Summary
Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.
Abstract
CRISPR/Cas9 teknoloji genom mühendislik birçok hücre tipleri, ama şimdiye kadar gen teslim hızlanıyor ve istikrarlı gen değişikliği birincil NK hücreleri zorlu olmuştur. Örneğin, lentiviral veya retroviral iletim kullanarak transgene teslim hücrelerinin genetik mühendisliğiyle NK önemli yordamı ilişkili NK hücre apoptosis nedeniyle sınırlı bir verim sonuçlandı. Biz burada genom Cas9 Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9/RNPs) kullanarak insan birincil ve genişletilmiş NK hücreleri düzenleme için bir DNA ücretsiz yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem etkili nakavt TGFBR2 ve NK hücreleri HPRT1 genlerinde izin. Veri RT-PCR gen ifade düzey önemli bir azalma gösterdi ve sitotoksisite tahlil bir temsilcisi hücre ürünün RNP-modified NK hücreleri TGFβ için daha az duyarlı oldu önerdi. Genetiği değiştirilmiş hücreler stimülasyon ile ışınlanmış mbIL21 ifade tarafından Genişletilmiş yazı Elektroporasyon olabilir besleyici hücreler.
Introduction
Kanserli hastalarda son yıllarda ilerlemiştir. Genetik olarak değiştirilmiş chimeric antijen reseptör (araba) T hücreleri mühendislik bağışıklık hücrelerinin kanserli hastalarda başarıyla dağıtmış mükemmel bir örnektir. Bu hücreler son zamanlarda karşı tedavi için FDA tarafından onaylanmış CD19 + B hücre maligniteler, ama başarı defa birkaç targetable antijenleri taşıyan hastalıklar için sınırlı olmuştur ve böyle sınırlı antijenik kapsayacağını hedefliyor bağışıklık kaçış başarısızlık eğilimli. Ayrıca, araba T hücre otolog T hücreleri kullanımı Greft - versus - host hastalığı allojeneik T hücreleri tarafından neden riski nedeniyle odaklanmıştır. Buna ek olarak, NK hücreleri tümör hedefleri bir antijen-bağımsız şekilde öldürmek edebiliyoruz ve onları kanser immünoterapi6,7,8,9için iyi bir aday yapar GvHD neden olmaz.
CRISPR/Cas9 teknoloji son zamanlarda mühendislik bağışıklık hücreleri kullanılmaktadır ama genetik olarak NK hücreleri Plasmid'ler ile yeniden programlama her zaman zor olmuştur. Bu önemli yordamı ilişkili NK hücre apoptozis ve sınırlı üretim genetiği NK hücreleri4 neden lentiviral ve retroviral iletim gibi bir DNA bağımlı şekilde transgene teslim zorluklar nedeniyle oldu , 9.
Birçok doğuştan gelen bağışıklık hücreleri reseptörleri patojen ilişkili moleküler modelleri için yüksek düzeyde gibi hızlı retinoik asit-indüklenebilir gene ben (teçhizat-ben), hangi yabancı DNA'ın artan tanıma etkinleştirmek. Bu yollar bastırılması daha yüksek iletim verimliliği NK hücrelerindeki DNA tabanlı yöntemleri için genetik değişiklik10kullanırken sağlamıştır.
Biz burada bir DNA ücretsiz genom Cas9 Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9/RNPs) kullanarak birincil ve genişletilmiş insan NK hücreleri düzenleme kullanma yöntemi açıklanmaktadır. Cas9/RNPs, üç bileşenden, Rekombinant protein Cas9 bir complexed crRNA ve tracerRNA oluşan sentetik tek-Kılavuzu RNA ile complexed oluşur. Bu Cas9/RNPs fonksiyonel kompleksler olarak onların teslim nedeniyle yabancı DNA-bağımlısı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek verimlilik ile genomik hedefleri fizyon yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, Cas9/RNPs hücrelerden hızlı Gümrükleme gibi apoptozis indüksiyon hedef kapalı etkileri azaltabilir. Böylece, knock-bileşen Homolog rekombinasyon6,7için DNA ile kombine edildiğinde veya knock-out oluşturmak için kullanılabilir. Cas9/RNPs o Elektroporasyon gösterdik NK hücrelerindeki genetik değişiklik önceki kısıtlamaları üstesinden gelir bir kolay ve nispeten verimli yöntemidir.
TGFβ harekete geçirmek ve NK hücrelerin işlevlerini inhibe büyük bir immünsüpresif sitokin var. TGFβ yolu hedefleme bağışıklık hücre işlevlerini artırabilir sürülmüştür. Biz TGBR2 ectodomain TGFβ11. bağlayan kodlama bölge hedefli Temsilcisi sonuçları bu gen mRNA ifade düzeyini önemli bir azalma göstermek ve daha da değiştirilmiş NK hücreleri TGFβ için dayanıklı hale göstermek. Buna ek olarak, Genişletilmiş yazı Elektroporasyon radyasyonlu besleyici hücreler. kullanarak olmak mümkün olduğu gibi değiştirilmiş hücreler canlılığı ve proliferatif potansiyel, korumak Bu nedenle, aşağıdaki yöntemi NK hücreleri herhangi için genetik olarak işlemek için umut verici bir yaklaşımdır daha fazla klinik veya araştırma amaçlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sağlıklı donör buffy kat kaynak malzemesi olarak Merkez Ohio bölge Amerikan Kızıl Haç üzerinden elde edilmiştir. Bu araştırma muafiyet araştırma için kurumsal İnceleme Kurulu, Nationwide Çocuk Hastanesi tarafından tespit edilmiştir.
1. insan NK hücre arıtma ve genişleme
- PBMCs Buffy kat12den yalıtmak.
- Katman buffy ceket örneği üzerinde Ficoll-Paque 15 mL 35 mL.
- 400 x g fren olmadan 20 dakika santrifüj kapasitesi ve PBMC arabirimden toplamak.
- PBS eşit en az bir hacmi ekleyerek üç kez kurtarılan PBMCs yıkamak, beş dakikalığına de 400 x g centrifuging ve PBC aspirating yıka. NK hücre bu aşamada RosettesSep13tarafından ayrılmış olabilir.
- NK hücreleri radyasyonlu 10 x 106 mbIL21-ifade ile uyararak genişletin besleyici hücreler, 0, 7 ve 14 gün. Taze RPMI % 10 içeren ortamı değiştirin FBS, % 1 glutamin, %1 penisilin streptomisin ve 100 IU/mL IL-2 tüm ortam birimi her gün için.
2. gRNA tasarımı ve seçimi
- Hedef, online araçlar, Örneğin, NCBI, topluluğu kullanarak belirli genomik loci seçin.
Örnek.
Açıklama: dönüştürme büyüme faktörü beta reseptör 2 (TGFBRR2) ectodomain
Görüntülemek kayıt: PF08917
Görüntülemek InterPro: IPR015013
Pozisyon: 49-157 aa
Hedef sırası: Exon 4 TGFBR2 gen (ENSG00000163513) - CRISPR tasarım web araçları http://crispr.mit.edu ve 'Benchling.' gibi gRNAs tasarlamak için kullanın
- Adım 2.1seçilen DNA dizisi girin. İnsan (hg 19) hedef genom seçin. CRISPR kılavuzları (20 nükleotit PAM sıra ile takip: NGG) daha önce girilen serisinden taranır. Ayrıca seçili genom boyunca olası hedef kapalı eşleşmeleri gösterir.
- Onların üzerinde hedef ve hedef kapalı oranları dayalı en yüksek puanı olan en iyi üç gRNAs seçin. Örneğin, Tablo 1 CRISPR tasarım web araçları tarafından önerilen exon 4 TGFBR2 gen hedeflemek için tasarlanmış CRISPR RNA'ları gösterir.
- CRISPR RNA'ların sentetik fingerprinting crRNAs sipariş.
- Korunmuş, sipariş crRNA ile kısmi Homoloji ile etkileşim kurmak için RNA (tracrRNA) transactivating.
3. tasarım silme astar eleme
- GRNA bölünme siteleri T7E1 mutasyon tahlil için kapsayan astar tasarım.
- Kullanım astar en az 100 bp küçük ekleme-silme (indels) sgRNA hedef sitede sağlamak için öngörülen bölünme sitesinden mutasyon tahlil takip % 1.5 özel jel üzerinde görünür. Tablo 2 TGFBR2 ectodomain yükseltmek için kullanılan astar gösterir.
4. insan birincil ve genişletilmiş NK hücreleri iletim
Not: Cas9/RNPs öğeleri iletim NK içine 4 D sistemi aşağıdaki gibi kullanarak Elektroporasyon tarafından yapılır.
-
Hücre Hazırlık
- Birincil NK hücreleri için4 gün boyunca taze izole NK hücreleri 100 IU/mL IL-2 huzurunda RPMI ortamda kuluçkaya ve gün 5 adım gerçekleştirin. Ortamı her geçen gün daha önce ve bir gün önce iletim açıklandığı gibi değiştirin.
- Genişletilmiş NK hücreleri içingün 0 ile 1:1 oranında radyasyonlu besleyici hücreler hücreleri uyarmak ve gün 5 veya 6 veya 7 Elektroporasyon gerçekleştirin. Ortamı her geçen gün daha önce ve bir gün önce iletim açıklandığı gibi değiştirin.
- Elektroporasyon günü, taze RPMI 100 IU/mL IL-2 Elektroporasyon ve önceden incubate şişe oksijen 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka geçiyor hücreler için içeren 8 mL ile dolu bir T25 şişesi hazırla.
Not: Çözdürülen hücreleri veya 2nd veya 3rd stimülasyon uğramıştır hücreleri electroporated açıklandığı gibi onların kurtarma sonra herhangi bir zamanda olabilir. - 3-4 × 106 hücre iletim Mix 26 µL için koşul başına al.
Not: NK hücre çoğalmasıyla çözümünde çok yüksek konsantrasyon iletim hızı artırır. - Sık RNase aktivite içeren tüm FBS, kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle yıkayın. Onları spin 300 x g her zaman aşağı 8 dakikadır.
Not: Tek gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) olarak Cas/RNPs için 7 adım koşulları ve iki gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) bir arada ve bir denetim yok Cas9/RNPs ile göz önünde bulundurun.
-
CrRNA:tracerRNA formu / karmaşık
- CrRNAs (gRNA1, gRNA2 ve gRNA3) ve tracerRNA 1 x 200 mikron son konsantrasyonları TE çözüm resuspend. Tablo 3' te gösterilen 200 mikron tracerRNA ile her 200 mikron gRNA Mix 2.2 μL.
- Örnekleri 5 min için 95 ° c ısı ve oda sıcaklığında (15-25 ° C) için tezgah üstüne soğumasını bekleyin. Mağaza resuspended RNA'ların ve crRNA: tracerRNA/karmaşık-20 ° c daha sonra kullanmak için.
-
RNP kompleks oluştururlar
Not: zaman kazanmak için RNP yıkama sırasında karmaşık form Adım 4.1.5.- Tek crRNA:tracrRNA çift yönlü tepki için Tablo 4örnekte gösterildiği gibi 36 mikron için Cas9 endonükleaz sulandırmak.
- Örnekte gösterildiği gibi Cas9 endonükleaz 36 mikron için için kombinasyon iletim crRNA:tracrRNA dubleks, seyreltik Tablo 5.
- Cas9 endonükleaz crRNA:tracrRNA dubleks için yavaş pipet ucu, 30 'un üzerinde dönen ekleyin s 1 dakika.
- 15-20 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya. Kuluçka sonra karışım kullanmak hazır değil eğer karışımı buz kadar kullanmak tutmak.
-
Elektroporasyon
- Tüm ek Elektroporasyon P3 ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
- Hücre Pelet (3-4 × 106 hücre adım 4.1.5) P3 birincil 4 D Elektroporasyon çözüm 20 μL içinde resuspend. Hava kabarcıkları pipetting sırasında kaçının.
Not: hücreleri P3 çözüm içinde uzun süre bırakılmamalıdır. - Hemen 5 µL RNP karmaşık (adım 4,3), hücre süspansiyon için ekleyin.
- 100 μm kalınlığında Cas9 Elektroporasyon artırıcı Cas9/RNPs/hücreye 1 μL karışımı ekleyin.
- Cas9/RNPs/hücre mix 20 μL Elektroporasyon şeritler halinde aktarın.
- Örnek alt şeritler kapsar emin olmak için şeritler hafifçe dokunun.
- 4 D Elektroporasyon sistemini başlatmak ve tr-138 programı seçin.
5. mesaj iletim
- 3 dakika içinde şeritler için dinlenme hücreleri izin.
- Küvet için önceden dengelenmiş kültür ortamının 80 µL ekleyin ve hafifçe örnek şişeler aktarın.
- 48 saat sonra iletim, genomik DNA eleme gen silme işlemleri için 5 × 105 hücrelerden ayıklayın.
- Adım 3.2 Taq DNA polimeraz kitleri ile tasarlanmış primerler kullanılarak faiz gen yükseltmek.
- PCR amplicon heteroduplexes T7EI sindirim için formu ve ürün T7EI enzim 37 ° c ile 30-60 dakika için kuluçkaya
Not: Tahlil olarak hızlı, basit ve sağlar eleme için tercih edilir T7EI arazi tahlil kullanarak göre elektroforez sonuçları temiz. Ancak, bu yöntem eklemeler ve silmeler, algılayamaz < homolog son Cas9 RNPs deneyler14' te (NHEJ) faaliyet katılmadan tarafından oluşturulan 2 bazlar. - %1,5 sindirilir DNA'sını özel jel 110 V 30-45 dakika, at 15 dakikada görselleştirmek jel.
- Gerisi mbIL21 ifade içeren hücrelerin teşvik besleyici hücreler 1:1 oranında.
- Beş gün sonra stimülasyon gen ifade düzey qPCR kullanarak için RNA ayıklayın.
- Kuralları calcein deneyleri daha önce12bildirdi. Kısaca, hedef hücreler ile calcein AM (örnekte gösterildiği, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY hücreleri kullanıldı) yükleyin. NK hücreleri gecede IL2 içinde bekleterek sitotoksisite deneyleri için hazırlamak (100 IU/mL) artı ya da eksi 10 ng/mL çözünür TGFβ. NK hücreleri geceleme dinlenmiş gibi calcein deneyleri aynı sitokinler içinde gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporasyon verimliliği
Cas9/RNPs Elektroporasyon en iyi duruma getirmek için GFP hedefleme-siRNA ve DNA plazmid iletim NK hücreleri ile 16 farklı programlar test. Akış Sitometresi tahlil tr-138 hücre canlılığı ve iletim verimliliği (% 35 canlı GFP pozitif hücrelerinin) her iki parçacıklar (resim 1 ve Şekil 2) için en yüksek yüzdesi olduğunu göstermiştir. İlginçtir, istimal bu bilgisayar programı için Cas9/RNPs Elektroporasyon verimliliğini TGFBR2 mRNA ifade düzey (Şekil 5) azalma % 60'ı gördüğümüz gibi daha yüksek. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş NK hücreleri yetiştirilen olabilir ve genişletilmiş için 30 gün ve (cryopreserved veri gösterilmez).
Mutasyon tahlil
Cas9/RNPs gRNA2, gRNA1 + gRNA2 ve gRNA3 içeren başarılı TGFBR2 ectodomain gen nakavt vardı, ama gRNA1 tek başına herhangi bir T7E1 tespit indels (Şekil 3) yapmak değil. Buna ek olarak, Şekil 4 başarıyla insan HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) ticari olarak kullanarak genişletilmiş insan NK hücreleri içinde nakavt gRNAs sağlanan gösterir. Göre grup Dansitometresi, TGFBR2 NK hücreleri değişiklik için kullanarak gRNA1 + gRNA2 orantılı INDEL oranları % 34 grupta sonuçlandı, gRNA3 için % 25 ve % 81'i HPRT gen için NK hücreleri değiştirilmiş.
Gen ifade düzey tahlil
Bizim sonucu bir temsilcisi olarak, Şekil 5 TGFBR2 ectodomain, RT-PCR tarafından analiz mRNA üretim düzeyi üzerinde Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) etkisini gösterir. Grafikte görüldüğü gibi hedeflenen gen mRNA ifade düzeyini önemli ölçüde azalmıştır.
Sitotoksisite
GRNA1 + gRNA2, gRNA2 ve gRNA3 kuluçka sonra Şekil 6' da görüldüğü gibi Cas9/RNPs TGFβ1, DAOY hücrelerle birlikte kültürlü hücrelerle değiştirildi; değiştirilmiş hücreler sitotoksisite düzeylerini bir gecede IL-2 medya vardı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında önemli bir azalma belli etmedi. Bu sonuç Cas9/RNPs değiştirilmiş hücreler sitotoksisite işlevlerine TGFβ1 ve değiştirilmiş hücreler TGFβ1 dayanıklı oldu gösterir korumak gösterir.
Şekil 1. Buradaki şekillerde siRNA ve plazmid DNA Elektroporasyon verimliliğini GFP NK hücrelerindeki tr-138 programı kullanarak ifade etme görülmektedir. Burada da görüldüğü gibi NK hücre canlılığı %77.5 ve % 35 canlı hücre GFP olumlu olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Bu şekil canlılığı ve verimlilik (DN-100) Elektroporasyon optimizasyonu için test 16 programlarının bir başka gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. T7E1 mutasyon tahlil tarafından ölçülen (b) Cas9/RNPs-aracılı TGFBR2 nakavt harcanan (a) birincil NK hücreleri. T7E1 enzim tanır ve uyumsuz DNA cleaves. Her küçük grup (mavi oklar) bir INDEL taşımaya sindirilir DNA parçalarının temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Cas9/RNPs - aracılı T7E1 mutasyon tahlil tarafından ölçülen genişletilmiş NK hücreleri HPRT bozulma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. mRNA ifade düzeyini CRISPR TGFBR2 ectodomain Cas9/RNPs tarafından (gRNA1 + gRNA2) tanıttı NK hücreleri değiştiren RT-PCR kullanarak. GAPDH bir endojen denetim gen kullanıldı. Bir bozulma TGFBR2 genin RNA düzeyleri azalma gösterir (± SEM, yani P değeri < 0.0001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. a. Cas9/RNPs temsil edici bir örnek kullanarak sitotoksisite tahlil TGFβ1 içeren hücrelerin gecede kuluçka DAOY hücreleri parçalayıcı yeteneğini önemli ölçüde azaltamaz (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 ve gRNA3) NK hücreleri gösterir değiştiren. -modified NK hücreleri, Cas9/RNP ile değiştirilmiş NK hücreleri (gRNA2 ve gRNA3) karşılaştırıldığında b. TGFβ1 için daha az duyarlı (± SEM demek). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| gRNA No | gRNA serisi | Sentetik crRNA sipariş | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Tablo 1. Üç gRNAs exon 4 TGFBR2 ectodomain sentetik crRNA olarak hedeflemek için tasarlanmış.
| TGFBR 2 ectodomain astar ileri sar | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain astar REV | 5 GGG SKK GAG AAT CTG KEDİ TTA 3 |
Tablo 2. TGFBR2 ectodomain gen yükseltmek için kullanılan astar
| Bileşen | Tutarı (uL) |
| 200 µM crRNA | 2.2 |
| 200 µM izleyici RNA | 2.2 |
| IDTE arabellek | 5.6 |
| Nihai ürün | 10 |
Tablo 3. CrRNA:tracerRNA formu / 200 µM RNA'lar kullanarak karmaşık
| Bileşen | Tutarı (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA (adımından 4.2) çift yönlü | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonükleaz (61 µM stok) | 2 |
| Toplam hacim | 5 ul |
Tablo 4. Tek crRNA:tracrRNA çift yönlü tepki için Cas9 endonükleaz 36 µM için sulandırmak.
| Bileşen | Tutarı (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA çift yönlü (ex. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA çift yönlü (ex. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonükleaz | 2 |
| Toplam hacim | 5 ΜL |
Tablo 5. CrRNA:tracrRNA Dubleks kombinasyonu iletim için Cas9 endonükleaz 36 µM için sulandırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NK hücreleri DNA-bağımlısı değişiklik4,9zor oldu. Biz, bu nedenle, doğrudan bir sentetik ön şekillendirilmesi Ribonükleoprotein (RNPs) karmaşık ve Cas9 protein saf protein birincil ve genişletilmiş NK hücreleri8içine tanıttı. Bu yöntem takip, kapatma, ortadan kaldırmak için bize izin verdi ve RNA polimeraz II, DNA-bağımlısı iletim yöntemleri ile ilişkili NK hücre apoptosis neden olabilecek diğer transkripsiyon ve çevirim işlemleri başlatan.
Buna ek olarak, rapor yöntemi burada Cas9/RNPs, hemen ardından Elektroporasyon etkin ve hızlı bir şekilde, böylece hedef üzerinde artan ve geçerli iletişim kuralları üzerinden hedef kapalı etkileri azalan bozulmuş olarak saf Cas9 protein complexed kullanır 5 , 6 , 7 , 16. Ayrıca, Cas9/RNP yüksek verimlilik ile transduce için yeni bir adım yaklaşım en iyi duruma getirme burada, tanıttı başka bir kritik faiz diğer herhangi bir gen için geçerli olan bir adımdır. Bu yöntem daha büyük sayıda piyasada bulunan büyük Elektroporasyon cuvettes (veri gösterilmez) kullanarak NK hücrelerin değiştirilmesi için ölçekli.
Özetle, Cas9/RNPs genetik olarak kanserli hastalarda yukarıda açıklanan yöntem kullanmak için insan birincil ve genişletilmiş NK hücreleri değiştirmek için kullanılabilir. Sonuçlarımız de başarılı bir nakavt TGFBR2 ectodomain gen TGFβ1 dayanıklı11olma bu değiştirilmiş NK hücreleri için yol gösterdi.
RNP teslim (gibi doğal olarak recombinogenic adeno ilişkili virüs (AAV) donör vektörel çizimler) şablonu DNA kaynağı ile birleştirerek siteye özgü gen ekleme Homolog rekombinasyon3,18,19 tarafından izin verebilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL hizmet vermektedir/kurye Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia tedavi, Merck araştırma laboratuvarları ve Miltenyi labaratuvar için bir danışman olarak hizmet vermiştir ve eşitlik/liderlik CytoSen tedavi vardır.
Acknowledgments
El yazması düzenleme tür yardım için Brian Tullius anıyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
