Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعديل الخلايا الأساسي أو الموسع البشرية القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) ريبونوكليوبروتينس Cas9 (Cas9/رنبس) باستخدام جينياً. باستخدام هذا البروتوكول، أنشأنا ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية قاصرة تحويل مستقبلات عامل النمو – ب 2 (TGFBR2) هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيراسي 1 (HPRT1).
Abstract
تسارع التكنولوجيا كريسبر/Cas9 هندسة الجينوم في العديد من أنواع الخلايا، ولكن حتى الآن، إيصال الجينات وتعديل الجينات مستقرة تحديا في الخلايا الأولية من ناغورني-كاراباخ. على سبيل المثال، أدت إلى تسليم التحوير باستخدام توصيل لينتيفيرال أو الفيروسات التراجعية عائد محدود من الخلايا ناغورني كاراباخ المهندسة وراثيا بسبب ناغورني كاراباخ المرتبطة بالإجراء كبيرة الخلية المبرمج. ونحن هنا وصف أسلوب خال من الحمض النووي للتحرير الجينوم البشري خلايا ناغورني كاراباخ الأساسية وتوسيع نطاق استخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين Cas9 (Cas9/رنبس). يسمح هذا الأسلوب كفاءة بالضربة القاضية TGFBR2 و HPRT1 الجينات في الخلايا ناغورني كاراباخ. RT-PCR البيانات أظهرت انخفاضا كبيرا في مستوى التعبير الجيني، واقترح الإنزيم سيتوتوكسيسيتي منتج خلية الممثل أن الخلايا المعدلة رنب ناغورني كاراباخ أصبح أقل حساسية ل TGFβ. يمكن أن تكون الخلايا المحورة وراثيا انهانسر وظيفة الموسعة بالتحفيز مع الإعراب عن mbIL21 المشع الخلايا المغذية.
Introduction
وقد طرحت المناعي السرطان في السنوات الأخيرة. خلايا تي مستقبلات (السيارات) مستضد تشيميريك المعدلة وراثيا مثال ممتاز لهندسة الخلايا المناعية بنجاح نشر في العلاج المناعي السرطان. هذه الخلايا وقد أقر مؤخرا إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج ضد CD19 + B خلايا الأورام الخبيثة، ولكن النجاح كان محدودا للأمراض آخذة المستضدات استهدافها قليلة حتى الآن، وتستهدف هذه المراجع مستضدي محدودة عرضه للفشل بالهروب محصنة. وعلاوة على ذلك، تركزت على استخدام خلايا تي ذاتي خلايا "تي السيارة" بسبب خطر الفساد – مقابل – المضيف الأمراض الناجمة عن خلايا تي متمكنة. في المقابل، ناغورني كاراباخ الخلايا قادرة على قتل الورم الأهداف بطريقة مستقلة عن مستضد ولا تسبب GvHD، مما يجعلها مرشح جيد للسرطان المناعي6،7،،من89.
تكنولوجيا كريسبر/Cas9 وقد استخدمت مؤخرا في هندسة الخلايا المناعية، ولكن وراثيا إعادة برمجة الخلايا ناغورني كاراباخ مع البلازميدات كانت دائماً صعبة. وكان هذا بسبب صعوبات في إيصال التحوير بطريقة تعتمد الحمض النووي مثل توصيل لينتيفيرال والفيروسات التراجعية يسبب الكبيرة المرتبطة بالإجراء ناغورني كاراباخ الخلية المبرمج ومحدودية إنتاج الخلايا المحورة وراثيا في ناغورني كاراباخ4 , 9.
العديد من الخلايا المناعية الفطرية التعبير عن مستويات عالية من مستقبلات لأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة مثل جين إيندوسيبلي-حمض الريتينويك أنا (تلاعب-أنا)، التي تمكن من الاعتراف المتزايد بالدنا الأجنبي. ومكن قمع هذه المسارات أعلى كفاءة توصيل في ناغورني كاراباخ الخلايا عند استخدام الأساليب القائمة على الحمض النووي للتعديل الوراثي10.
يصف لنا هنا طريقة استخدام خالية من الحمض النووي الجينوم التحرير من الابتدائي وتوسيع ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية استخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين Cas9 (Cas9/رنبس). Cas9/رنبس يتكون من ثلاثة مكونات، المؤتلف Cas9 البروتين الرصاصية مع الاصطناعية واحد-دليل الحمض النووي الريبي يتألف كرنا الرصاصية وتراسيرنا. هذه Cas9/رنبس قادرون ناهضة أهداف الجينوم بكفاءة أعلى بالمقارنة مع النهج المعتمدة على الحمض النووي الأجنبي سبب إيصالها كالمجمعات الفنية. بالإضافة إلى ذلك، قد تقلل التخليص السريع من Cas9/رنبس من الخلايا آثار خارج الهدف مثل تنظيم دورات تعريفية للمبرمج. وهكذا، يمكن استخدامها لإنشاء طرق الرافضة، أو الوظائف الإضافية تدق عندما جنبا إلى جنب مع الحمض النووي جزئ مثلى6،7. لقد أظهرنا أن انهانسر Cas9/رنبس هو طريقة سهلة وفعالة نسبيا أن يتغلب على القيود السابقة للتعديل الوراثي في الخلايا ناغورني-كاراباخ.
TGFβ هو سيتوكين كآبته رئيسية، مما يحول دون تفعيل ووظائف خلايا ناغورني كاراباخ. يقترح أن الاستهداف في مسار TGFβ يمكن زيادة وظائف الخلايا المناعية. نحن استهدفت منطقة ترميز اكتودومين TGBR2 الذي يربط TGFβ11. نتائج تمثيلية تظهر انخفاضا كبيرا في مستوى التعبير مرناً لهذه الجينات وكذلك إثبات أن الخلايا ناغورني كاراباخ تعديل تصبح مقاومة ل TGFβ. وبالإضافة إلى ذلك، تحتفظ الخلايا المحورة البقاء وإمكانات التكاثري، كما أنها قادرة على أن تكون وظيفة-انهانسر الموسعة باستخدام الخلايا المغذية المشع. ولذلك، الأسلوب التالي نهجاً واعداً للتلاعب وراثيا ناغورني كاراباخ الخلايا لأي زيادة السريرية أو لأغراض البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على المعاطف بافي المانحة صحية كمصدر المواد من "وسط ولاية أوهايو منطقة الصليب الأحمر الأمريكي". أن تكون البحوث إعفاء يحدده المؤسسية استعراض المجلس لجميع أنحاء البلاد مستشفى الأطفال هذا البحث.
1-الإنسان ناغورني-كاراباخ خلية تنقية والتوسع
- عزل ببمكس من معطف بافي12.
- طبقة 35 مل عينة معطف بافي في 15 مل من فيكل-باكو.
- الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 20 دقيقة دون الفرامل وجمع في ببمك من الواجهة.
- أغسل ببمكس المستردة ثلاث مرات بإضافة على الأقل تساوي حجم برنامج تلفزيوني، وتغسل سينتريفوجينج في 400 x ز لمدة 5 دقائق، ويسفط لجنة البرنامج والميزانية. يمكن عزل الخلية ناغورني كاراباخ في هذه المرحلة التي روسيتيسيب13.
- توسيع نطاق الخلايا ناغورني كاراباخ بحفز مع المشع 10 × 106 mbIL21-الإعراب عن تغذية الخلايا في الأيام 0 و 7 و 14. استبدال وسائط الإعلام مع ربمي الطازجة التي تحتوي على 10% FBS، 1% الجلوتامين و 1% "البنسلين والستربتوميسين"، و 100 وحدة دولية/مل من إيل-2 لحجم كامل وسائل الإعلام كل يوم.
2-جرنة تصميم واختيار
- اختر المكاني الجينوم محددة تستهدف، باستخدام أدوات الإنترنت، مثلاً، نكبي، الفرقة.
على سبيل المثال.
الوصف: تحويل عامل النمو مستقبلات بيتا 2 (TGFBRR2) اكتودومين
عرض السجل: PF08917
عرض InterPro: IPR015013
الوظيفة: 49-157 ألف
تسلسل المستهدفة: إكسون 4 جينات TGFBR2 (ENSG00000163513) - تصميم جرناس واستخدام أدوات ويب تصميم كريسبر مثل http://crispr.mit.edu و 'بينتشلينج'.
- أدخل في تسلسل الحمض النووي اخترته في الخطوة رقم 2، 1. اختيار الإنسان (hg 19) جينوم هدف. أدلة كريسبر (النيوكليوتيدات 20 متبوعاً تسلسل بام: نج) سيتم فحصها من التسلسل الذي بدأ في وقت سابق. ويظهر أيضا التطابقات المحتملة خارج الهدف في جميع أنحاء الجينوم المحدد.
- اختر جرناس ثلاث أفضل لها أعلى الدرجات، استناداً إلى معدلاتها في الهدف وخارج الهدف. على سبيل المثال، يبين الجدول 1 "الكشف كريسبر" مصممة لاستهداف إكسون 4 جينات TGFBR2 اقترحه كريسبر أدوات تصميم الويب.
- ترتيب "الكشف كريسبر" الاصطناعية الخاصة بتسلسل كرناس.
- تأمر مصانة، ترانساكتيفاتينج الحمض النووي الريبي (تراكرنا) للتفاعل من خلال التماثل الجزئي مع كرنا.
3-تصميم الحذف فحص كبسولة تفجير
- تصميم كبسولة تفجير تمتد مواقع الانقسام جرنة للمقايسة الطفرة T7E1.
- استخدام أجهزة الإشعال على الأقل 100 bp بعيداً عن موقع الانقسام والمتنبأ بها لضمان حذف الإدراج الصغيرة (إينديلس) في موقع الهدف سجرنا ستظهر على 1.5% [اغروس] هلام عقب المقايسة الطفرة. ويبين الجدول 2 كبسولة تفجير التي تستخدم لتضخيم اكتودومين TGFBR2.
4-توصيل الخلايا البشرية ناغورني كاراباخ الأساسية والموسعة
ملاحظة: يتم توصيل العناصر Cas9/رنبس في ناغورني كاراباخ انهانسر استخدام نظام د 4 على النحو التالي.
-
خلية إعداد
- لخلايا أولية في ناغورني-كاراباخ، احتضان خلايا ناغورني كاراباخ طازجة معزولة في المتوسط ربمي حضور 100 وحدة دولية/مل من إيل-2 لمدة 4 أيام وأداء انهانسر في يوم 5. استبدال وسائط الإعلام كل يوم كما هو موضح في وقت سابق وقبل توصيل اليوم.
- لتوسيع نطاق ناغورني كاراباخ الخلايا، تحفز الخلايا في اليوم 0 مع الخلايا المغذية المشع بنسبة 1:1 وأداء انهانسر في اليوم 5 أو 6 أو 7. استبدال وسائط الإعلام كل يوم كما هو موضح في وقت سابق وقبل توصيل اليوم.
- في يوم انهانسر، تعد قارورة T25 مليئة 8 مل ربمي الطازجة التي تحتوي على 100 وحدة دولية/مل من إيل-2 للخلايا التي تمر انهانسر وقوارير إينكوباتي مسبقاً في حاضنة2 CO 37 درجة مئوية و 5% هوميديفيد.
ملاحظة: المذابة في الخلايا أو الخلايا التي مرت 2nd أو 3rd التحفيز يمكن أن اليكتروبوراتيد في أي وقت بعد شفائهم كما هو موضح. - تأخذ 3-4 × 106 خلايا كل شرط ميليلتر 26 من مزيج توصيل.
ملاحظة: ويعزز تركيزات عالية جداً من الخلايا ناغورني كاراباخ في حل انهانسر معدل توصيل. - تغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة جميع FBS، الذي يتضمن عادة نشاط رناسي. تدور لهم أسفل كل مرة في 300 x ز لمدة 8 دقائق.
ملاحظة: النظر في شروط انهانسر 7 Cas/رنبس كواحد من جرنة (gRNA1، gRNA2، gRNA3)، ومزيج من اثنين من جرناس (gRNA1 gRNA2، gRNA1 gRNA3، gRNA2 + gRNA3) وعنصر تحكم واحد مع لا Cas9/رنبس.
-
تشكل في crRNA:tracerRNA/المعقدة
- ريسوسبيند كرناس (gRNA1 و gRNA2 و gRNA3) وتراسيرنا في 1 × الحل TE التركيزات النهائية عن 200 ميكرومتر. 2.2 مزيج ميكروليتر من كل جرنا 200 ميكرومتر مع 200 ميكرومتر تراسيرنا كما هو مبين في الجدول 3.
- الحرارة في العينات من 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والسماح لتبرد في أعلى هيئة لدرجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية). مخزن حراكه الكشف وكرنا: تراسيرنا/المعقدة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
-
شكل المجمع رنب
ملاحظة: توفيرا للوقت، تشكل رنب معقدة أثناء الغسيل خطوة 4.1.5-- لرد فعل مزدوج crRNA:tracrRNA واحد، يؤدي إلى تمييع اندونوكليسي Cas9 إلى 36 ميكرومتر كما يتضح من المثال الوارد في الجدول 4.
- لتوصيل مجموعة من crRNA:tracrRNA الدوبلكس، تمييع اندونوكليسي Cas9 إلى 36 ميكرومتر كما هو موضح بالمثال في الجدول 5-
- إضافة اندونوكليسي Cas9 crRNA:tracrRNA الدوبلكس ببطء بينما يحوم نصيحة ماصة، أكثر من 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
- احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. إذا كان غير مستعد لاستخدام الخليط بعد الحضانة، الحفاظ على الخليط على الجليد حتى الاستخدام.
-
انهانسر
- إضافة ملحق كامل لحل انهانسر P3 ويبقيه في درجة حرارة الغرفة.
- ريسوسبيند بيليه الخلية (3-4 × 106 خلايا من الخطوة 4.1.5) في 20 ميكروليتر الحل انهانسر د 4 الابتدائي P3. تجنب فقاعات الهواء أثناء بيبيتينج.
ملاحظة: لا ينبغي أن يترك الخلايا لفترة طويلة في حل P3. - إضافة 5 ميليلتر من رنب المعقدة (الخطوة 4، 3) فورا إلى تعليق خلية.
- إضافة مزيج ميكروليتر 1 من 100 ميكرومتر Cas9 انهانسر محسن Cas9/رنبس/الخلية.
- تحويل المزيج Cas9/رنبس/خلية إلى 20 ميكروليتر انهانسر شرائط.
- اضغط برفق الشرائط للتأكد من أن العينة تغطي الجزء السفلي من الشرائط.
- بدء تشغيل نظام انهانسر د 4 واختر البرنامج EN-138 .
5-وظيفة توصيل
- السماح للخلايا الراحة لمدة 3 دقائق في الشرائط.
- إضافة ميليلتر 80 وسائط الثقافة قبل متوازن إلى ومبومو ونقل العينة برفق في قوارير.
- 48 ساعة بعد توصيل، استخراج الحمض النووي من 5 × 105 خلايا للحذف الجينات الفحص.
- تضخيم الجينات للاهتمام باستخدام كبسولة تفجير تصميم في الخطوة 3، 2 مع مجموعات بوليميراز "الدنا بوليميراز".
- تشكل بكر أمبليكون هيتيرودوبليكسيس الهضم T7EI واحتضان المنتج لمدة 30-60 دقيقة مع إنزيم T7EI في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: T7EI والرزن المفضل للفحص كما سريعة وبسيطة ويوفر نظيفة التفريد النتائج مقارنة باستخدام مقايسة المساح. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا يمكن الكشف عن عمليات الإدراج والحذف من < 2 القواعد التي يتم إنشاؤها بواسطة نهاية غير المتجانسة الانضمام إلى نشاط (نج) في تجارب رنبس Cas914. - تشغيل الحمض النووي هضمها على 1.5% [اغروس] هلام في 110 V ل 30-45 دقيقة، كل 15 دقيقة تصور الهلام.
- حفز بقية الخلايا مع الإعراب عن mbIL21 تغذية الخلايا بنسبة 1:1.
- خمسة أيام بعد التحفيز استخراج الحمض النووي الريبي لمستوى التعبير الجيني باستخدام قبكر.
- إجراء فحوصات كالسين كما ذكر سابقا12. بإيجاز، تحميل الخلايا المستهدفة مع كالسين صباحا (في المثال الموضح، واستخدمت 3 ميكروغرام/مل/1,000,000 ضاوي الخلايا). إعداد الخلايا ناغورني كاراباخ لفحوصات سيتوتوكسيسيتي بالراحة بين عشية وضحاها في IL2 (100 وحدة دولية/مل) زائد أو ناقص 10 نانوغرام/مل TGFβ القابلة للذوبان. إجراء فحوصات كالسين في السيتوكينات نفسها كما كانت تقع الخلايا ناغورني كاراباخ في ليلة وضحاها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكفاءة انهانسر
لتحسين أمثلية انهانسر من Cas9/رنبس، اختبرنا 16 برامج مختلفة مع توصيل siRNA عدم استهداف بروتينات فلورية خضراء وبلازميد الحمض النووي داخل الخلايا ناغورني كاراباخ. التدفق الخلوي التحليل أظهر أن EN-138 بأعلى نسبة من الخلية الكفاءة على البقاء وتوصيل (35% يعيش بروتينات فلورية خضراء إيجابية الخلايا) لكل الجسيمات (الشكل 1 و الشكل 2). من المثير للاهتمام، وكفاءة استخدام هذا البرنامج انهانسر Cas9/رنبس كان أعلى كما رأينا بتخفيض 60% في مستوى التعبير مرناً TGFBR2 (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تزرع ناغورني كاراباخ الخلايا المحورة وراثيا وموسعة لمدة 30 يوما و cryopreserved (البيانات لا تظهر).
الطفرة بالانزيم
Cas9/رنبس التي تحتوي على gRNA2، gRNA1 + gRNA2 و gRNA3 اكتودومين TGFBR2 نجاح الجينات خروج المغلوب، لكن gRNA1 وحدها لا تجعل أي إينديلس T7E1 لا يمكن اكتشافها (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، الشكل 4 تشير إلى نجاح الضربة القاضية للبشرية HPRT1 (فوسفوريبوسيلترانسفيريز هيبوكسانثيني 1) في توسيع نطاق الخلايا ناغورني كاراباخ البشرية تستخدم تجارياً جرناس. وفقا لقياس كثافة الفرقة، إينديل يتناسب مع معدلات استخدام gRNA1 + gRNA2 أدت إلى الفرقة 34% لتعديل TGFBR2 الخلايا ناغورني كاراباخ، 25 في المائة ل gRNA3 و 81% للجينات هبرت تعديل الخلايا ناغورني كاراباخ.
والرزن مستوى التعبير الجيني
كممثل لنا النتيجة، يبين الشكل 5 أثر Cas9/رنبس (gRNA1 + gRNA2) على مستوى الإنتاج مرناً من اكتودوماين TGFBR2، تحليلها بواسطة RT-PCR. كما يتضح في الرسم البياني، انخفض مستوى التعبير مرناً من الجينات المستهدفة إلى حد كبير.
سيتوتوكسيسيتي
كما هو موضح في الشكل 6، بعد حضانة gRNA1 + gRNA2 و gRNA2 و gRNA3 Cas9/رنبس تعديل الخلايا التي تحتوي على TGFβ1، شارك مثقف مع خلايا ضاوي؛ الخلايا المعدلة لم تظهر أي انخفاض كبير في مستوى سيتوتوكسيسيتي بالمقارنة مع مجموعة المراقبة الذي كان إيل-2 في وسائل الإعلام بين عشية وضحاها. هذه النتيجة تبين أن الخلايا Cas9/رنبس تعديل الاحتفاظ بوظيفتها سيتوتوكسيسيتي حضور TGFβ1 ويظهر أن الخلايا المعدلة أصبح TGFβ1 مقاومة.
رقم 1- وتبين هذه الأرقام كفاءة انهانسر siRNA وبلازميد الحمض النووي معربا عن التجارة والنقل في ناغورني كاراباخ الخلايا باستخدام برنامج EN-138. كما يتضح هنا، هو بقاء الخلية ناغورني كاراباخ 77.5 في المائة، ونسبة 35 في المائة من الخلايا الحية كانت إيجابية على التجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2- يظهر هذا الشكل الجدوى والكفاءة لآخر من البرامج 16 (DN--100) اختبار للتحسين انهانسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3- Cas9/رنبس-بوساطة TGFBR2 خروج المغلوب في أنفقت (أ) "الابتدائية ناغورني-كاراباخ" الخلايا (ب) تقاس بمقايسة الطفرة T7E1. تسلم الإنزيم T7E1 وكليفس الحمض النووي غير متطابقة. ويمثل كل فرقة صغيرة (الأسهم الزرقاء) هضمها شظايا من الحمض النووي التي تحمل إينديل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4- Cas9/رنبس-وساطة تعطل هبرت في توسيع ناغورني كاراباخ الخلايا تقاس بمقايسة الطفرة T7E1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5- تعديل مستوى التعبير مرناً من اكتودومين TGFBR2 في كريسبر الخلايا ناغورني كاراباخ عرضته Cas9/رنبس (gRNA1 + gRNA2) باستخدام RT-PCR. جابده كجينات الرقابة ذاتية. خفض مستويات الجيش الملكي النيبالي يشير إلى حدوث اضطراب في الجينات TGFBR2 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، قيمة P < 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. أ تعديل الإنزيم سيتوتوكسيسيتي باستخدام عينة تمثيلية من Cas9/رنبس ('gRNA1' + 'gRNA2' و 'gRNA2' و 'gRNA3') يظهر خلايا ناغورني كاراباخ أن الحضانة بين عشية وضحاها للخلايا مع TGFβ1 ليس إنقاص بشكل ملحوظ قدرتهم على الخلايا ضاوي. باء بالمقارنة مع عدم تعديل ناغورني كاراباخ الخلايا، Cas9/رنب معدلة ناغورني كاراباخ الخلايا (gRNA2 و gRNA3) أقل حساسية ل TGFβ1 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| جرنة رقم | تسلسل جرنة | أمرت كرنا الاصطناعية | |||||
| gRNA1 | ككككتاككاتجاكتتاتك 5 3 | /AltR1/رارجروركرارورجرجرورارجرجرجرجرارجركرورورجرجرورورورورارجرارجركرورارورجركرو/AltR2/ | |||||
| gRNA2 | أتجكاكتكاتكاجاجكتاك 5 3 | /AltR1/رارورورجركراركروركراروركرارجرارجركروراركرجرورورورورارجرارجركرورارورجركرو/AltR2/ | |||||
| gRNA3 | أجتكاتجتاجججاجكتج 5 3 | /AltR1/رارج روركرا رورجرج رورارجرجرجرج رارجرك رورورج رجرورورورورا رجرارج ركرورا رورجركرو/AltR2/ | |||||
الجدول 1. ثلاثة تصميم جرناس لاستهداف إكسون 4 من اكتودومين TGFBR2 كرنا الاصطناعية.
| 2 تجفبر اكتودومين "إعادة توجيه أجهزة الإشعال" | 5 بليون طن من الكربون TGC TCC AGG TGA TGT نقل واكتساب التكنولوجيا T3 |
| TGFBR2 اكتودوماين REV التمهيدي | 5 عبدالله CCT اسكت صرفة CTG القط نقل واكتساب التكنولوجيا 3 |
الجدول 2. الإشعال المستخدمة لتضخيم الجين اكتودومين TGFBR2
| المكون | المبلغ (uL) |
| كرنا 200 ميكرومتر | 2.2 |
| 200 ميكرومتر الراسم الحمض النووي الريبي | 2.2 |
| أيدت المخزن المؤقت | 5.6 |
| المنتج النهائي | 10 |
الجدول 3. تشكل في crRNA:tracerRNA/معقدة باستخدام 200 ميكرومتر الكشف
| المكون | المبلغ (ميليلتر) |
| برنامج تلفزيوني | 1 |
| crRNA:tracrRNA المزدوجة (من الخطوة 4، 2) | 2 (200 بمول) |
| Alt-R Cas9 اندونوكليسي (61 ميكرومتر الأسهم) | 2 |
| الحجم الإجمالي | ماي 5 |
الجدول 4. لرد فعل مزدوج crRNA:tracrRNA واحد، يؤدي إلى تمييع اندونوكليسي Cas9 إلى 36 ميكرومتر.
| المكون | المبلغ (ميليلتر) |
| برنامج تلفزيوني | 1 |
| crRNA:tracrRNA المزدوجة (مثلاً: gRNA1) | 1 (بمول 100) |
| crRNA:tracrRNA المزدوجة (مثلاً: gRNA2) | 1 (بمول 100) |
| Alt-R Cas9 اندونوكليسي | 2 |
| الحجم الإجمالي | 5 ميليلتر |
الجدول 5. للجمع بين تمييع تنبيغ الدوبلكس crRNA:tracrRNA اندونوكليسي Cas9 إلى 36 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم الطعن في التعديل تعتمد على الحمض النووي للخلايا ناغورني كاراباخ4،9. نحن، ولذلك، أدخلت مباشرة مجمع صناعي بريفورميد ribonucleoprotein (رنبس) والبروتين Cas9 كالبروتين المنقي الابتدائي وتوسيع نطاق الخلايا ناغورني كاراباخ8. هذا الأسلوب يسمح لنا بالقضاء على وضع حد أقصى، المخلفات، وبدأت عمليات النسخي ومتعدية الجنسيات الأخرى بالحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني، مما قد يتسبب في ناغورني كاراباخ الخلايا المبرمج المرتبطة بأساليب توصيل تعتمد على الحمض النووي.
وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم الأسلوب ذكرت هنا تنقية البروتين Cas9 الرصاصية ك Cas9/رنبس، التي تنشط من فور انهانسر وهي تتدهور بسرعة، ومن ثم زيادة على الهدف وتقليل آثار خارج الهدف عبر البروتوكولات الحالية 5 , 6 , 7 , 16-وعلاوة على ذلك، تحسين نهج انهانسر جديد ترانسدوسي Cas9/رنب بكفاءة عالية خطوة حاسمة أخرى هنا، وعرض التي تنطبق على أي جينات أخرى تهم. يمكن الارتقاء بهذا الأسلوب لتعديل إعداد كبيرة من الخلايا ناغورني كاراباخ باستخدام المتاحة تجارياً أكبر انهانسر الترعة (البيانات لا تظهر).
وباختصار، يمكن استخدام Cas9/رنبس وراثيا تعديل الخلايا ناغورني كاراباخ البشرية الأساسية والموسعة للسرطان العلاج المناعي استخدام الأسلوب هو موضح أعلاه. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أيضا أن بالضربة قاضية ناجحة من الجينات اكتودومين TGFBR2 يؤدي إلى هذه الخلايا ناغورني كاراباخ تعديل تصبح مقاومة TGFβ111.
الجمع بين تسليم رنب مصدرا لقالب الحمض النووي (مثل الطبيعي ريكومبينوجينيك الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) المانحة ناقلات) قد تمكين الإدراج الجينات الخاصة بالموقع باقترانها مثلى3،،من1819 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL يقدم/وقد عمل كمستشار للمداواة ساعي والمداواة سبج والمداواة إينتيليا، مختبرات ميرك للأبحاث، وبها ميلتينيي، والإنصاف/القيادة في المداواة سيتوسين.
Acknowledgments
ونعترف توليوس ريان لمساعدته الكريمة في تحرير المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
