочек вблизи верхушки. Повторите эту процедуру в правый желудочек. Надлежащего инъекции приводит к белым легких и бледно печени.
Примечание: Перфузии должны выполняться в течение 5 минут после эвтаназии избежание свертывающей системы крови, которые могут загрязнять органов интерес с циркулирующих клеток.
- Разоблачение сердца, пилинг назад ребра, а затем вырезать первой левого предсердия следуют правый предсердий.
-
Удерживайте основание сердца с щипцами и осторожно потяните сердце, а затем отсоединить сердце путем разрезания основных легочных артерий и вен, аорта и перикарда мешок.
- Очистите сердце нежно держит сердце между большим и указательным пальцами в чистой безворсовой салфеткой и стащить предсердия и остатки крупных артерий и вен и любых других загрязнений с щипцами.
Примечание: Убедитесь, удаляется полностью предсердия и другие ткани, например легких или кровеносных сосудов, присутствуют как эти ткани имеют свои собственные резидентов иммунных клеток. Легких в частности имеет большой иммунных клеток населения, что может маскировать небольших популяций в миокарде.
- Очистите сердце нежно держит сердце между большим и указательным пальцами в чистой безворсовой салфеткой и стащить предсердия и остатки крупных артерий и вен и любых других загрязнений с щипцами.
-
Место сердце в 5 см пластиковые блюдо с 50 мкл холодной PBS.
- Фарш сердца, с использованием рассечения изогнутые ножницы до тех пор, пока есть без видимых частей и имеет гладкой консистенции.
Примечание: Попробуйте держать сердце в автономной области блюдо во время измельчения для сведения к минимуму потерь ткани. - Передачи thetrituratedheart ткани с помощью Изогнутый пинцет в 2-мл пробирку microcentrifuge с 800 мкл холодной Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM).
- Фарш сердца, с использованием рассечения изогнутые ножницы до тех пор, пока есть без видимых частей и имеет гладкой консистенции.
-
Добавить 450 ед/мл ofcollagenase I, 60 ед/мл гиалуронидазы типа I-s и 60 ед/мл DNase-I к каждому образцу.
- Проинкубируйте образцы при 37 ° C на качалки шейкер на 50 об/мин за 45-60 мин.
-
После переваривания, кратко вихревой образцов (20 s) и сразу же место на льду хранить пробы при 4 ° C.
- С помощью 1 мл дозаторов, Пипетка образцы вверх и вниз до тех пор, пока образцы тканей являются однородными и не засорять наконечник пипетки.
Примечание: Определение определенное количество раз для Пипетка может увеличить воспроизводимость. Если сердца не перевариваются оптимально, куски миокарда может препятствовать пипеткой. Аккуратно шлифовальный наконечник пипетки против пробки microcentrifuge поможет гомогенизировать большие куски ткани.
- С помощью 1 мл дозаторов, Пипетка образцы вверх и вниз до тех пор, пока образцы тканей являются однородными и не засорять наконечник пипетки.
-
Предварительно Намочите стрейнер клеток 40 мкм, размещены на 50 мл Конические трубки с 1 мл холодного ГБД.
- Добавление фильтра гомогенизированных образцов и мыть через, медленно поливая 12 – 14 мл холодного ГБД.
- Передача образцов отфильтрованного помечены 15 мл конические и хранить при 4 ° C.
-
Центрифуга образцы на 400 x g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная покинуть супернатант.
- Лизируйте красных кровяных клеток, добавив 1 мл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK) для каждого образца. Ресуспензируйте образцов, vortexing и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- После завершения лизиса, добавьте 5-8 мл из холодной Хэнк сбалансированный соли раствора (HBSS) остановить гемолиза.
- Центрифугуйте образцы на 400 x gfor 5 мин при 4 ° C. Аспирационная покинуть супернатант.
- Добавьте 1 mL СУИМ буфера для каждого образца и передачи пробки microcentrifuge маркировкой 1,5 мл.
Примечание: Протокол может быть приостановлен здесь до 2 ч с образцами хранить при 4 ° C.
4. поток цитометрии окрашивание и анализ
-
Центрифуга образцы на 400 x g 5 мин при 4 ° C.
- Чтобы уменьшить неспецифической антитела связывая, развести 1: 100 анти CD16/CD32 и Моноцит блокатор (1:20) бухгалтерского учета (см. Таблицу материалов) для 50 мкл СУИМ на сэмпл. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Подготовка антител разрежения (1: 250 для каждого антитела) приходится 50 мкл на сэмпл СУИМ.
Примечание: Краска жизнеспособности могут быть включены в коктейль антитела для того чтобы исключить мертвые клетки. Кроме того небольшой размер исключение анализа потока может быть (рис. 1C и D). - Без стирки, добавьте 50 мкл антител мастер смеси для каждой выборки и перемешать.
- Проинкубируйте образцы на 4 ° C на 30 мин в темноте.
- Добавить 600 мкл СУИМ для каждого образца, чтобы умыться и Центрифугуйте образцы на 400 x g 5 мин при 4 ° C.
- Аспирационная покинуть супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 300 мкл СУИМ. Храните пробы на 4 ° C в темноте.
Примечание: Некоторые жизнеспособности красителей, например DAPI, требуют окраски в течение 10 минут перед запуском проточной цитометрии. - Анализировать подачей cytometry (см. рисунки 1 и 2) в течение следующих 3 ч. Если больше времени требуется, короткий срок фиксации с помощью параформальдегида низкой концентрации (0.5-1% в PBS) рекомендуется сохранить пятнать.
Примечание: Настоятельно рекомендуется для фильтрации проб через стрейнер клеток 40 мкм до запуска потока cytometry анализ во избежание препятствий fluidics проточный цитометр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На сегодняшний день, не хороший метод был разработан для изолировать иммунных клеток от других компонентов сердечной клетки, например кардиомиоцитов. Следовательно анализ сердца одноклеточного подвеска подачей cytometry требует предварительно стробирования с CD45 для идентификации населения иммунных клеток, следуют одной ячейки и малый размер исключения шлюзовые (рис. 1A). Кроме того жизнеспособность пятнать может выполняться исключить мертвые клетки. Малый размер изоляции и жизнеспособности краски для окрашивания представляют практически эквивалентные методы исключить мертвые клетки (рис. 1B и 1 D). Настоятельно рекомендуется продолжить антитело пятная вскоре после процедуры пищеварение и всегда держать суспензию клеток на 4 ° C, как жизнеспособность клеток может распадаться. Эта процедура обычно дает около 80 – 90% жизнеспособных иммунных клеток.
Миокард домов колонии различных иммунных клеток, многие из которых по-прежнему ожидающих идентификации и квалификации. Макрофаги, определены как CD64+ клетки, являются крупные иммунитета населения сердца, составляет 60 – 70% всех иммунных клеток (рис. 1C, топ). Пищеварение взрослых мышиных сердца дает о 3 – 5 х 104 макрофагов, в зависимости от размеров сердца. Сердца макрофаги можно далее подразделить на основе их выражение CD11c или CCR2 и их уровень MHC-II-2.
Другие сердца иммунной субпопуляция, которая характеризуется хорошо являются обычными дендритных клеток. Обычные DCs, CD64– клетки что Экспресс среднего до высокого уровня MHC-II и высокий уровень CD11c (рис. 1 C, внизу). Эти клетки можно далее подразделить на основании их выражение CD103 или CD11b8,9. РСУ представляют гораздо меньше сердечных субпопуляции по сравнению с макрофагами. Пищеварение взрослых мышиных сердца дает между 150 и 500 DCs каждого подмножества.
Перфузия сердца с холодной PBS имеет важное значение при идентификации иммунных клеток населения в миокарде. Однако несовершенной перфузии может увеличить количество внутрисосудистого загрязняющих веществ в пробах, приводит к важным предубеждение, что может быть основано на периферические изменения (кровь) вместо изменения в сердечной инфильтратов. В этих случаях внутрисосудистого администрации антител флуоресцентные помечены анти CD45, которая этикетки всех иммунных клеток, циркулирующей через макро - и microvasculature (рис. 2А), может помочь дифференцировать миокарда клетки от внутрисосудистые загрязнений. Рисунок 2 B показывает пример несовершенной перфузии сердца, в котором 20% иммунных клеток являются внутрисосудистого загрязнений. Важно отметить, что этот уровень загрязнения мало влияет на макрофагов и DC анализ, так как эти клетки редко встречаются в крови (Рисунок 2D).
Использование проточной цитометрии подвески одной клетки миокарда позволяет для изучения малых субпопуляций сердца. Например, дефицит фактора транскрипции BATF3 было показано для предотвращения развития зрелой CD103+ РСУ в нескольких тканей11. Для того, чтобы учиться, если это также верно в случае сердечной мышцы, одну ячейку суспензий клеток сердца от 8 – 15-недельных BATF3-недостаточным или управления однопометники (в фоновом режиме C57BL/6) были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Ввиду небольшой численности и количество маркеров, необходимо дифференцировать DC подмножеств Гистология может не предоставили достаточно мощности для анализа для достижения окончательного ответа. Однако, используя cytometry анализ потока для сравнения иммунные клетки миокарда одичал типа по сравнению с Batf3- / - мышей, отсутствие CD103+ РС может быть подтверждено в последнем (рис. 3A и B). Кроме того мы наблюдали, что BATF3-дефицит существенно не изменит состав других сердечных населения (рис. 3C и D). Эти результаты отражают степень чувствительности, что может быть достигнуто с помощью этот комбинированный метод ферментных и механических пищеварения для достижения одной ячейки подвеска.
Рисунок 1 : Стробирования стратегия для сердца макрофагов и DCs. Изолированных сердец от мышей C57BL/6 были осмыслены как описано, и одну ячейку подвеска был проанализирован проточной цитометрии. (A) Gating CD45 + живой синглетно сердечных клеток. Используйте CD45 маркировки для выявления иммунных клеток от сердца одноклеточного огневки, который включает в себя очень высокий уровень-иммунных клеток (то есть, кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов). Исключить Дуплеты сравнивая SSC-H против SSC-A следуют FSC-H против FSC-A. Примечание: Любые другие сравнение между SSC-A, SSC-H и SSC-W или FSC-A, FSC-H и FSC-W также полезны. Выбор живых клеток может выполняться путем исключения очень маленькие клетки (SSC-H против FSC-H ворота). (B) сравнение мертвые клетки исключения с помощью размер против жизнеспособности окрашивание (DAPI). (C) стробирование стратегии для идентификации сердца макрофагов (CD11b+ CD64+ клеток) и DCs (CD64– MHC-IIПривет CD11c+). Сердца макрофаги могут быть далее классифицированы на основе их выражения MHC-II и CD11c. сердечной DCs можно подразделить на основе их выражения CD103 или CD11b. (D) представитель участки DAPI + мертвых клеток внутри макрофагов и DC отсеков после исключения небольшого размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Маркировки внутрисосудистого клетки загрязнений. (A) сравнение внутрисосудистого CD45 маркировки крови нейтрофилы и Ly6CПривет моноцитов в антитела анти CD45 лечение (красный) или не лечить (синий) мышах. (B) выявление внутрисосудистого загрязняющих веществ в сердечной подготовки путем внутривенных вливаний CD45 маркировки. (C) представитель потока участки миокарда и внутрисосудистого клеток. (D) представитель участки маркированных клеток внутри макрофагов и DC отсеков после анти CD45 и.в. администрации. Обратите внимание, что макрофаги и DCs исключительно внесосудистой. Внутрисосудистые загрязнители обычно являются лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Количественная оценка сердечной макрофагов и DCs в BATF3-недостаточным мышей. (A) представитель потока участки сердечной DCs в Batf3+/ + и Batf3- / - мышей. (B) количественная оценка сердечной DCs в Batf3+/ + и Batf3- / - мышей. Обратите внимание на отсутствие CD103+ РСУ в Batf3- / - мышей. (C и D) количественная оценка сердечной макрофагов (MF) в Batf3+/ + и Batf3- / - мышей. Планки погрешностей представляют SEM. красной символы представляют отдельных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воспаление миокарда или миокардит, функция наиболее сердечно-сосудистых заболеваний. Однако миокард не лишена своих собственных иммунной компонентов в государствах, не болезнь. При устойчивом состоянии многие иммунные клетки находятся в миокарде и играть существенно важную роль поддержания и защиты. Характеристика этих различных популяциях клеток не было бы возможным без такие методы, как в настоящем Протоколе.
Сочетание механических и ферментативного пищеварения миокарда позволяет изолировать одну ячейку подвеска, которая может использоваться в сочетании с другими методами анализа, таких как поток цитометрии или иммуномагнитная шарик изоляции. Необходимо учитывать ряд соображений относительно нынешнего метода. Во-первых все из нашего анализа относятся к населению в миокарде; Мы исключаем предсердия из нашего анализа как эти специализированные тканей с свои собственные особенности. Во-вторых количество ферментов, используемых выражаются в виде единиц активности, чтобы помочь в настройке пищеварения, используя ферменты из других источников. Однако эмпирической оптимизации конечная концентрация ферментов и время пищеварения рекомендуется, как ограничения фермента может значительно снизить доходность клеток и слишком много пищеварение может существенно повлиять на жизнеспособность. В-третьих необязательный шаг с участием внутрисосудистого администрации антител, меченных особенно рекомендуется при изучении редко населения в нормальной миокарда (например, лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов)2 или в условиях когда количество населения в крови может измениться (моноцитоз, гранулоцитоз или лимфоцитоз) которая может дать ложное представление о изменения в миокарде, который должен быть подтвержден с помощью этого метода или, альтернативно, микроскопии. Однако этот шаг имеет ограниченную полезность при анализе макрофаги или Зрелые DCs, как эти клетки редко встречаются в значительных количествах в крови (Рисунок 2D). Важно оптимизировать количество антител в ведении и время инкубации до жертвуя мыши, как длительный срок инкубации может позволить для некоторых антитела диффузии в сердце, особенно в воспаление миокарда. Наконец очень важно быть дотошный в изоляции сердца, устраняя остатки крупных артерий, вен и/или любые другие ткани, например легких. Эти ткани загрязнителем подняли высоко количество иммунных клеток, которые можно легко замаскировать миокарда коренного населения.
Это очень важно для выполнения исключения мертвых клеток, ли с помощью красителей жизнеспособности или через небольшой размер исключения во время анализа цитометрия потоков, как пищеварение (или повреждение тканей в моделях болезни) может привести к относительно большое количество отмерших клеток. Мы сравнили эффективность изоляции мертвые клетки, размер и используя метку жизнеспособности (Рисунок 1B и D), демонстрируя их вблизи эквивалентности. Важно отметить, что размер исключение не может использоваться после фиксации и permeabilization как эта процедура значительно уменьшает размер ячейки.
Хотя аутофлюоресценция редко является проблемой для выявления сердечной макрофагов с помощью проточной цитометрии, это представляет более важной проблемой при попытке характеризовать выражением некоторых маркеров, особенно с флуорохромов возбужденных высокой энергии ( короче) длинах волн света (350-500 Нм). В этих экспериментах, настоятельно рекомендуется использовать изотипа контроля, избежать синие и фиолетовые лазеры (флуоресцеин Изотиоцианаты, фикоэритрин, Pacific Blue/бриллиант фиолетовый 421) и использовать флуорохромов с выбросы выше 600 Нм, например аллофикоцианин.
Использование протоколов как представленные здесь становятся все более важное значение, поскольку все большее количество литературы является определение роли интенсивности и тип воспаления в оценке и характеристике итоги сердечно-сосудистых заболеваний. Этот метод позволяет более высокие уровни характеристик клетки чем гистологии. Например использование трассировки линии для идентификации ontogenically разные подмножества макрофагов с их запрограммированных различные функции2. Аналогичным образом этот метод может используется для изучения ответов Т-клеток во время миокарда воспаления и в сочетании с ex vivo стимуляции для изучения поляризации клеток T8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (148808 и 148792), SE был поддержан сердца и инсульта Фонда, персонала награду от администрация провинции Онтарио, марта Dimes, Тед Роджерс центр исследований сердца и Питер Мунк Сердечный центр. XCC проводит КНИИЗ Banting стипендий. LA проводит сердца и инсульта/Ричард Lewar студенчество премии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
