Summary
Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 tecnología está acelerando ingeniería del genoma en muchos tipos celulares, pero hasta el momento, genes y modificación genética estable han sido difíciles en primarias células de NK. Por ejemplo, entrega de transgenes mediante transducción retroviral o lentivirales dio lugar a una producción limitada de ingeniería genética de las células NK por sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células. Aquí describimos un método libre de ADN para la edición del genoma de humanos primarias y ampliadas las células NK mediante complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permite eficiente nocaut del TGFBR2 y HPRT1 genes en las células NK. Datos de RT-PCR demostraron una disminución significativa en el nivel de expresión del gen, y un ensayo de citotoxicidad de un producto representativo de la célula sugiere que las células NK modificado de RNP se hizo menos sensibles a TGFβ. Células genéticamente modificadas podrían ser ampliada post-electroporación por estimulación con mbIL21-expresando irradiado células de alimentador.
Introduction
Inmunoterapia de cáncer se ha avanzado en los últimos años. Las células T antígeno quimérico genéticamente del receptor (coche) son un excelente ejemplo de ingeniería células inmunes desplegado en inmunoterapia del cáncer. Estas células fueron recientemente aprobadas por la FDA para el tratamiento contra CD19 + B de células malignas, pero éxito hasta el momento se ha limitado a enfermedades teniendo unos antígenos targetable y dirigidas a tal limitado repertorio antigénico son propensa al fracaso por escape inmune. Además, las células de T del coche se han enfocado en el uso de células de T autólogas debido al riesgo de enfermedad injerto contra – host causado por células T trasplante allogeneic. En contraste, las células NK son capaces de matar a objetivos de tumor de manera independiente del antígeno y no causan Eich, que hace un buen candidato para cáncer inmunoterapia6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnología ha sido utilizada recientemente en células inmunes ingeniería y reprogramar genéticamente las células NK con los plásmidos ha sido siempre un reto. Esto ha sido debido a las dificultades en la entrega del transgen de una manera dependiente de ADN como transducción retroviral y lentivirales causando sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células y la producción limitada de ingeniería genética de las células NK4 , 9.
Muchas células inmunes innatas expresan altos niveles de receptores para patrones moleculares asociados a patógenos como gen inducible por ácido retinoico me (RIG-I), que permiten una mayor reconocimiento de ADN extraño. Supresión de estas vías ha permitido una mayor eficiencia de transducción en las células NK al utilizar métodos basados en DNA para la modificación genética10.
Aquí describimos el método para el uso de un genoma de ADN libre edición de primarias y expansión humana las células NK utilizando complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs se compone de tres componentes, recombinante proteína Cas9 complexed con sintético RNA solo guía conformada por un complejo crRNA y tracerRNA. Estos Cas9/RNPs son capaces de unirse genómicas objetivos con mayor eficiencia en comparación con los enfoques de ADN-dependiente extranjeras debido a su entrega como complejos funcionales. Además, separación rápida de Cas9/RNPs de las células puede reducir los efectos off-target como inducción de la apoptosis. Por lo tanto, puede utilizarse para generar knock-out o knock-ins cuando se combina con el ADN por recombinación homóloga6,7. Demostramos que la electroporación de Cas9/RNPs es un método fácil y relativamente eficiente que supera las limitaciones anteriores de modificación genética en las células NK.
TGFβ es una citocina inmunosupresora importante, que inhibe la activación y funciones de las células NK. Se ha sugerido que dirigidas a la vía TGFβ pueden aumentar las funciones inmunes celulares. Hemos dirigido la región codificación ectodominio TGBR2 que une TGFβ11. Resultados representativos muestran una disminución significativa en el nivel de expresión del mRNA de este gen y además demuestran que las células NK modificadas volverse resistentes a los TGFβ. Además, las células modificadas retienen la viabilidad y potencial proliferativo, son capaces de ser post-electroporación ampliada utilizando células de alimentador irradiados. Por lo tanto, el método siguiente es un enfoque prometedor para manipular genéticamente las células de NK para cualquiera más clínico o con fines de investigación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Buffy coats de donante sano se obtuvieron como material de la Central Ohio región Cruz Roja Americana. Esta investigación fue determinada para ser exento Investigación Hospital institucional Informe Junta de todo el país de los niños.
1. expansión y purificación de células NK humano
- Aislante PBMCs de la capa anteada12.
- Capa de 35 mL de muestra de la capa anteada en 15 mL de Ficoll-Paque.
- Centrifugar a 400 x g durante 20 minutos sin freno y recopilar la PBMC de la interfaz.
- Lavar las PBMCs recuperados tres veces mediante la adición de por lo menos un volumen igual de PBS, centrifugar a 400 x g durante 5 minutos y aspirando la PBC lavan. Células NK pueden ser aislado en esta etapa por el RosettesSep13.
- Expandir las células NK mediante la estimulación con irradiado 10 x 106 mbIL21-expresar las células de alimentador a los 0, 7 y 14 días. Sustituir los medios de comunicación con fresco RPMI con 10% FBS, 1% glutamina, 1% penicilina estreptomicina y 100 UI/mL de IL-2 para el volumen de los medios de comunicación todo cada día.
2. gRNA diseño y selección
- Elegir los loci genómicos específicos a destino, utilizando herramientas en línea, por ejemplo, NCBI, conjunto.
Ejemplo.
Descripción: Transformación del receptor del factor de crecimiento beta 2 (TGFBRR2) ectodominio
Ver registro: PF08917
Ver InterPro: IPR015013
Posición: 49-157 aa
Secuencia específica: Exón 4 del gen TGFBR2 (ENSG00000163513) - Para diseñar los gRNAs, herramientas CRISPR diseño web tales como http://crispr.mit.edu y 'Benchling.'
- Entrar en la secuencia del ADN elegida en el paso 2.1. Elegir a humanos (hg 19) como un genoma de destino. Guías de CRISPR (20 nucleótidos seguido de una secuencia de PAM: NGG) sea sometido a análisis de la secuencia entrada antes. También se muestra a posibles coincidencias de objetivo por todo el genoma seleccionado.
- Elegir el mejor tres gRNAs que tienen el puntaje más alto, basado en sus tasas en meta y objetivo. Por ejemplo, la tabla 1 muestra los RNAs CRISPR diseñado a exón 4 del gen TGFBR2 sugerido por herramientas de CRISPR diseño web.
- Orden de los RNAs CRISPR como crRNAs sintético de secuencia-específica.
- Orden conservado, transactivating RNA (tracrRNA) para interactuar a través de la homología parcial con el crRNA.
3. diseño eliminación cartillas de evaluación
- Diseño de primers que abarca los sitios de clivaje gRNA para ensayo de mutación de T7E1.
- Bp de cartillas al menos 100 uso del sitio de la hendidura prevista para asegurar la inserción-deleción pequeña (indels) en el sitio de destino sgRNA aparecerá en gel de agarosa al 1,5% siguiendo el ensayo de mutación. La tabla 2 muestra los iniciadores que se utilizan para amplificar el ectodominio de TGFBR2.
4. transducción de las células NK humanas de primaria y ampliado
Nota: Transducción de Cas9/RNPs elementos en NK realiza electroporación con sistema 4D como sigue.
-
Célula Preparación
- Para las células NK primarias, incubar células NK recién aisladas en Medio RPMI en presencia de 100 UI/mL de IL-2 por 4 días y realizar la electroporación en día 5. Sustituir los medios de comunicación todos los días como se describe anteriormente y el día antes de transducción de señales.
- Para las células NK expandidas, estimular las células en el día 0 con células de alimentador irradiados en una proporción de 1:1 y realizar la electroporación en día 5 o 6 o 7. Sustituir los medios de comunicación todos los días como se describe anteriormente y el día antes de transducción de señales.
- En el día de la electroporación, preparar un matraz T25 con 8 mL de RPMI fresco que contiene 100 UI/mL de IL-2 para las células que experimentaban la electroporación y frascos incubate previamente en un humidificado 37 ° C y 5% CO2 la incubadora.
Nota: Las células descongeladas o células que han sufrido 2nd o 3rd estimulación pueden ser electroporated en cualquier momento después de su recuperación como se describe. - Tomar 3-4 x 106 células por condición para 26 μl de mezcla de transducción de señales.
Nota: Muy alta concentración de las células NK en la solución de electroporación mejora la tasa de transducción de señales. - Lavar las células 3 veces con PBS para eliminar todos los FBS, que comúnmente contiene actividad Rnasa. Los hace girar cada vez a 300 x g durante 8 minutos.
Nota: Tener en cuenta 7 condiciones de electroporación para Cas/RNPs como una gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) y una combinación de dos gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + gRNA3) y un control con ningún Cas9/RNPs.
-
Formar el crRNA:tracerRNA / complejo
- Resuspender el crRNAs (gRNA1, gRNA2 y gRNA3) y tracerRNA en solución a concentraciones finales de 200 μM de TE 1 x. 2.2 mezcla μL de cada gRNA 200 μM con 200 μM tracerRNA como se muestra en la tabla 3.
- Calentar las muestras a 95 ° C por 5 min y dejar para enfriar sobre la mesa a temperatura ambiente (15-25 ° C). Tienda resuspendió RNAs y crRNA: tracerRNA/complejo a-20 ° C para su uso posterior.
-
Formar el complejo RNP
Nota: para ahorrar tiempo, forman el compleja durante el lavado la RNP paso 4.1.5.- Para crRNA:tracrRNA solo duplex reacción, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μM como se muestra en el ejemplo en la tabla 4.
- Para la transducción de la combinación de crRNA:tracrRNA dúplex, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μM como se muestra en el ejemplo de tabla 5.
- Añadir Cas9 endonucleasa a crRNA:tracrRNA dúplex lentamente mientras el remolino la punta de la pipeta, más de 30 s a 1 minuto.
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Si no está listo para utilizar la mezcla después de la incubación, mantenga la mezcla en hielo hasta su uso.
-
Electroporación
- Añadir el suplemento entero a la solución de electroporación P3 y mantenerlo a temperatura ambiente.
- Resuspender el precipitado de células (3-4 x 106 células de paso 4.1.5) en 20 μL de solución de electroporación de D 4 primaria P3. Evitar las burbujas de aire mientras el pipeteo.
Nota: las celdas no deben dejarse durante mucho tiempo en la solución de P3. - Inmediatamente añadir 5 μl de complejo RNP (paso 4.3) a la suspensión de células.
- Añadir 1 μL de 100 μM Cas9 electroporación el reforzador a la Cas9/RNPs/celda de la mezcla.
- Transferencia de mezcla Cas9/RNPs/cell en tiras de electroporación de 20 μL.
- Golpee suavemente las tiras para asegurarse de que la muestra cubre la parte inferior de las tiras.
- Iniciar sistema de electroporación de 4D y elegir el programa EN-138 .
5. post transducción
- Que las células descansar durante 3 minutos en las tiras.
- Añadir 80 μl de los medios de cultivo previamente equilibrado a la cubeta y suavemente, transferir la muestra en matraces.
- 48 horas después de la transducción de señales, extraer la DNA de genomic de 5 × 105 células para las canceladuras del gene de detección.
- Amplificar el gen de interés utilizando los cebadores diseñados en el paso 3.2 con kits de Taq ADN polimerasa.
- Forma de heterodúplex de amplicones PCR para la digestión T7EI e incubar el producto durante 30-60 minutos con una enzima T7EI en 37 ° C.
Nota: El T7EI es preferido para la detección es rápida, simple y proporciona limpiar resultados de electroforesis en comparación con el ensayo de topógrafo. Sin embargo, este método no puede detectar inserciones y canceladuras de < 2 bases que son generados por no homóloga se terminan uniendo actividad (NHEJ) Cas9 RNPs experimentos14. - Ejecutar el ADN digerido en 1.5% gel de agarosa a 110 V de 30-45 minutos, cada 15 minutos visualizar el gel.
- Estimular el resto de las células con expresión de mbIL21 células de alimentador en una proporción de 1:1.
- Cinco días después de la estimulación extraer el ARN para el nivel de expresión génica utilizando qPCR.
- Ensayos de conducta calceína según lo divulgado previamente12. Brevemente, cargar las células de la blanco con calceína AM (en el ejemplo mostrado, se utilizó las células DAOY de 3 μg/mL/1.000.000). Preparar las células de NK para los ensayos de citotoxicidad por descansar durante la noche en IL2 (100 UI/mL) más o menos 10 ng/mL solubilidad TGFβ. Realizar ensayos de calceína en las mismas citoquinas como las células NK se descansaban en la noche a la mañana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eficiencia de electroporación
Para optimizar la electroporación de Cas9/RNPs, probamos 16 programas diferentes con transducción de siRNA dirigidas no a GFP y plásmido de ADN en las células NK. Análisis de citometría de flujo mostraron que los EN-138 tenía el mayor porcentaje de viabilidad y transducción de la eficiencia de las células (células GFP vivo positivo de 35%) para ambas partículas (figura 1 y figura 2). Curiosamente, la eficacia de la utilización de este programa para la electroporación Cas9/RNPs fue mayor como se ha visto reducción de 60% en el nivel de expresión de mRNA de TGFBR2 (figura 5). Además, las células NK modificadas genéticamente podrían crecidas y ampliadas por 30 días y criopreservados (datos no mostrados).
Ensayo de mutación
Cas9/RNPs que contiene gRNA2, gRNA1 + gRNA2 y gRNA3 habían tenido éxito nocaut en gen TGFBR2 ectodominio, pero gRNA1 solo no hizo ninguna T7E1 detectable indels (figura 3). Además, figura 4 indica con éxito nocaut de HPRT1 humano (hipoxantina fosforribosiltransferasa 1) en células NK humanas ampliadas utilizando comercialmente proporcionado gRNAs. Según densitometría de la banda, las tarifas de indel proporcional con gRNA1 + gRNA2 dio lugar a la banda de 34% para TGFBR2 modificados a las células NK, 25% para gRNA3 y 81% para el gen HPRT modificaron células NK.
Ensayo de nivel de expresión genética
Como representante de nuestro resultado, la figura 5 muestra el efecto de Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) en el nivel de producción de ARNm de TGFBR2 ectodominio, analizado por RT-PCR. Como se ve en el gráfico, el nivel de expresión de mRNA específico del gene de la disminuyó significativamente.
Citotoxicidad
Como se ve en la figura 6, después de incubación a gRNA1 + gRNA2, gRNA2 y gRNA3 Cas9/RNPs modificado células con TGFβ1, co cultivadas con células DAOY; las células modificadas no demostró ninguna disminución significativa en su nivel de citotoxicidad en comparación con el grupo control que tuvo IL-2 en los medios de comunicación durante la noche. Este resultado demuestra que las células modificadas Cas9/RNPs conservan su función de citotoxicidad en presencia de TGFβ1 y demuestra que las células modificadas se convirtieron TGFβ1 resistente.
Figura 1. Estas cifras muestran la eficacia de la electroporación de siRNA y plásmido DNA expresión de GFP en células NK mediante el programa de EN-138. Como se ve aquí, la viabilidad de las células NK es 77.5% y 35% de células vivas fueron GFP positivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Esta figura muestra la viabilidad y la eficacia de otro de los 16 programas (DN-100) probado para la optimización de la electroporación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Golpe de gracia TGFBR2 Cas9/RNPs-mediada en gastado (a) principal NK células (b) medido por el ensayo de mutación de T7E1. T7E1 enzima reconoce y segmenta el ADN no coinciden. Cada pequeño grupo (flechas azules) representa fragmentos de ADN digeridos que llevan un indel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cas9/RNPs - mediado interrupción de la HPRT en células de NK ampliadas medido por ensayo de mutación de T7E1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. nivel de expresión de mRNA de TGFBR2 ectodominio de CRISPR modificado células NK por Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) mediante RT-PCR. GAPDH se utilizó como un gen de control endógeno. La reducción en los niveles de RNA indica una alteración del gen TGFBR2 (media ± SEM, valor de P < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. a. El ensayo de citotoxicidad utilizando una muestra representativa de Cas9/RNPs modificado (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 y gRNA3) muestra de las células NK que la incubación de las células con TGFβ1 no disminuye significativamente su capacidad de lisar las células DAOY. b. cuando se compara con las células de NK no modificada, la Cas9/RNP modificadas células NK (gRNA2 y gRNA3) son menos sensibles a TGFβ1 (media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| gRNA NO. | secuencia de gRNA | Ordenado como crRNA sintético | |||||
| gRNA1 | CCCCTACCATGACTTTATTC 5 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | ATTGCACTCATCAGAGCTAC 5 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 5 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Tabla 1. Tres diseñan gRNAs a exón 4 del ectodomain TGFBR2 como crRNA sintético.
| TGFBR 2 ectodominio cartillas FWD | TCC DE TGC 5 GTC AGG TG TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodominio Primer REV | 5 GGG CCT GAG AAT CTG GATO TTA 3 |
Tabla 2. Cebadores utilizados para amplificar el gen del ectodominio de TGFBR2
| Componente | Cantidad (uL) |
| CrRNA de 200 μm | 2.2 |
| 200 μm tracer ARN | 2.2 |
| IDTE Buffer | 5.6 |
| Producto final | 10 |
Tabla 3. Formar el crRNA:tracerRNA / complejo con 200 μm RNAs
| Componente | Cantidad (μL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (de paso 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonucleasa (61 acción de μm) | 2 |
| Volumen total | 5 ul |
Tabla 4. Para crRNA:tracrRNA solo duplex reacción, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μm.
| Componente | Cantidad (μL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (ej. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA duplex (ej. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonucleasa | 2 |
| Volumen total | 5 ΜL |
Tabla 5. Para la transducción de la combinación de crRNA:tracrRNA dúplex diluir Cas9 endonucleasa a 36 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modificación de ADN-dependiente de las células NK ha sido desafiante4,9. Nosotros, por lo tanto, introduce directamente un complejo de ribonucleoproteína sintéticamente preformado (RNPs) y proteína Cas9 como purificado de la proteína primaria y ampliado de las células NK8. Este método nos permitió eliminar el recubrimiento de jales, y otros procesos transcripcionales y traduccional Iniciado por ARN polimerasa II, que puede causar apoptosis de las células NK asociados con métodos de transducción dependiente de ADN.
Además, el método divulgado aquí utiliza proteína purificada Cas9 complejada como Cas9/RNPs, que se activa inmediatamente después de la electroporación y son degradados rápidamente, de tal modo aumentando en blanco y disminuyendo efectos off-target sobre los protocolos actuales de 5 , 6 , 7 , 16. Además, optimización de un nuevo enfoque de la electroporación para transducir Cas9/RNP con alta eficiencia es otro paso crítico introducido aquí, que son aplicables a cualquier otros genes de interés. Este método puede ampliarse para la modificación de un número mayor de células NK mediante cubetas de electroporación más grandes disponible comercialmente (datos no mostrados).
En Resumen, Cas9/RNPs puede utilizarse para modificar genéticamente humano primarias y ampliadas las células NK para inmunoterapia de Cáncer utilizando el método descrito arriba. Nuestros resultados también demostraron que un acertado golpe de gracia del gene del ectodominio de TGFBR2 conduce a estas células NK modificadas convirtiéndose en resistentes a TGFβ111.
Combinando entrega de RNP con una fuente de la plantilla de ADN (como recombinogenic naturalmente vectores de donantes virus adeno-asociado (AAV)) puede permitir la inserción génica específica por recombinación homóloga3,18,19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL sirve ha servido como consultor para Courier Therapeutics, terapéutica de obsidiana, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories y Miltenyi Biotec y tiene participación, liderazgo en la terapéutica de CytoSen.
Acknowledgments
Reconocemos Brian Tullius para su ayuda en editar el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
