Summary
Мы описываем протокол побудить атеросклероза в корня аорты ароЕ- / - мышей кормили с атерогенные диеты, посредством непрерывного освобождения альдостерона. Также описаны методы характеризовать состав зубного налета.
Abstract
Атеросклероз является из-за хронической воспалительной реакции, затрагивающих эндотелия и способствует ряд факторов, таких как артериальной гипертензии, дислипидемии и сахарного диабета. На сегодняшний день, есть доказательства в поддержку роли для циркулирующих альдостерона как фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Трансгенные мыши модели были созданы для изучения молекулярных и клеточных процессов, ведущих к атеросклероза. В этой рукописи мы описываем протокол, который использует преимущества непрерывной инфузии альдостерона в ароЕ- / - мышей и генерирует атеросклеротических бляшек в корня аорты после 4 недель лечения. Мы, таким образом, иллюстрируют метод количественного определения и характеристики атеросклеротических поражений на уровне корня аорты. Добавленной стоимости альдостерона настой представлена поколения атеросклеротических поражений богатые липидов и воспалительных клеток после 4 недель лечения. Мы подробно описать окрашивание процедуры для количественного определения липидов и макрофагов содержимое налета. В частности в настоящем Протоколе, мы выполняем сердце ткани встраивание в OCT для сохранения антигенностью сердечной ткани и облегчения выявления антигенов интерес. Анализ фенотипа доска представляет собой допустимый подход для изучения патофизиологии развития атеросклероза и выявления роман фармакологических цели в области развития анти атерогенные наркотиков.
Introduction
Атеросклероз является одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире1. Он характеризуется хронические воспалительные состояния, где кровеносные сосуды находятся проникли липиды и лейкоциты, которые определяют формирование атеросклеротических бляшек. Большинство острых сердечных событий связаны с тромботических вследствие разрыва зубного налета. Мемориальные доски подвержены разрыву определяются «уязвимых» и характеризуются увеличение проникновения провоспалительных лейкоцитов, некротические ядра и тонким волокнистым Кап2. В последние десятилетия клинических и экспериментальных исследований уточнили комплекс Патофизиология болезни. Несколько животных моделей используются для изучения молекулярных механизмов, участвующих в индукции атеросклероза3. В настоящее время мышь является наиболее часто используемых видов для изучения атеросклероза, несмотря на некоторые конкретные виды различий, существующих в патофизиологии по сравнению с людьми. В частности циркулирующих холестерина главным образом состоит из высокоплотного липопротеинов (с антиатерогенными свойствами) в моделях мыши, в то время как в организме человека холестерина циркулирующих транспортируется главным образом как липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), вероятно Представляя Главная причина, почему мышах одичал типа не развиваются спонтанное атеросклероза4. Кроме того мышей дикого типа обычно устойчивы к поглощая холестерин из рациона, в то время как люди поглощают около 50% диетического холестерина4. Чтобы преодолеть эти ограничения, были созданы несколько моделей генетически модифицированные мыши. Аполипопротеин E – дефицит мышь (ароЕ−/−) и ЛПНП рецепторов – дефицит мышь (LDLr−/−) широко используются. На высокой жирностью высокий холестерин диета мышей− −/ароЕ развивать налета более быстрыми темпами по сравнению с мышей−LDLr−/, и по этой причине, использование ароЕ мышей− −/ более широко, чем у LDLr/−−мышей5,6. Мышей− −/ароЕ развиться поражения на любой стадии атеросклероза и сопоставимы с теми, которые наблюдались в организме человека, хотя мыши бляшек не показывать нестабильной фенотип7. Как правило мышей− −/ароЕ спонтанно развитие атеросклероза и ускорить этот процесс с западной диете3. Тяжесть атеросклероза может оцениваться на уровне сонных, тромбоэмболии, бедренных и плечеголовной артерии и корня аорты6. В частности корня аорты представляет анатомические сайт, склонны к развитию атеросклеротических поражений у мышей. По этой причине это обычная практика для оценки формирования атеросклеротических бляшек в этом регионе.
Несколько исследований показали, что альдостерон замешан в развитии атеросклероза8,9,10. Настой альдостерона в ароЕ−/− мышей кормили атерогенные диета ускоряет развитие корня аорты атеросклеротических поражений, вызывая воспаление и липидов богатых налета формирования10.
В целом мы описываем протокол, включая альдостерона инфузии, атерогенные диета питание, встраивание тканей сердца, количественной оценки и характеристики атеросклеротических поражений в ароЕ- / - мышей. Эта процедура способствует эффективное формирование воспаленной, липидов богатых атеросклеротических бляшек и представляет собой ценный модель для изучения атерогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено итальянских национальных институтов здравоохранения и использования комитетов, авторизация номер 493/2016-PR. Все процедуры были проведены с требованиями Европейского сообщества для использования экспериментальных животных (Европейская директива, 2010/63/ЕС).
Примечание: Подкожной имплантации осмотические minipump, содержащих транспортное средство (этанола в физиологический раствор) или альдостерона (240 мкг кг-1 · d-1) в неделю 8-10-старых самцов мышей, недостаточно для гена ароЕ . В общем, 8-10 недели-старых самцов мышей−/− ароЕ весят около 25-26 g.
1. растворение альдостерона
- Растворяют 5 мг порошка альдостерона в 1 мл абсолютного этанола.
- 56.7 мкл альдостерона (растворимые в этиловом спирте) до 68,3 мкл физраствора с целью получения концентрации 2,27 мкг / мкл. заполнить весь осмотического minipumps полностью с 125 мкл этого решения (максимальная вместимость каждого minipump-125 мкл).
- Использовать скорость потока minipump 0.11 мкл/ч; Таким образом освобождается 2.64 мкл раствора каждые 24 ч. дать каждой мыши вокруг 6 мкг · d-1 альдостерона на 28 дней.
2. осмотический насос наполнения и имплантации
Примечание: Насосы поставляются в двух отдельных частей: основной части насоса и регулятор потока.
- Заполните и обрабатывать minipumps, используя хирургические перчатки.
Примечание: Кожу масла могут мешать выполнению minipumps. Следующие шаги должны выполняться в стерильных Ламинарный шкаф. - Придаем наполняющей трубки (поставляется с minipumps) 1 мл шприц и составить альдостерона решения или транспортного средства.
Примечание: Важно избежать давая воздух внутри шприца при аспирационных решения от трубки для предотвращения образования воздушных пузырей в насос. - Вставить наполняющей трубки через отверстие в верхней части minipump, до тех пор, пока он может идти не далее (Рисунок 1A-1В). Медленно заполните насос с альдостерона или транспортного средства. Обратите внимание на темные тени внутри насоса, указывающее уровень жидкости. Смотрите это повышение уровня наряду с заполнения насоса.
- Остановите заполнение насоса, когда поднимается шарик жидкость из корпуса насоса.
- Осторожно удалите наполняющей трубки и вставить регулятор потока в тело minipump (рис. 1 c). Убедитесь, что регулятор сидит плотно против корпуса насоса. Оставьте заполненные осмотических насосов в стакан, содержащие стерильным физиологическим раствором при 37 ° C до 24 ч до имплантации в мышь (грунтовки процедура).
- Проведение операции в обрабатываемой области с 70% этанола, что способствует асептики.
- Применяют 1-3 капли на сайте разрез бупивакаин 0,25% и анестезировать животное с 3% изофлюрановая. Включите поставки газа и расходомера для 500-1000 мл/мин место животного в зале индукции и уплотнение верхней. Включите испарителем до 5% изофлюрановая и контролировать мышь до лежа.
- Переключение системы на ураном. Удаление животное из камеры и позиции в ураном. В 2-3 минуты мышь начинает будить. Перезапустите газового потока с расходомером на 100-200 мл/мин и испарителем в 3% изофлюрановая.
- Обеспечение адекватной глубины анестезии перед выполнением процедуры тестирования педали вывода и глазной рефлексов. Контролировать дыхание и ответ на стимуляции во время процедуры и при необходимости измените испарителем.
- Защищайте роговицы от высыхания, применяя глазная мазь.
- Подготовьте животного, удаление волос с хирургической сайта с помощью бритвы (рис. 1 d). Обычный сайт для подкожной имплантации насосов — на задней.
- Подготовьте Хирургический сайт с нетканых площадку материал, насыщенный, с 70% изопропиловый спирт.
- Использование чистой и посвященный пространства (вылечить с 70% этиловом спирте) и покрыта стерильной пелерина. Место кончике инструментов в стеклянный шарик стерилизатор. Начать операцию с стерилизовать инструменты и обрабатывать документы асептически.
- Используйте Ножницы хирургические сделать 0,8-1 см разрез (около 2 см вблизи хвост), как показано в мультфильмов 1E-1F. Поддерживайте стерильность, не касаясь ничего вне хирургического выделенного пространства с стерильных перчаток или советы инструментов.
- Позаботьтесь, чтобы вырезать только кожи, но не основной ткани. Использование одной стороны провести щипцы для открытия разрез. Используйте другой стороны провести троакара распространить кожи для того, чтобы создать карман для насоса от задней вверх на лопатки (на правой или левой стороне мыши).
- Вставьте насос в разрез. Аккуратно задвиньте насоса в карман (Рисунок 1 H). Там должно быть достаточно кожи, чтобы закрыть рану не напряженности или растяжения кожи необходимы. После вставки насос шовные разрез с хирургии проволока (полиглактин 910 с швом размер 6-0)
Примечание: Глава регулятор должен быть ориентирована на передней части мыши (рис. 1 g). - Применять повидон/йод 10% мази с чистым тампоном (Рисунок 1I) и держать животное на потепление сцене. Не оставляйте мышей в автоматическом режиме, до тех пор, пока они восстановить грудной recumbency. Оценить состояние гидратации и администрировать 0,5 мл 0,9% физиологического раствора подкожно, в случае необходимости. Вернуть животное его обычного жилья.
- Следуйте институциональных руководящих принципов для документации (например, заполнить форму хирургические с оперативной и послеоперационные информации, обновление Кейдж карта с процедуры и дата) и обеспечивают анальгетиков (бупренорфина, 0,05 мг/кг), чтобы уменьшить послеоперационный боли и антибиотики (Энрофлоксацин 85 мг/кг) чтобы избежать хирургической инфекции.
- Продолжать ежедневный мониторинг и изучение признаков боли. Обратите внимание, что рана полностью закрыт и minipump поддерживается в подкожной карман. Рана может открыть и мышь может потерять minipump.
3. рассечение сердца
- В то время жертвоприношения, anestethize мышей с 80-100 мг/кг Zoletil ведении внутримышечно. Zoletil вызывает глубокий наркоз. Примечание: Убедитесь, что мышь на адекватной глубины анестезии перед выполнением процедуры тестирования на педаль и глазной рефлексов; мышь будет увлажненную хотя глубоко под наркозом. Откройте грудной полости, используя ножницы, щипцы, путем разрезания ребра боков к грудине, с грудины, убирается сторону головы.
- Тяжести перфузии системы с 10-15 мл ледяной Дульбекко фосфат буфер солевой раствор (PBS), а затем с 40-50 мл 10% нейтрального формалина буферизации исправить сосудистую perfuse мыши через левого желудочка. Фиксация обозначается когда мышей экспонат энергичные мышечных сокращений и стать жестким.
Примечание: Процесс фиксации занимает место в 10-20 мин. Это позволяет использовать фиксированный органов и тканей для выполнения иммунофлюоресценции или иммуногистохимия анализы. Важно отметить, что такой фиксированной тканей не может использоваться для экспрессии генов и западных blotting анализов. - Отделить сердце от аорты, держа сердце с щипцами и резать с ножницами или лезвие скальпеля, перпендикулярно к оси аорты, как можно ближе к сердцу без причинения ущерба (рисунок 2A). Используйте лезвие скальпеля резать поперек вдоль прямой линии, соединяющей точки нижнего правого и левого предсердия (рис. 2B).
- Заполнить верхнюю часть секционного сердца (через полость сердца) с оптимального раскроя соединений (OCT) (Рисунок 2D-2E). Положите ткань в пределах cryosection пластмасс с осью аорты, помещены перпендикулярно к основанию прямоугольной формы и крышка с октября (Рисунок 2F). Там должно быть без воздушный пузырь ловушку. Если любой пузырь отсутствует, попробуйте сместить его к краю.
- Установите металлическую пластину на сухой лед и затем тщательно надел плесень (рис. 2 g). Когда OCT становится белым, оберните прессформы с серебряной фольгой и затем хранить – 80 ° c.
4. режущие части корня аорты
- Установите машину криостата до 20 ° с. Перед выполнением резки, место встроенных ткани и оставить его там на около 15 минут, чтобы приспособиться к этой температуры. Установите температуру держатель образца-17 ° c (рис. 3A).
- Поместите Замороженное сердце блок внутри машины криостата сбалансировать температуры блока к тому из криостата (рис. 3B) и вывезти Замороженное сердце блока от плесени (рис. 3 c). Отрежьте избыток октября из замороженного блока лучше адаптировать блок размеры для держателя образца (рис. 3D).
- Смонтировать Замороженное сердце блок на держатель образца с желудочковой наружу (Рисунок 3E-3I) и вставьте держатель образца образца ориентация голову (Рисунок 3J). Отрегулируйте ориентацию держателя образца, чтобы режущий блок для того чтобы сделать корня аорты перпендикулярно лезвия (рис. 3 K).
- Вырезать блок и отбросить ломтиками, вплоть до корня аорты (рис. 3 L-3N). Собирать последовательные секции и разместить их на стеклянных вставках (Рисунок 3O). Контролировать корня аорты анатомический профиль под микроскопом, пока не появятся все 3 аортального клапана (рис. 3 P-3Q).
- Собирать разделы 10 мкм/раздел O красный нефти и Picro Сириус красного окрашивания и 6 мкм/раздел для MAC3 окраски (Рисунок 3R). Собирать вокруг слайды 6-8 (для каждого сердца) до один из трех клапанов исчезает или больше не является неизменным.
5. иммуногистохимии
Примечание: Все окрашивание шаги, сообщили в следующие протоколы выполняются в стеклянных Coplin окрашивание банок.
-
Нефтяные пятна красные O для нейтральных жиров
- Исправить разделы в 70 мл 37% формальдегида для 5 минут мыть хорошо в водопроводной воде и Помарки избыток воды.
- Разбавить 48 мл масла красный O (0,5% изопропиловый спирт) в 32 мл дистиллированной воды для получения масла красный O 0,3%.
- Пятно разделы в 70 мл масла красный O 0.3% за 10 мин мыть секций в водопроводной воды за 10 мин.
- Пятно на 1 мин в 70 мл гематоксилином Мейера. Вымойте секций в проточной воде в течение 1 мин.
- Погружайте разделы в 70 мл 0,5% лития карбоната. Промыть в проточной воде в течение 1 мин.
- Смонтируйте разделы с водной монтажа средних и захвата изображения, с помощью цифровой камеры, установленной на световой микроскоп.
-
Picro Sirius красное пятно на коллаген
- Вырезать 10 мкм Замороженные разделы и смонтировать в нижней части слайда.
- Исправьте разделы в 70 мл ацетона для 5 мин, воздух сухой и промыть кратко в дистиллированной воде.
- Место разделы в 70 мл 0,2% phosphomolybdic кислоты для 5 минут промыть кратко в дистиллированной воде.
- Место разделы в 70 мл 0,1% раствора Picro Сириус для 90 минут промыть один раз с 70 мл 0,01 N HCl. отменить решение.
- Место в 70 мл 0,01 N HCl на 2 мин полоскания кратко в дистиллированной воде. Сухой воздух.
- Место кратко в 70 мл, этанол 70%.
- Когда полностью высохнет, место в 70 мл очистки агента терпеновые происхождения и смонтировать разделы, с помощью поли (бутил метакрилат -co-метилметакрилат) на основе монтажа средних и захвата изображения с помощью цифровой камеры, установленной на световой микроскоп.
Примечание: Одним из преимуществ Picro Сириус красного окрашивания является, что это позволяет отличить тип I (толщиной волокон, желто-оранжевый двулучепреломления) и тип III (тонких волокон, зеленый двулучепреломления) коллагеновые волокна сетей поляризованной световой микроскопии11 .
-
Mac3 пятно для макрофагов пятнать
- Вырезать 6 мкм Замороженные разделы и смонтировать в нижней части слайда.
- Исправьте разделы в 70 мл холодного ацетона для 5 минут погрузиться в 70 мл PBS на 2 мин.
- С помощью пипетки, крышка секции с 1% натрия Додециловый сульфат (SDS) решение и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре (RT) для извлечения антигена. Погрузитесь в 70 мл PBS на 5 мин.
- С помощью пипетки, покрывают ломтики с перекисью водорода 0,3% на 20 мин мыть в 70 мл PBS 3 раза за 5 мин.
- Используйте авидин-биотин комплексы (ABC)-Комплект HRP для следующих шагов.
- С помощью пипетки, блокировать разделы в сыворотке нормальный кролика при комнатной температуре в течение 20 мин. Не смывать.
- Пятно с MAC3 (1: 300) за 90 минут на RT. мыть в 70 мл ФСБ 3 раза за 5 мин.
- Пятно с средней биотинилированным анти крыса IgG (1: 200) 45 мин на RT. полоскания с 70 мл PBS 3 раза за 5 мин.
- Охватывают разделы с ABC IgG кролика для 30 мин на RT. полоскания с 30 мл PBS 3 раза за 5 мин.
- Крышка секции с 3-амино-9-ethylcarbazole (АЭС) для 10 минут промыть с 70 мл дистиллированной воды в 10 раз.
- Пятно на 1 мин в 70 мл гематоксилином Мейера. Вымойте секций в проточной воде в течение 1 мин.
- Погружать секций в 70 мл 0,5% карбонат лития. Промыть в проточной воде в течение 1 мин.
- Смонтируйте разделы с водной монтажа средних и захвата изображения, с помощью цифровой камеры, установленной на световой микроскоп.
6. изображения анализ атеросклеротических поражений в разделах корня аорты
Примечание: Разделы корня аорты, окрашенных с O Красного масла или MAC3 или антитело интереса могут быть проанализированы с использованием соответствующего программного обеспечения (указанные в Таблице материалов). Общее число пикселей, окрашивание позитивные для компонента интерес нормируется в общую область зубного налета. Изображения были собраны и проанализированы следователем ослепил лечения.
-
Калибровка
- Откройте программное обеспечение, а затем выберите изображение (в jpg) для анализа.
- Выберите Главная | Создать | Быстрая калибровка.
- Настройка калибровки изображения путем рисования линии вдоль панели масштаб изображения.
- Сохраните настройки калибровки.
-
Анализ изображений
- Параметры меню выберите сохраненные установки калибровки | Пространственной калибровке вариант.
- Выберите калибровка | Применяются.
- Выберите инструмент «Многоугольник» в меню выбора и рисовать по периметру вдоль всех атеросклеротических поражений.
- Выберите Размер фото | Типы. В меню добавьте области и Процентов.
- Меню/Размер выберите руководство и новое окно откроется.
- В этом окне нажмите на инструмент выбора цвета на изображении и выберите режим HSI .
- Курсора мыши на позитивные пикселей маркера интерес для создания диапазона цветов.
- Нажмите на фото , и значение Sum, наблюдается в Таблице измерения, указывает процент области маркера (также выражается в мкм2) отношении Общая площадь атеросклеротических поражений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В 8-10 недель АПО- / - мышей, чтобы наполнить с транспортного средства или альдостерона были имплантированы minipumps (Рисунок 1E-1I) и откармливаются атерогенные (скорректированные калорий диета 42% от жира) за 4 недели. В конце лечения мышей были умерщвлены и увлажненную с PBS и формалина 10%, как описано выше. Корня аорты была отделена от Апикальная часть сердца и было закреплено в OCT (рис. 2). Поперечные сечения аорты корней были подготовлены для различных окрашивание с помощью криостата машины (рис. 3).
Атеросклеротических бляшек композиция может быть охарактеризовано путем пятнать для отдельных компонентов, которые определяют стадии развития зубного налета. Пятнать Красного O нефти используется для определения содержания липидов атеросклеротических поражений, как описано в шаге 5.1, пятнать Красного Sirius Picro используется для определения содержания коллагена, как описано в шаге 5.2 и Mac3 окрашивание используется для измерения содержания макрофагов описал в шаге 5.3. После 4 недель лечения с альдостерона мыши отображается значительное увеличение в липидов (рис. 4A-4 C) и макрофагов (рис. 4 d-4F) в атеросклеротических бляшек на уровне корня аорты, но не различия были наблюдается в содержание коллагена (Рисунок 4 g-4I) по сравнению с мышей, получавших с транспортного средства. Действительно альдостерона ускоренного атерогенеза в этой модели, вызывая воспаление сосудистой, но не фиброз (рис. 4).
Рисунок 1. Подготовка и внедрение осмотические minipump с транспортного средства или альдостерона. A-B) шаги, чтобы заполнить осмотического minipumps с транспортного средства или альдостерона. C) шаги для закрытия корпус насоса с регулятором расхода. D-F) Шаги для создания надрез для имплантации насоса на задней части мыши. G-I) Имплантация осмотические minipump и ушивания разреза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Подготовка для встраивания и вырезание сердца и корня аорты. A-B) сердце поперечно разрезается вдоль прямой линии, соединяющей точки нижнего правого и левого предсердия. Апикальная часть сердца обрабатывается для количественного определения состава атеросклеротических поражений в корня аорты. C) корня аорты от внутри сердца. D-E) Заполнение полости сердца с октября F) ориентации расчлененных сердце в форме предварительно заполнены с октября (полость сердца в направлении нижней части прессформы) G) замораживание расчлененных сердце с октября в плесени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Вырезание из корня аорты, используя микротом криостата. A) предварительно охладить криостат и установить нужную температуру для машины и Чак. B-D) Твердого блока OCT отделяется от плесени и избыток OCT вокруг сердца устраняется с помощью лезвия. E-я) Фиксируется блок OCT, с использованием жидкого OCT, на поддержку. J-K) Поддержка вставляется в патрон и ориентированы с желудочковой наружу. L-M) Раздел блок до тех пор, пока расчлененных сердце полностью подвержены. N-O) Задайте толщину 10 или 6 мкм и собирать кусочки на стекле. P-Q) Проверьте наличие всех трех клапанов под микроскопом. R) последующие фрагменты собраны, как показано, до тех пор, пока один или несколько клапанов больше не соблюдаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Количественная оценка состава атеросклеротических бляшек в альдостерон - или транспортное средство лечение ароЕ- / -. A-B) представителя Красного масла O окрашенных сечений корня аорты в неделю 8-10-старых мышей- / - ароЕ относились с транспортное средство (A) или (B) альдостерона и откармливаются атерогенные за 4 недели. C) количественного определения содержания липидов как процент от области положительный пятнать/всего налета. D-E) Представитель Mac3 окрашенных сечений корня аорты. F) количественного определения содержания макрофагов как процент от области положительный пятнать/всего налета. G-H) Представитель Picro Сириус красный витражи сечений корня аорты. я) количественного определения содержания коллагена в процентах от области положительный пятнать/всего налета. Значения выражаются как средний ± означает Стандартная ошибка (SEM; n = 6 для каждой группы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Атеросклероз является хроническим воспалительным расстройства, связанные с крупных и средних судов с участием взаимодействий между несколькими типами клеток, такие как макрофаги, Т-лимфоциты, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки1. Несмотря на ограничения мышиных атерогенные моделей доступен большой объем доказательств на атеросклеротического процесса. Эти модели имеют преимущество быстро генерировать экспериментальной когорты определенного возраста и пола. Мышь также показывают определенные и однородной генетический фон.
Развитие атеросклеротических бляшек, наблюдается в моделях мыши подвержены атеросклероза, частично напоминает, что в человеке, за исключением нестабильной бляшек формирования4. Разрыве налета и последующих тромбоза, главной причиной инфаркта миокарда у людей, не наблюдается в мышиных атерогенные модели. В наших последних работ, мы показали, что настой альдостерона способен вызвать, после 4 недель, нестабильная налета фенотип ароЕ- / -мышей кормили HFD10. В самом деле это лечение может увеличить области бляшки, содержание липидов и воспалительных области на уровне корня аорты, никакого существенного различия в содержании коллагена, по сравнению с необработанными мышей10. Следует отметить эти мыши Показать повышенное развитие гипертонии независимые атеросклероза, учитывая, что кровяное давление существенно не изменяется под альдостерона лечения10.
В настоящее время рукопись проиллюстрируем подробно технические процедуры для встраивания ткани сердца в OCT, а также последовательных шагов, т.е. корня аорты секционирование и налета анализу. По сравнению с парафином, OCT позволяет Секции подготовки с высоким диапазоном толщины (1-100 мкм) с криостата микротома и минимальным ткани обработки. Ограничения включают качество замороженных ткани, которая потенциально зависит от формирования кристаллов льда и можно изменить субцеллюлярные детали и создать артефакты, обнаруживаемая в иммуногистохимического окрашивания. Действительно считается, что лучше сохранить антигена и антигенностью криоконсервирования. В самом деле замороженные ткани сохранить структуру антигенов. Кроме того замороженные ткани для иммуногистохимии обработки позволяет избежать использования формалин, который представляет собой соединение, токсичными и канцерогенными.
Корня аорты является относительно простым для идентификации для гистологической обработки сайт. Этот анатомический сайт является золотым стандартом для изучения развития атеросклеротического поражения в подверженными атеросклероза мышей. Данные, полученные путем анализа этого конкретного региона позволяют сравнения среди мышей, принадлежащих к одной группы или различных экспериментальных групп. В самом деле при резании из корня аорты, это легко распознать конкретного региона характерно наличие всех трех клапанов. Для получения такого конкретного региона, строго рекомендуется обратить особое внимание на несколько важных шагов во время внедрения и секционирование. Важно заполнить полость в верхней части секционного сердца с октября, чтобы избежать образования воздушных пузырей в ткани, которая может поставить под угрозу целостность секций. Кроме того чтобы гарантировать, что угол резки точно перпендикулярно восходящей части аорты при резании, необходимо правильно ориентировать верхний секционного сердца, перпендикулярно нижней поверхности ткани плесени. Для того чтобы получить нетронутыми ломтиками, температура криостата должна быть точно при-20 ° C. В самом деле, более низкой температуры может повлиять на качество секций (т.е., лезвие может рухнуть разделов, что делает их непригодными для использования).
Следует отметить когда появляются три клапаны, рекомендуется сократить ткани с разной толщины, в зависимости от типа анализа, который будет выполняться. В самом деле, некоторые слайды будут использоваться для определения налета прогрессии, тогда как остальные слайды могут быть использованы для различных stainings (т.е., Picro Sirius, Mac3 и т.д.).
Атеросклеротических поражений у мышей, получавших с альдостерона появляются богатые липидов и макрофагов, характеризуются использованием нефти красный O (для окрашивания липидов), Mac3 (для окрашивания макрофагов), Сириус красный (для окрашивания коллагена) или другие специфические антитела для протеинов интереса. Важно подчеркнуть, что встраивание OCT, в отличие от парафина встраивание, избегает использования органических растворителей, которые удалить содержание липидов поражений. Таким образом липидов, окрашивание с маслом красный O осуществимо в Сен встроенные разделы и содержание липидов атеросклеротических бляшек может быть точно количественно.
В настоящее время рукопись мы показали, что настой альдостерона ценный метод для содействия атеросклероза в ароЕ- / - мышей. In fact, альдостерона вливания в ароЕ- / - мышей может: 1) увеличить активацию эндотелиальных клеток, как показано увеличение экспрессии молекул, участвующих в адгезии и миграции моноцитов на ранних стадиях атеросклеротических бляшек формирование12,13; и 2) повышение липидов и макрофагами провоспалительных содержание корня аорты на уровне10,13. Эти эффекты не обусловлены Гемодинамические эффекты альдостерона10. В заключение предлагаемый протокол представляет действительный метод для создания и характеризуют атеросклероз у мышей; Это могло бы помочь монитор ранних стадиях болезни и результаты терапевтического вмешательства и реабилитации при атеросклерозе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана от грантов от итальянского министерства здравоохранения (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 и PE-2011-02347070 для м.к.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
