Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at genetisk ændre primære eller udvidede menneskets naturlige dræberceller (NK) celler ved hjælp af Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Ved hjælp af denne protokol, genereret vi NK menneskeceller mangelfuld for omdanne vækst faktor – b receptor 2 (TGFBR2) og hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 teknologi fremskynder genom engineering i mange celletyper, men hidtil gen levering og stabil gen ændring har været udfordrende i primære NK celler. For eksempel resulterede transgen levering ved hjælp af lentiviral eller retroviral transduktion i en begrænset udbytte af genetisk manipuleret NK celler på grund af væsentlige procedure-associerede NK celle apoptose. Vi beskriver her en DNA-fri metode for genom-redigering af menneskelige primære og udvidet NK celler ved hjælp af Cas9 ribonucleoprotein komplekser (Cas9/RNPs). Denne metode er tilladt effektive knockout af TGFBR2 og HPRT1 gener i NK-celler. RT-PCR data viste en betydelig nedgang i gen expression niveau, og cytotoksicitet analyse af et repræsentativt celle produkt foreslog at RNP-modificeret NK-celler blev mindre følsomme over for TGFβ. Genetisk modificerede celler kunne være udvidet post-elektroporation ved stimulation med bestrålede mbIL21-udtrykker feeder celler.
Introduction
Cancer immunterapi har været fremført i de seneste år. Genetisk modificerede kimære antigen receptor (bil) T celler er et fremragende eksempel på manipuleret immunceller implementeret i cancer immunterapi. Disse celler blev for nylig godkendt af FDA til behandling mod CD19 + B celle maligniteter, men succes har hidtil været begrænset til sygdomme forsynet med et par markedssegment antigener og rettet mod sådanne begrænset antigene repertoirer er udsat for svigt af immunsystemet undslippe. Derudover har bil T celler været fokuseret på brugen af autologe T celler på grund af risikoen for graft - versus - host sygdom forårsaget af allogene T celler. I modsætning, NK-celler er i stand til at dræbe tumor mål i en antigen-uafhængig måde og forårsager ikke GvHD, hvilket gør dem en god kandidat for cancer immunterapi6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 teknologi er blevet brugt for nylig i engineering immunceller, men genetisk omprogrammering NK celler med plasmider har altid været udfordrende. Dette har været på grund af vanskeligheder i transgene levering i et DNA afhængige måde som lentiviral og retroviral transduktion forårsager væsentlige procedure-associerede NK celle apoptose og begrænset produktion af gensplejsede NK celler4 , 9.
Mange medfødte immun celler udtrykker høje niveauer af receptorer for patogen-associeret molekylære mønstre såsom retinoid syre-inducerbar gen jeg (RIG-jeg), som aktiverer øget anerkendelse af fremmed DNA. Undertrykkelse af disse veje har aktiveret højere transduktion effektivitet i NK celler, når du bruger DNA-baserede metoder til genetisk modifikation10.
Her beskriver vi metoden for ved hjælp af en DNA-fri genom-redigering af primære og udvidet menneskelige NK celler udnytte Cas9 ribonucleoprotein komplekser (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs består af tre komponenter, rekombinante Cas9 protein kompleksbundet med syntetisk single-guide RNA består af en kompleksbundet crRNA og tracerRNA. Disse Cas9/RNPs er i stand til at holde genomisk mål med højere effektivitet i forhold til udenlandske DNA-afhængige tilgange på grund af deres levering som funktionelle komplekser. Derudover kan hurtig clearance af Cas9/RNPs fra cellerne reducere off target effekter såsom induktion af apoptose. De kan således bruges til at generere knock-outs, eller knock-ins når kombineret med DNA for homologe rekombination6,7. Vi viste at elektroporation af Cas9/RNPs er en nem og relativt effektiv metode, der overvinder de foregående begrænsninger af genetisk modifikation i NK-celler.
TGFβ er en stor immunosuppressive cytokin, som hæmmer aktivering og funktioner af NK celler. Det er blevet foreslået, at målrette TGFβ vej kan øge immun cellefunktioner. Vi målrettet regionen kodning TGBR2 ectodomain, som binder TGFβ11. De repræsentative resultater viser et signifikant fald i niveauet af mRNA udtryk for dette gen og yderligere viser, at de modificerede NK celler bliver resistente over for TGFβ. Derudover bevarer de modificerede celler levedygtighed og proliferativ potentiale, som de er i stand til at blive udvidet post-elektroporation ved hjælp af bestrålede feeder celler. Følgende metode er derfor en lovende metode at genmanipulere NK celler for nogen yderligere kliniske eller forskning formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sund donor buffy frakker blev fremstillet som kildemateriale fra Central Ohio Region amerikanske Røde Kors. Denne forskning var besluttet på at være undtaget forskning af den institutionelle Review Board af landsdækkende children's Hospital.
1. menneskelige NK celle oprensning og udvidelse
- Isolere PBMC fra Buffy Coat12.
- Lag 35 mL af buffy coat stikprøve på 15 mL af Ficoll-Paque.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 20 minutter uden bremse og indsamle PBMC fra grænsefladen.
- Vask de gendannede PBMC tre gange ved at tilføje mindst et lige saa stort volumen af PBS, centrifugering ved 400 x g i 5 minutter, og sugning PBC vaske. NK celler kan isoleres på dette stadium af RosettesSep13.
- Udvid NK-celler ved at stimulere med bestrålede 10 x 106 mbIL21-udtrykker feeder celler på dag 0, 7 og 14. Erstatte medier med friske RPMI indeholdende 10% FBS, 1% glutamin, 1% Penicillin Streptomycin og 100 IE/mL af IL-2 for det hele media volumen hver anden dag.
2. gRNA Design og udvalg
- Vælg de specifikke genomisk loci at målrette, ved hjælp af online værktøjer, fx NCBI, Ensemble.
Eksempel.
Beskrivelse/kontrol: Omdanne vækst faktor beta receptor 2 (TGFBRR2) ectodomain
Se post: PF08917
Se InterPro: IPR015013
Stilling: 49-157 aa
Målrettet sekvens: Exon 4 af TGFBR2-genet (ENSG00000163513) - For at designe en gRNAs, brug CRISPR design Webværktøjer som http://crispr.mit.edu og 'Benchling.'
- Angiv i DNA-sekvens valgt i trin 2.1. Vælg menneskelige (hg 19) som en target genom. CRISPR guider (20 nukleotider efterfulgt af en PAM sekvens: NGG) vil blive scannet fra den sekvens, der er angivet tidligere. Det viser også muligt off mål kampe i hele det valgte genom.
- Vælge de bedste tre gRNAs, som har den højeste score, baseret på deres på mål og off-target satser. For eksempel, viser tabel 1 den designede CRISPR RNA'er at målrette exon 4 af TGFBR2 gen foreslog af CRISPR design Webværktøjer.
- Bestil CRISPR RNA'er som syntetiske sekvens-specifikke crRNAs.
- Bestil en bevaret, transactivating RNA (tracrRNA) til at kommunikere gennem delvis homologi med crRNA.
3. design sletning Screening primere
- Design primere spanning gRNA kavalergang websteder for T7E1 mutationen assay.
- Brug primere mindst 100 bp fra webstedet forudsagte kavalergang til at sikre små indsættelse-sletning (indels) på sgRNA mål-webstedet vises på 1,5% agarosegel efter mutation assay. Tabel 2 viser de primere, der anvendes til at forstærke TGFBR2 ectodomain.
4. transduktion af menneskelige primære og udvidet NK-celler
Bemærk: Transduktion af Cas9/RNPs elementer i NK er udført af elektroporation med 4D systemet således.
-
Celle Forberedelse
- For primære NK celler, inkuberes frisk isolerede NK celler i RPMI medium i overværelse af 100 IE/mL af IL-2 i 4 dage og udføre elektroporation på dag 5. Erstatte medierne hver anden dag, som beskrevet tidligere og dagen før transduktion.
- For udvidet NK celler, stimulere cellerne på dag 0 med bestrålede feeder celler i forholdet 1:1 og udføre elektroporation på dag 5 eller 6 eller 7. Erstatte medierne hver anden dag, som beskrevet tidligere og dagen før transduktion.
- På dagen for elektroporation, forberede en T25 kolbe fyldt med 8 mL frisk RPMI indeholder 100 IE/mL af IL-2 for celler gennemgår elektroporation og pre incubate kolber i en fugtig 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
Bemærk: Optøede celler eller celler, der har gennemgået 2nd eller 3rd stimulation kan blive electroporated på ethvert tidspunkt efter deres genopretning som beskrevet. - Tage 3-4 × 106 celler pr. betingelse for 26 µL af transduktion mix.
Bemærk: Meget høj koncentration af NK celler i elektroporation løsning forbedrer transduktion sats. - Vaske cellerne 3 gange med PBS til at fjerne alle FBS, som almindeligvis indeholder RNase aktivitet. Spin dem ned hver gang på 300 x g i 8 minutter.
Bemærk: Overveje 7 elektroporation betingelserne for Cas/RNPs som enkelt gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) og en kombination af to gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) og én kontrol med ingen Cas9/RNPs.
-
Danne crRNA:tracerRNA / komplekse
- Resuspend crRNAs (gRNA1, gRNA2 og gRNA3) og tracerRNA i 1 x TE løsning til endelige koncentrationer af 200 μM. Mix 2.2 μL af hver 200 μM gRNA med 200 μM tracerRNA som vist i tabel 3.
- Opvarme prøverne ved 95 ° C i 5 min og afkøles på bænk toppen til stuetemperatur (15-25 ° C). Butik genopslemmes RNA'er og crRNA: tracerRNA og komplekse ved-20 ° C til senere brug.
-
Danne RNP kompleks
Bemærk: for at spare tid, udgør de komplekse under vask RNP trin 4.1.5.- Enkelt crRNA:tracrRNA duplex reaktion, fortyndes Cas9 liv1975 til 36 μM som vist ved eksemplet i tabel 4.
- For kombination transduktion af crRNA:tracrRNA dobbelthuse, fortyndes Cas9 liv1975 til 36 μM, som det fremgår af eksemplet i tabel 5.
- Tilføje Cas9 liv1975 til crRNA:tracrRNA dobbelthuse langsomt mens hvirvlende pipette tip, over 30 s til 1 minut.
- Inkuber blanding ved stuetemperatur i 15-20 min. Hvis ikke klar til at bruge blandingen efter inkubation, holde blandingen på køl indtil brug.
-
Elektroporation
- Tilføje den hele supplement til elektroporation løsning P3 og opbevare det ved stuetemperatur.
- Resuspenderes celle (3-4 × 106 celler fra trin 4.1.5) i 20 μL af P3 primære 4 D elektroporation løsning. Undgå luftbobler mens pipettering.
Bemærk: cellerne bør ikke stå for længe i P3 løsning. - Straks tilføje 5 µL af RNP komplekse (trin 4.3) til cellesuspension.
- Tilføj 1 μL 100 μM Cas9 elektroporation forstærker til Cas9/RNPs/celle mix.
- Overfør RNPs-Cas9-celle mix i 20 μL elektroporation strimler.
- Forsigtigt trykke strips til at sørge for, at prøven dækker bunden af stripsene.
- Start 4D elektroporation system og vælg programmet da-138 .
5. post transduktion
- Lad cellerne hvile i 3 minutter i strimler.
- Tilføje 80 µL af den pre afbalancerede dyrkningsmedier til kuvette og forsigtigt overføre prøven i målekolber.
- 48 timer efter transduktion, udtrække genomisk DNA fra 5 × 105 celler for gen sletninger screening.
- Forstærke gen af interesse ved hjælp af primere designet i trin 3.2 med Taq DNA polymerase kits.
- Danne PCR-amplikon heteroduplexes for T7EI fordøjelse og Inkuber produktet i 30-60 minutter med en T7EI enzym i 37 ° C.
Bemærk: Den T7EI analyse er at foretrække for screening som det er hurtig, enkel og giver ren elektroforese resultater i forhold til brug af landinspektør assay. Men denne metode kan ikke registrere indsættelser og sletninger af < 2 baser, der er genereret af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) aktivitet i Cas9 RNPs eksperimenter14. - Køre fordøjet DNA på 1,5% agarosegel på 110 V i 30-45 minutter, hver 15 minutter visualisere gel.
- Stimulere resten af celler med mbIL21-udtrykker feeder celler i forholdet 1:1.
- Fem dage efter stimulation uddrag RNA for gen expression niveau ved hjælp af qPCR.
- Adfærd calcein assays som tidligere rapporteret12. Kort, indlæse målceller med calcein AM (i eksemplet vist, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY celler blev brugt). Forberede cytotoksicitet assays NK celler ved hvile natten over i IL2 (100 IE/mL) plus eller minus 10 ng/mL opløseligt TGFβ. Gennemføre calcein assays i den samme cytokiner som NK-celler var udhvilet i natten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporation effektivitet
For at optimere elektroporation af Cas9/RNPs, vi har testet 16 forskellige programmer med transduktion af normal god landbrugspraksis ikke rettet mod siRNA og DNA plasmid til NK-celler. Flow flowcytometri analyse viste, at EN-138 havde den højeste procentdel af celle levedygtighed og transduktion effektivitet (35% live normal god landbrugspraksis positive celler) for både partikler (figur 1 og figur 2). Interessant, var effektivitet ved hjælp af dette program for Cas9/RNPs elektroporation højere, som vi så 60% reduktion i TGFBR2 mRNA udtryk niveau (figur 5). Derudover kunne de genetisk modificeret NK celler dyrkes og udvidet til 30 dage og befrugtede (data ikke vist).
Mutation assay
Cas9/RNPs indeholdende gRNA2, gRNA1 + gRNA2 og gRNA3 havde vellykket TGFBR2 ectodomain gen knockout, men gRNA1 alene gøre ikke nogen T7E1 påvises indels (figur 3). Desuden angiver figur 4 held knockout af menneskelige HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) i udvidet menneskelige NK celler ved hjælp af kommercielt forudsat gRNAs. Ifølge band densitometri, proportional indel priser ved hjælp af gRNA1 + gRNA2 resulterede i 34% band for TGFBR2 modificeret NK celler, 25% for gRNA3 og 81% for HPRT gen modificeret NK-celler.
Gen expression niveau analyse
Som repræsentant for vores resultat viser figur 5 effekten af Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) på mRNA produktionsniveau af TGFBR2 ectodomain, analyseres af RT-PCR. Som det ses i grafen, faldt niveauet mRNA udtryk af målrettede genet betydeligt.
Cytotoksicitet
Som det ses i figur 6, efter inkubation gRNA1 + gRNA2, gRNA2 og gRNA3 modificerede Cas9/RNPs celler med TGFβ1, co kulturperler med DAOY celler; de modificerede celler viste ikke nogen betydelig nedgang i deres cytotoksicitet niveau i forhold til kontrolgruppen, som havde IL-2 i medierne om natten. Dette resultat viser, at Cas9/RNPs modificerede celler bevarer deres cytotoksicitet funktion TGFβ1 og viser, at de modificerede celler blev TGFβ1 resistente.
Figur 1. Disse tal viser elektroporation effektiviteten af siRNA og plasmid DNA udtryk for normal god landbrugspraksis i NK celler ved hjælp af programmet da-138. Som det ses her, er NK cellernes levedygtighed 77,5% og 35% af levende celler var normal god landbrugspraksis positive. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Denne figur viser rentabilitet og effektivitet fra en anden af de 16 programmer (DN-100) testet for elektroporation optimering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Cas9/RNPs-medieret TGFBR2 knockout i forbrændte (a) primære NK-celler (b) målt ved T7E1 mutation assay. T7E1 enzym genkender og kløver uoverensstemmende DNA. Hver lille band (blå pile) repræsenterer fordøjet DNA-fragmenter, som bærer en indel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4. Cas9/RNPs - medieret HPRT forstyrrelser i udvidet NK celler målt ved T7E1 mutation assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. mRNA udtryk niveau af TGFBR2 ectodomain i CRISPR modificeret NK celler indført ved Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) ved hjælp af RT-PCR. GAPDH blev brugt som en endogen kontrol genet. Reduktion i RNA niveauet angiver en afbrydelse af TGFBR2-genet (betyde ± SEM, P-værdi < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. a. Cytotoksicitet analysen ved hjælp af et repræsentativt udsnit af Cas9/RNPs modificeret (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 og gRNA3) NK celler viser at natten inkubation af celler med TGFβ1 ikke falde betydeligt deres evne til at lyse DAOY celler. b. sammenlignet med ikke-modificeret NK celler, Cas9/RNP modificeret NK celler (gRNA2 og gRNA3) er mindre følsomme over for TGFβ1 (mener ± SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| gRNA nr. | gRNA sekvens | Bestilt som syntetiske crRNA | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Tabel 1. Tre designet gRNAs til at målrette exon 4 af TGFBR2 ectodomain som syntetisk crRNA.
| TGFBR 2 ectodomain primere FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain Primer REV | 5 GGG FTT GAG AAT CTG KAT TTA 3 |
Tabel 2. Primere, der anvendes til at forstærke TGFBR2 ectodomain gen
| Komponent | Beløb (uL) |
| 200 µM crRNA | 2.2 |
| 200 µM tracer RNA | 2.2 |
| IDTE Buffer | 5.6 |
| Slutproduktet | 10 |
Tabel 3. Danne crRNA:tracerRNA / komplekse bruger 200 µM RNA'er
| Komponent | Beløb (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (fra trin 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 liv1975 (61 µM stock) | 2 |
| Samlede volumen | 5 ul |
Tabel 4. Enkelt crRNA:tracrRNA duplex reaktion, fortyndes Cas9 liv1975 til 36 µM.
| Komponent | Beløb (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (ex. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA duplex (ex. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 liv1975 | 2 |
| Samlede volumen | 5 ΜL |
Tabel 5. For kombination fortyndes transduktion af crRNA:tracrRNA dobbelthuse Cas9 liv1975 til 36 µM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-afhængige ændring af NK celler har udfordrende4,9. Vi, derfor indført direkte en syntetisk præfabrikerede ribonucleoprotein (RNPs) kompleks og Cas9 protein som oprenset protein i primær og udvidet NK celler8. Denne metode er tilladt os at fjerne udjævningen, hale, og andre processer, transcriptional og translationel startet af RNA polymerase II, som kan forårsage NK celle apoptose forbundet med DNA-afhængige transduktion metoder.
Derudover bruger metoden rapporteret her renset Cas9 protein kompleksbundet som Cas9/RNPs, som er aktive umiddelbart efter elektroporation og er nedbrudt hurtigt og dermed øge på mål og faldende off target effekter over nuværende protokoller 5 , 6 , 7 , 16. Derudover optimere en ny elektroporation metode for at transduce Cas9/RNP med høj effektivitet er et kritisk skridt indført her, som er gældende for alle andre gener af interesse. Denne metode kan skaleres til ændring af et større antal NK celler ved hjælp af kommercielt tilgængelige større elektroporation kuvetter (data ikke vist).
I Resumé, kan Cas9/RNPs bruges til genetisk ændre menneskers primære og udvidet NK celler for cancer immunterapi udnytter den ovenfor beskrevne metode. Vores resultater viste også, at en vellykket knockout af TGFBR2 ectodomain -genet fører til disse modificeret NK celler bliver TGFβ1 resistente11.
Kombinere RNP levering med en kilde af DNA-template (som naturligvis recombinogenic adeno-associeret virus (AAV) donor vektorer) kan aktivere lokationsspecifikke gen indsættelse af homologe rekombination3,18,19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL serverer/har fungeret som konsulent for kurer Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck forskningslaboratorier og Miltenyi Biotec og har equity/lederskab i CytoSen Therapeutics.
Acknowledgments
Vi anerkender Brian Tullius for hans venlige hjælp i redigering håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
