Summary
Detta protokoll presenterar en enkel och effektiv metod för att isolera, identifiera och kvantifiera immunceller som är bosatta i myokardiet möss under steady-state eller inflammation. Protokollet kombinerar enzymatisk och mekanisk matsmältningen för generering av en enda cellsuspension som ytterligare kan analyseras med flödescytometri.
Abstract
Immunförsvaret är en viktig komponent i ett friskt hjärta. Hjärtmuskeln är hem för en rik population av olika immunceller undergrupper med funktionell uppdelning under steady-state och olika former av inflammation. Tills nyligen, studiet av immunceller i hjärtat krävs användning av mikroskopi eller dåligt utvecklad matsmältning-protokollen, som tillhandahålls tillräckligt känslighet under svår inflammation men kunde inte tryggt identifiera små — men nyckel — populationer av celler under steady-state. Här diskuterar vi en enkel metod kombinerar enzymatisk (kollagenas, hyaluronidas och DNAse) och mekanisk nedbrytning av murina hjärtan föregås av Intravaskulär administrering av fluorescently-märkta antikroppar att skilja liten men oundvikliga intravaskulära cell föroreningar. Metoden genererar en suspension av isolerade viabla celler som kan analyseras med flödescytometri för identifiering, fenotypning och kvantifiering, eller ytterligare renas med fluorescens-aktiverad cell sortering eller magnetiska pärla separation för transkriptionell analys eller in vitro- studier. Vi har ett exempel på en stegvisa flöde flödescytometrisk analys att skilja de viktiga makrofager och dendritiska cellpopulationer av hjärtat. För en medellång medelstora experiment (10 hjärtan) kräver avslutningen av förfarandet 2 – 3 h.
Introduction
Olika former av hjärtinfarkt stress eller skada, inklusive ischemisk (ischemi reperfusion eller hjärtinfarkt) och icke-ischemisk (hypertoni eller myokardit), främja rekrytering av inflammatoriska celler med reparerande och skyddande, men också patogena egenskaper. Så tidigt som 1891, beskrev Romberg först förekomsten av cellulära infiltrat i myokardiet patienter smittade med tyfus och scharlakansfeber1. Den detaljerade studien av hjärt immunceller krävs dock utvecklingen av mer avancerade immunophenotyping tekniker. Följaktligen, har nyligen vi börjat förstå att en mångskiftande befolkningen av immunceller med nödvändigt underhållsarbete roller under steady-state är bosatt inom myokardiet.
Histologi har varit, och fortfarande är den vanligaste metoden att karakterisera hjärt immunceller vid inflammation. Men medan histologi representerar ett värdefullt diagnostiskt verktyg, har dess användning i studien av hjärt immunceller viktiga begränsningar. Immuncellerna bosatta i myokardiet utgör en mycket liten andel av de totala cellerna och är mer eller mindre jämnt fördelade i ett proportionellt enorma utrymme. Likaså visar flera former av hjärt inflammation, till exempel viral myokardit, focal mönster av inflammation. Detta innebär att korrekt analys av immunsystemet hos hjärtat ofta kräver högre grader av histologisk provtagning, ökar kostnaden för att minska bias. Dessutom ger histologi en mycket begränsad mängd användbara informationen i cell identifiering (t.ex. antal parametrar). Med ett ständigt ökande antal cell delmängder som kräver användning av flera uttryck markörer (inklusive yta markörer, transkriptionsfaktorer eller utsöndras molekyler), har flödescytometri etablerat sig som det mest kraftfulla verktyget för immunophenotyping, på grund av låga kostnader och hög genomströmning.
Användningen av immunophenotyping metoder är nära beroende av utvecklingen av effektiv matsmältning protokoll som tillåts för singel-celler analys av stort antal celler. Utvecklingen av uttömmande protokoll av cell utvinning öppnas ett nytt fönster av möjligheter i studien av hjärt immunologi. Genom kombinationen av matsmältningen, flödescytometri och transkriptomik varit de stora populationerna av makrofager och dendritiska celler som bor i hjärtat kännetecknas2,3. Den vanligast förekommande befolkningen av hjärt immunceller under steady-state är CD64+MerTK+ makrofager, som kan delas upp ytterligare baserat på deras uttryck för CCR2 eller CD11c2. CCR2+ makrofager kommer från vuxen benmärg blodbildning, medan majoriteten av CCR2– makrofager, som kan uttrycka höga eller låga nivåer av MHC-II, är främst av prenatal ursprung. Makrofager utför viktiga funktioner såsom reparation4 och avlägsnande av skräp5 under skada eller stödja elektrisk anslutning6 i steady state. Under olika former av inflammation en viktig tillströmning av Ly6CHej MHC-IIlo CD64int monocyter uppstå, som senare differentieras till Ly6CHej CCR2+ makrofager2,7 . En betydligt mindre, men viktiga, population av celler som är bosatta i hjärtmuskeln hos friska individer består av dendritiska celler8,9. Två stora delmängder av hjärt konventionella DCs (CDC) har karaktäriserats nyligen: cDC1 (CD103+ DCs) och cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spelar viktiga roller i försvar mot infektion8 men kan också främja självskadebeteende vid inflammation, särskilt under hjärtinfarkt9.
Här, beskriver vi en enkel metod för isolering av livskraftiga hjärt immunceller från mus myokardiet. Metoden kombinerar enzymatisk och mekanisk matsmältningen med en cell-SIL filtrering för att erhålla en enda cellsuspension som kan analyseras eller ytterligare renas, av flöde flödescytometri sortering eller magnetiska pärla anrikning. Noggranna mätningar av extravaskulära hjärtmuskelceller kräver hjärt perfusion för att ta bort eventuella föroreningar från blodet av den kardiella mikrocirkulation. Dessutom presenterar vi ett valfritt steg av intravaskulär märkning av immunceller som kan användas för att ytterligare differentiera hjärtmuskelceller från intravaskulär föroreningar, baserat på Galkina et al. protokoll10. Slutligen presenterar vi en grundläggande flöde flödescytometri analys för att identifiera stora makrofag och cDC subpopulationsna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: detta protokoll har granskats och godkänts av Animal Care kommitté vid the University Health Network (Toronto, Kanada) och uppfyller kraven i kanadensiska rådet om djur vård.
1. buffert förberedelse
- Förbereda HBB buffert (Hank's Balanced Salt lösning (HBSS), 2% värme inaktiverat bovint serum, 0,2% bovint serumalbumin). Tillsätt 10 mL av värme inaktiverat bovint serum och 1 g av bovint serum albumin till 500 mL HBSS. Filter sterilisera genom ett 0,2 µm filter och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda FACS buffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 2% värme inaktiverat bovint serum, 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA, pH 8,0)). Tillsätt 10 mL värme inaktiverat bovint serum och 1 mL 0,5 M EDTA till 500 mL PBS. Filter sterilisera genom ett 0,2 µm filter och förvaras vid 4 ° C.
Obs: Lösningar kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 månad.
2. märkning av cirkulerande leukocyter
- Aseptiskt förbereda antimus CD45 injektion med 1 µg av antikropp utspätt i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för en slutlig injektionsvolym av 200 µL/mus. Ladda volym i en 28,5 G insulinspruta och hålla borta från ljus.
Obs: Använd två olika fluorokrom-märkt anti-CD45 antikroppar för att skilja den intravaskulära (färgas genom i.v. administration) från intrakardiellt färgningen (målat efter matsmältningen, se steg 4). -
Pre varma möss (8 – 12 veckor gamla) genom att exponera svansen för att en röd värmelampa för 5 min.
Varning: Inte överhettas djuret. Hålla lampan på ett säkert avstånd (> 30 cm).- Hindra djuret i sternala position med hjälp av lämplig anordning. Exponera och stabilisera svansen med den icke-dominanta handen genom immobilisera basen av svansen med index och middle finger och regionen mid-distala i svansen med tummen och ringfingret.
Varning: Använd inte för mycket kraft på spetsen av svansen som huden kan dras av. För in nålen med avfasningen uppåt in i venen. Håll nålen parallellt till ven hela tiden eftersom det är lätt att punktera venen.
Obs: Blod kommer in i sprutan kan uppstå och är ett tecken på en bra injektion. Böja nålen till 90° vinkel kan underlätta i.v. administration. Bekräfta med din säkerhet office som bockning nålar kan utgöra en fara. - Injicera 200 µL intravenöst i svansen venen. Vätskan ska flyta lätt och tillfälligt rensa venen.
FÖRSIKTIGHET: Tvinga inte vätska i om motstånd är uppfyllda. Detta är tecken på felplacering av nålen. - Tillåta antikropp att cirkulera i 5 min innan humant euthanizing mus.
- Hindra djuret i sternala position med hjälp av lämplig anordning. Exponera och stabilisera svansen med den icke-dominanta handen genom immobilisera basen av svansen med index och middle finger och regionen mid-distala i svansen med tummen och ringfingret.
3. hjärtat isolera och matsmältning
-
Euthanize möss använder CO2 eller andra institutionellt accepterade dödshjälp förfarande.
- För CO2 eutanasi, Placera musen i CO2 kammaren och ange fyllning till 20% av volymen per minut (dvs., om kammaren är 10 L, fylla på 2 L/min). Köra 2 min och ordningsmanen mus tills andningen upphört.
- Stänga av CO2 och lämnar musen för en ytterligare 1-2 min. Säkerställ andning har upphört innan du öppnar kammaren och utföra en tå nypa för att bekräfta musen är död innan du fortsätter att bearbeta musen.
- Spray musen med 70% etanol. Lyfta huden på buken och dissekera musen genom att skära längs ventrala mittlinjen början på nivån för höfterna upp till bröstbenet. Öppna buken och flytta levern att exponera membranet.
-
Skär membranet, då revbenen på båda sidor om mittlinjen, är noga med att undvika punktering lungor och hjärta.
- Exponera hjärtat av peeling tillbaka på revbenen och sedan klippa första vänster atria följt av rätt förmaken.
Varning: Var försiktig när du klipper förmaken, garanterar inga artärer eller vener är skadade, eftersom detta kan minska effektiviteten av spolning blodet i organen. - BEGJUTA hjärtat med 15 – 20 mL kall PBS med en 60 mL spruta med en 21 G nål och kalla PBS. Försiktigt ta tag i bas av hjärtat med pincett och stick in nålen i den vänstra ventrikeln nära spetsen. Upprepa proceduren i höger kammare. En ordentlig injektion resulterar i vita lungor och blek lever.
Obs: Perfusion bör utföras inom 5 minuter efter dödshjälp för att undvika koagulation, som kan förorena organ av intresse med cirkulerande celler.
- Exponera hjärtat av peeling tillbaka på revbenen och sedan klippa första vänster atria följt av rätt förmaken.
-
Hålla basen av hjärtat med pincett och försiktigt dra hjärtat upp och sedan ta loss hjärtat genom att skära de stora pulmonell artärerna och vener, aorta och perikardiell säcken.
- Rengöra hjärtat genom att försiktigt hålla hjärtat mellan tummen och pekfingret i en ren luddfri pappershandduk och dra bort atria och rester av stora artärer och vener och några andra föroreningar med pincett.
Observera: Kontrollera helheten av förmaken tas bort och inga andra vävnader, såsom lungan eller blodkärl, är närvarande som dessa vävnader har sin egen hemvist immunceller. Lungan har särskilt stora immunceller som kan maskera de mindre populationerna av de inom myokardiet.
- Rengöra hjärtat genom att försiktigt hålla hjärtat mellan tummen och pekfingret i en ren luddfri pappershandduk och dra bort atria och rester av stora artärer och vener och några andra föroreningar med pincett.
-
Placera mitt i en 5 cm plast skålen med 50 µL kallt PBS.
- Finhacka hjärtat med böjda dissekera saxen tills det finns inga synliga bitar och det har en slät konsistens.
Obs: Försök att hålla hjärtat i en innesluten område i skålen under hugga för att minimera vävnad förlust. - Överföra thetrituratedheart vävnad med hjälp av böjda pincetten i 2 mL mikrocentrifug rör med 800 µL kallt Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM).
- Finhacka hjärtat med böjda dissekera saxen tills det finns inga synliga bitar och det har en slät konsistens.
-
Lägg till 450 U/mL ofcollagenase jag 60 U/mL hyaluronidas typ jag-S och 60 U/mL DNAS-I till varje prov.
- Inkubera prover vid 37 ° C i en gungande shaker vid 50 rpm för 45 – 60 min.
-
Efter matsmältningen, kort vortex prover (20 s) och placera omedelbart på isen att hålla prover vid 4 ° C.
- Använder vi rekommenderar att en 1 mL, pipett prover upp och ner tills vävnadsprover är homogen och inte täppa pipettspetsen.
Obs: Definiera ett visst antal gånger att Pipettera kan öka reproducerbarhet. Om hjärtan inte är optimalt smält, kan bitar av hjärtmuskeln hindra pipetten. Försiktigt slipning pipettspetsen mot mikrocentrifug röret hjälper homogenisera större bitar av vävnad.
- Använder vi rekommenderar att en 1 mL, pipett prover upp och ner tills vävnadsprover är homogen och inte täppa pipettspetsen.
-
Förväg blöta en 40 µm cell SIL placeras på en 50 mL konisk rör med 1 mL kall HBB.
- Lägga till homogeniserade provet i filtret och tvätta igenom genom att sakta hälla 12 – 14 mL kall HBB.
- Överföra filtrerade prover till ett märkta 15 mL koniska rör och hålla vid 4 ° C.
-
Centrifugera proverna vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Aspirera av supernatanten.
- Lysera röda blodkroppar genom att tillsätta 1 mL lyseringsbuffert Ammonium-klorid-kalium (ACK) till varje prov. Omsuspendera prover av vortexa och odla i rumstemperatur i 5 min.
- När Lys har slutförts, lägga till 5 – 8 mL av kall Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) att stoppa hemolys.
- Centrifugera proverna på 400 x gTill 5 min vid 4 ° C. Aspirera av supernatanten.
- Tillsätt 1 mL FACS buffert till varje prov och överför till en märkta 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: Protokollet kan pausas här för upp till 2 h med prover lagras vid 4 ° C.
4. flöde flödescytometri färgning och analys
-
Centrifugera proverna vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- För att minska icke-specifik antikropp bindande, späd 1: 100 anti-CD16/CD32 och monocyt Blocker (1:20) (se Tabell för material) redovisning av 50 µL FACS per prov. Odla i rumstemperatur i 15 min.
- Förbereda den antikropp utspädning (1: 250 för varje antikropp) står för 50 µL av FACS per prov.
Obs: Livskraft färgämne kan ingå i antikroppen cocktail för att utesluta döda celler. Liten storlek uteslutning av Flödesanalys kan alternativt vara används (figur 1C och D). - Utan tvätt, tillsätt 50 µL av antikropp master mix för varje provtagning och blanda.
- Inkubera prover vid 4 ° C i 30 min i mörker.
- Lägga till 600 µL FACS i varje prov att tvätta och centrifugera proverna vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Uppsugning av supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 µL FACS. Hålla prover vid 4 ° C i mörker.
Obs: Vissa livskraft färgämnen, såsom DAPI, kräver färgning inom 10 min innan du kör flödescytometri. - Analysera med flödescytometri (se figurerna 1 och 2) inom nästa 3 h. Om en längre tid är krävs, kort sikt fixering med hjälp av en låg koncentration PARAFORMALDEHYD (0,5 – 1% i PBS) rekommenderas att bevara färgning.
Obs: Det rekommenderas starkt att filtrera prover genom en 40 µm cell SIL före initiera Flödesanalys flödescytometri för att förhindra obstruktion av flödesteknik av en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hittills har har ingen bra metod utformats för att isolera immunceller från andra kardiella cell komponenter, såsom hjärtmuskelcellerna. Analysen av hjärt enda cellsuspension av flödescytometri kräver därför en pre gating med CD45 att identifiera immunceller befolkningarna, följt av enskild cell och liten storlek utslagning Usenets (figur 1A). En livskraft färgning kan alternativt utföras för att utesluta döda celler. Liten storlek utslagning och livskraft färgämnet färgning representerar nästan motsvarande metoder att utesluta döda celler (figur 1B och 1 D). Det rekommenderas starkt att fortsätta med antikroppen färgning snart efter förfarandet för matsmältningen och alltid hålla cellsuspension vid 4 ° C, som cellerna livskraft kan förfalla. Detta förfarande ger vanligtvis ungefär 80 – 90% av livskraftiga immunceller.
Myokardiet hus en mångsidig koloni av immunceller, av vilka många är fortfarande väntande identifiering och karakterisering. Makrofager, identifierats som CD64+ celler, är stora immun befolkningen i hjärtat, vilket motsvarar 60 – 70% av alla immunceller (figur 1C, överst). Rötning av en vuxen murina hjärtat ger om 3 – 5 x 104 makrofager, beroende av hjärtats storlek. Hjärt makrofager kan delas ytterligare utifrån deras uttryck för CD11c eller CCR2 och deras nivåer av MHC-II2.
Andra kardiella immun subpopulationen som har karakteriserats väl är konventionella dendritiska celler. Konventionella DCs är CD64– celler som express mellanliggande till höga nivåer av MHC-II och höga nivåer av CD11c (figur 1 C, botten). Dessa celler kan delas ytterligare baserat på deras uttryck antingen CD103 eller CD11b8,9. DCs representerar en mycket mindre hjärt subpopulation jämfört med makrofager. Rötning av en vuxen murina hjärtat ger mellan 150 och 500 DCs av varje delmängd.
Perfusion av hjärtat med kall PBS är väsentlig när att identifiera immunceller populationer inom myokardiet. Bristfällig perfusion kan dock öka beloppen av intravaskulär föroreningar i proven, leder till viktig partiskhet som kan baseras på perifera förändringar (blod) snarare än förändringar i de kardiella infiltrat. I dessa fall kan Intravaskulär administrering av lysrör-märkt anti-CD45 antikroppar, som etiketter alla immunceller som cirkulerar genom makro- och mikrocirkulation (figur 2A), hjälpa till att skilja hjärtmuskelceller från intravaskulära föroreningar. Figur 2 B visar ett exempel på ett ofullständigt perfunderade hjärta där 20% av immunceller är intravaskulära föroreningar. Viktigt, har denna nivå av kontaminering liten effekt på makrofag och DC analys, eftersom dessa celler finns sällan i blod (figur 2D).
Användning av flödescytometri av en enda cellsuspension av hjärtmuskeln tillåter för studier av små subpopulationer av hjärtat. Exempelvis brist på Transkriptionfaktorn BATF3 har visat sig hindra utvecklingen av mogen CD103+ DCs i flera vävnader11. För att studera om det gäller också av hjärtmuskeln, var enda cellsuspensioner av hjärtats celler från 8 – 15-vecka-gammal BATF3-brist eller kontroll littermates (i C57BL/6 bakgrunden) analyseras med flödescytometri. På grund av den små befolkningens storlek och antal markörer behövs för att skilja DC delmängder, kunde histologi inte ha gett tillräckligt med ström för analys för att nå ett definitivt svar. Men med hjälp av flödescytometri Flödesanalys för att jämföra immuncellerna hjärtmuskeln av vildtyp jämfört med en Batf3- / - möss, en brist på CD103+ DCs kan bekräftas i sistnämnda (figur 3A och B). Dessutom observerade vi att BATF3-brist avsevärt inte förändrade sammansättningen av andra hjärt populationer (figur 3C och D). Dessa resultat exemplifiera graden av känslighet som kan uppnås med denna kombinerade metoden för enzymatisk och mekanisk matsmältningen för att uppnå en enda cellsuspension.
Figur 1 : Gating strategi för hjärt makrofager och DCs. Isolerade hjärtan från C57BL/6 möss var rötas som beskrivs, och enda cellsuspension var analyseras med flödescytometri. (A) Gating CD45 + live singlet hjärtats celler. Använda CD45 märkning för att identifiera immunceller från hjärt enda cell Homogenatet, som innehåller mycket höga halter av icke-immun cellerna (dvs hjärtmuskelceller, endotelceller och fibroblaster). Utesluta dubletter genom att jämföra SSC-H mot SSC-A följt av FSC-H vs FSC-A. Obs: Någon annan jämförelse mellan SSC-A, SSC-H och SSC-W eller FSC-A, FSC-H och FSC-W är lika användbara. Urval av levande celler kan utföras genom att utesluta mycket små celler (SSC-H vs FSC-H gate). (B) jämförelse av döda cellen utslagning använder storlek vs livskraft färgning (DAPI). (C) Gating strategi för identifiering av hjärt makrofager (CD11b+ CD64+ celler) och DCs (CD64– MHC-IIHej CD11c+). Hjärt makrofager kan ytterligare klassificeras utifrån deras uttryck av MHC-II och CD11c. hjärt DCs kan delas upp utifrån deras uttryck för CD103 eller CD11b. (D) representativa tomter av DAPI + döda celler inom makrofag och DC fack efter liten storlek uteslutning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Märkning av intravaskulär celler föroreningar. (A) jämförelse av intravaskulär CD45 märkning av blod neutrofiler och Ly6CHej monocyter i anti-CD45 antikropp behandlas (röd) eller icke-behandlade (blå) möss. (B) identifiering av intravaskulär föroreningar i en hjärt beredning av intravaskulär CD45 märkning. (C) representativa flöde tomter av hjärtinfarkt och intravaskulär celler. (D) representativa tomter av märkta celler inom makrofag och DC fack efter anti-CD45 i.v. administrering. Observera att makrofager och DCs är uteslutande extravaskulär. Intravaskulära föroreningar är vanligtvis lymfocyter, monocyter och neutrofiler2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kvantifiering av hjärt makrofager och DCs i BATF3-brist möss. (A) representativa flöde tomter hjärt DCs i Batf3+/ + och Batf3- / - möss. (B) kvantifiering av hjärt DCs i Batf3+/ + och Batf3- / - möss. Notera avsaknaden av CD103+ DCs i Batf3- / - möss. (C och D) kvantifiering av hjärt makrofager (MF) i Batf3+/ + och Batf3- / - möss. Felstaplar representera SEM. röda symboler representerar enskilda djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärtinfarkt, inflammation eller myokardit, är en funktion av den kardiovaskulära sjukdomar. Hjärtmuskeln är dock inte saknar egen immuna komponenter i icke-sjukdomstillstånd. Under steady-state många immunceller bosatta i hjärtmuskeln och spela viktiga roller underhåll och skydd. Karakterisering av dessa olika populationer av celler skulle inte ha varit möjligt utan metoder såsom den presenteras i detta protokoll.
En kombination av mekaniska och enzymatisk nedbrytning av myokardiet tillåter isolering av en enda cellsuspension som kan användas i kombination med andra analysmetoder, såsom flöde flödescytometri eller immunmagnetisk pärla isolering. Flera överväganden angående den nuvarande metoden måste beaktas. Först, alla våra analyser avser befolkningen inom myokardiet; vi utesluta atria från vår analys som dessa är specialiserade vävnader med sina egna egenheter. Det andra uttrycks mängder enzymer som används som aktivitetsenheter att hjälpa i utformningen av tumörheterogenitet med enzymer från andra källor. Dock rekommenderas empiric optimering av slutliga koncentration av enzymer och matsmältning tid starkt, som att begränsa enzymet kan avsevärt minska cell avkastningen och för mycket matsmältningen kan drastiskt påverka livskraft. Det tredje rekommenderas steget tillval som involverar Intravaskulär administrering av märkta antikroppar särskilt när man studerar uncommon populationer i normala hjärtmuskeln (t.ex lymfocyter, monocyter och neutrofiler)2 eller under omständigheter När antalet populationer i blodet kan ändras (monocytosis, granulocytosis eller Lymfocytos) som kan ge ett falskt intryck av förändringarna inom myokardiet som måste bekräftas med hjälp av denna metod, eller alternativt mikroskopi. Detta steg är dock av begränsad nytta när man analyserar makrofager eller mogen DCs, eftersom dessa celler finns sällan i större mängder i blodet (figur 2D). Är det viktigt att optimera mängden antikroppar administreras och inkubationstiden innan att offra musen, som lång sikt ge inkubation för vissa antikroppar diffusion in i hjärtat, särskilt i en inflammerad myokardiet. Slutligen är det mycket viktigt att vara noggrann i isoleringen av hjärtat, vilket eliminerar rester av stora artärer, vener och eller någon annan vävnad, såsom lungan. Dessa främmande vävnader har mycket förhöjda antalet immunceller som enkelt kan maskera de hjärtinfarkt ursprungsbefolkningar.
Det är mycket viktigt att utföra uteslutandet av döda celler, oavsett om du använder livskraft färgämnen eller genom liten storlek utanförskap under flödescytometri Flödesanalys, matsmältningen (eller vävnadsskada i sjukdomsmodeller) kan orsaka en relativt stor mängd döda celler. Vi har jämfört effektiviteten i döda cellen utslagning genom storlek och använda en livskraft etikett (figur 1B och D), vilket visar deras nära likvärdighet. Ännu viktigare, kan inte storlek uteslutning användas efter fixering och permeabilisering som proceduren avsevärt minskar cellstorleken.
Även om autofluorescens är sällan ett problem att identifiera hjärt makrofager med flödescytometri, utgör detta ett viktigare problem när du försöker karaktärisera uttrycket av vissa markörer, särskilt med fluorokromer upphetsad av hög energi ( kortare) ljus våglängder (350 – 500 nm). I dessa experiment, det rekommenderas starkt att använda isotypen kontroller, undvika de blå och violett lasrarna (fluorescein isotiocyanat, phycoerythrin, Pacific Blue/lysande violett 421) och använda fluorokromer med utsläpp över 600 nm, såsom allophycocyanin.
Användning av protokoll som presenteras häri blir allt viktigare som en ökande mängd litteratur är att identifiera rollen av intensitet och typ av inflammation i utvärderingen och karakterisera resultatet av hjärt-kärlsjukdom. Denna metod tillåter högre nivåer av cell karakterisering än histologi. Exempelvis användning av lineage tracing tillåtet för identifiering av ontogenically olika undergrupper av makrofager med deras programmerad olika funktioner2. Likaså kan denna metod används för att studera T-cell svar vid hjärtinfarkt inflammation och kombineras med ex vivo stimulering att studera T cell polarisering8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av kanadensiska institut för hälsa forskning (148808 och 148792), SE stöddes av en hjärta och Stroke Foundation, personal award från Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre för hjärtat forskning och den Peter Munk Hjärt centrum. XCC innehar en CIHR Banting Fellowship. LA äger ett hjärta & Stroke/Richard Lewar STUDENTTILLVARO Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
