Summary
Этот протокол описывает удаление и очистка легочной артерии эндотелиальных клеток (PAECs), которые придерживаться всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров, хотя они являются вклинивается в легочной артерии при катетеризации правых отделов сердца и остаются приверженцами дефлированный шар после удаления от тела пациента.
Abstract
Различных патологий привести к легочной гипертензии (рН), который определяется как среднее легочной артерии давление превышает 25 мм рт ст, в состоянии покоя. Для дальнейшей диагностики и управления PH, пациенты проходят неоднократные правых отделов сердца catheterizations (РЦГ) которой Swan-Ganz катетер продвигается в филиал легочной артерии и воздушный шар надувается клин катетера. Эта статья показывает протокол которой эндотелиальные клетки легочной артерии (PAECs) могут быть найденным всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров после RHC и очищенный с методом столбец сходства анти CD146 для очистки предполагаемый PAECs. Эти клетки могут использоваться для обеспечения на местах снимок биологического состояния эндотелия легочных сосудистую дополнить гемодинамики измерений, полученных в ходе RHC. Собирают и очищенный PAECs может использоваться для любой культуры клеток или последующее аналитических анализов например потока cytometery.
Introduction
Текущий США и европейские руководящие принципы требуют катетеризация правых отделов сердца для диагностики легочной гипертензии1. Врачи и ученые пытаются понять это заболевание желание биологических образцов от легких сосудистую дополнить гемодинамических данных, собранных во время RHC. К сожалению риск, связанный с легочной сосудистой биопсии очень высока, и поэтому биологических образцов легких сосудистую, редко, если когда-либо получить от жизни пациентов, перенесших RHC. Хотя много проницательность получил от сосудистой легочной ткани, полученные из трупной или описаны легких, эти примеры не могут отразить биологии процесс болезни рН, как она разворачивается в жизни пациента. В 2013 году мы впервые сообщили, что эндотелиальные клетки легочной артерии (PAECs) являются зачищенное от ветвей легочной артерии, физический контакт с всплывающую подсказку катетера Swan-Ganz во время RHC и могут быть восстановлены в небольших количествах от катетер советы После процедуры2.
Эта статья показывает нашу технику для удаления и очистки легочной артерии эндотелиальных клеток (PAECs) от всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров, после катетеризации правых отделов сердца. До сих пор методологии для выполнения этот метод урожая были описаны недостаточно подробно описаны в литературе для обеспечения единообразных результатов между лабораториями, выполнение метода. Эта статья предназначена для преодоления этого недостатка, предлагая визуализированных демонстрации техники, от постели сборник советов катетер для конечного продукта очищенный CD146 + эндотелиальных клеток. Этот метод должен помощь в продвижении исследований в pathobiology различных этиологий PH и привести к разработке новых диагностических анализов для дополнения гемодинамических данных, собранных в ходе RHC.
Важность этой техники к полю легочной сосудистой медицины и исследований, что он обеспечивает доступ к снимку биологии легочного эндотелия in situ и в отличие от предыдущих исследований на описаны или трупной легких, не представляют Конечная точка для субъекта легких. Недавно, мы показали, что анти apoptotic биомаркера в эти клетки могут иметь полезность в более точно фенотипирование связанных сортов легочная гипертензия3. Выход из клеток, полученных относительно мал, ~ 5, 000-25 000 PAECs на сэмпл и эти клетки являются сложным (но не невозможно) культуры. Мы считаем, что умные врачи и исследователи будут найти синергизма между этими методами компаньон выдвинуться легочной сосудистой исследования, диагностика и прогнозирование.
Protocol
Все исследования, описанного в этой статье были утверждены Советом по рассмотрению институциональных Аллеени сети здравоохранения. Все пациенты условии информированного согласия перед администрацией седативное агентов и исключения были определены назначаемое ряду исследование.
1. Тумба коллекции
Примечание: Все в этом протоколе должно быть сделано на льду, используя предварительно охлажденные решения. Важно побудить холодной застой в клетках для сохранения их на месте биологических фенотип. Этот протокол включает обработки крови и клетки, полученные от людей, и поэтому должны соблюдаться универсальных мер предосторожности.
- После вывода катетера из ножен немедленно погрузиться катетер в центрифуге Тюбик 50 мл, содержащие 40 мл охлажденного стерильного физиологического раствора. Вихрем катетер несколько раз для удаления крови и промойте линии при необходимости для удаления крови сохраняется в пределах линии.
- Отрезать дистальной 5 см кончик Кэт и позволить ему попасть в пластиковых пробирок 50 мл, содержащие охлажденные физиологического раствора. Немедленно удалите верхушку Кэт с щипцами и перенести его на пластиковых пробирок 15мл, содержащих 15 мл средний рост эндотелиальных клеток (EC).
- Уплотнение трубки, поместите его на льду и передачи в лабораторию подготовить для переработки или транспортировки. Важно, что шар остается погруженным в среде, поэтому убедитесь, что есть минимальный headspace в 15 мл, заполнив его полностью с ЕС среднего роста.
- Процесс выборки сразу перейти к шагу 2.1 или печать и корабль образца на мокрый лед на ночь для обработки в лаборатории, квалифицированных в этом протоколе. Если клетки в конечном счете будет использоваться для культуры клеток, это настоятельно рекомендуем, что кончик cath обрабатывается немедленно на том же сайте, на котором она была собрана.
2. ячейка урожай
Примечание: Все в этом протоколе должно быть сделано на льду, используя предварительно охлажденные решения. Клетки находятся в холодной застой, и важно избежать пробуждения их, пока они не готовы быть фиксированной или искусственного. Этот весь протокол должен выполняться в Ламинарный шкаф, используя стерильные инструменты, если конечной целью является культура собранного PAECs. Если культура не планируется (например, cytometry анализ потока), это не обязательно для стерильных предосторожности.
- Добавить 5 мл раствора отряд клеток в 15 мл пластиковых пробирок; место на льду.
- Заимствовать что оставшихся в постели коллекции трубки в 1 мл шприц 1 мл EC СМИ.
- Быстро завершить шаги 2.3 через 2.5. Сцепление отрезока концу катетера с hemostats.
- Осторожно вставьте иглу шприца 1 мл в «белый» отверстие напротив проволочный направитель («черная дыра»). Проявлять большую осторожность, чтобы избежать травм с иглой.
- Перевести кончик катода в 15 мл пластиковых пробирок, содержащая ячейку отряд решение.
- Надуть шар, стараясь не лопнул раздувания баллона с приблизительно 200 мкл СМИ работает хорошо.
- Разрешить катетер сидеть в ячейке отряд решения на льду за 5 мин с завышенным воздушный шар. Если шар сдувается на свой собственный в течение 5 минут инкубации, это приемлемо.
- Залейте содержимое пластиковых пробирок 15мл в блюдо 100 мм. Поместите шар в решении клетки отряда «волшебные».
- Скрип завышенных шар с скребок ячейки. Скребок ячейки можно обращается вокруг шар в круговом движении или чистки движения. Сосредоточиться на «поляки» шара, где он встречает катетера. Убедитесь, что ячейки скребок контакты всю поверхность шара по крайней мере дважды. Промойте скребковых ячейка в решении клетки отряда «волшебные» периодически.
- Дефлирования шар и скрип чистки движением. Промойте скребковых ячейка в решении клетки отряда «волшебные».
- Выбросите cath кончика, иглы и клеточной скребок в соответствующий контейнер для отходов.
- Залейте раствор отряд ячейки, содержащие ячейки урожай в 50 мл пластиковых пробирок. Shake коллекции трубки и залейте остальные СМИ из коллекции трубки собранных образцов также.
- Центрифугуйте образцы на 650 x g на 4 ° C на 10 мин. Важно отметить, что зачастую Пелле будет не видно. Это может быть полезно отметить место, где будет рассматриваться Пелле, если она видна, чтобы избежать аспирационных гранулы в случае, если он слишком мал, чтобы увидеть.
Примечание: Как правило Пелле виден только когда образца были загрязнены кровью. Заражение крови нематериального продукции конечной урожай, потому что кровь не удается привязать бисер CD146 и моет через колонку. Обширные испытания показал, что конкретные марки 1,5 мл microcentrifuge трубки ссылки в Таблице материалов минимизирует потери ячейки относительно других труб, используются во время оптимизации протокола. - Тщательно аспирационная СМИ и избежать беспокойства или аспирационных гранулы.
3. клетки очистки
Примечание: Все в этом протоколе должно быть сделано на льду, используя предварительно охлажденные решения. Клетки находятся в холодной застой, и важно избежать пробуждения их, пока они не готовы быть фиксированной или искусственного.
- Ресуспензируйте гранулы в 1 мл раствора лизис охлажденные красных кровяных клеток и передать его на трубку отцентрифугировать 1,5 мл; мягко рок 10 мин при 4 ° C.
- Центрифуги для 5 мин на 500 x g и 4 ° C. Аспирационная решение лизис РБК.
- Ресуспензируйте гранулы в 60 мкл PBS, 20 мкл блокатор FcR и 20 мкл микрошарики CD146 против человека. Инкубируйте 15 мин при 4 ° C.
- Добавьте 1 мл охлажденного PBS. Центрифуги для 5 мин на 500 x g и 4 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл охлажденного PBS.
- Разместите магнитные LS столбца на магнитные стойки (см. Таблицу материалы для конкретных коммерческих самобытности этих предметов) при комнатной температуре. Премьер столбца путем добавления 1 мл PBS и разрешить весь объем потока через. Отказаться от потока через.
- Поместите образец в столбце магнитные. Отказаться от потока через.
- Промойте колонку с 3 мл охлажденного PBS три раза. Отказаться от потока через от каждой стирки.
- Добавьте 3 мл охлажденной PBS для пластиковых пробирок 15мл. Удалите магнитные столбец из магнита, налейте в столбце 3 мл PBS из пластиковых пробирок 15мл и быстро поместить столбец в пластиковых пробирок поймать поток через. Сразу же окунуться с плунжера, поставляемые с колонной. Образец является теперь очищенный, готовы к фиксации/пятнать или культуры.
Representative Results
Этот протокол приводит к очищению клеток, из советы катетера Swan-Ganz после катетеризации правых отделов сердца, которые привязать к столбцу выбор CD146 и вперед сбоку разброс профили, которые неотличимы от искусственного человека первичной легочной артерии эндотелиальных клеток (рис. 1). Учитывая, что катетер шар находится в физический контакт с только интродьюсер ножны (материал клетки свободный), легочной артерии стенки сосуда, и кровь, данных предоставляется здесь продемонстрировать, что эти клетки не являются производными от крови (рис. 2) , и поэтому предполагается, что они действительно являются производными от стенки сосуда легочной артерии. Читателю следует отметить, что анти CD146 магнитные шарики, которые используются для очистки клетки остаются приверженцем клеточной поверхности после процедуры и, таким образом, это неоптимальной пытаться анализировать урожаи ячейки для CD146 как маркер эндотелиальных клеток. CD31 или других маркеров эндотелиальной предположительно будут доступны для маркировки и могут рассматриваться как альтернативы.
Были определены ключевые элементы настоящего Протокола, может повлиять на результаты. Во-первых это важно для промывания катетера в постели с целью удаления крови. Рисунок 3 показывает сторона точечной (SSC) / профили вперед точечной (FSC) потока через из столбца анти CD146 за один образец, который был надлежащим образом промыть и одно которое не было. Столбец, по-видимому, исключает клетки крови производные от урожаев (рис. 2), но полоща шаг обеспечит минимально возможное загрязнение от циркулирующих эндотелиальные клетки (которые обычно присутствуют в < 50 клеток/мл крови4). Мы заметили что элюата от CD146, столбец является полностью ясно, даже в случае очень Кровавая катетер кончик образцы. Это предполагает, что столбец является возможность обрабатывать значительные количества крови без забивания или сохранения номера-CD146 + передающиеся через кровь клетки.
Во-вторых важно раздувать всплывающая подсказка по крайней мере один раз на этапе клетки отряд решение/ячейку скребок. Учитывая, что предполагаемый PAECs на всплывающей подсказке остаются сторонником несмотря солевые полоскания шаг, вполне вероятно, они могут быть частично захваченных складки в виниловый шар как она дефлированный в рамках подготовки к удалению от пациента. Предположительно шаг инфляции освобождает PAECs, позволяя им быть аккуратно царапины прочь. Это не сразу понятно, одно может проверить эту гипотезу, но было отмечено снижения урожайности клеток, когда шар не является завышенным (данные не показаны).
Наконец важно отметить, что урожайность PAECs, производные от данного метода может существенно различаться. Предположительно пациент-, болезни государства - и врач специфические факторы способствуют этой изменчивости, как протокол не содержит шаги, которые будут, как ожидается, привести к крупным потерям исходного материала. Таблица 1 показывает представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов.
Рисунок 1 : SSC/FSC профили типичных катетер шар отзыв урожая от больного легочной гипертензии (A) и такое же количество клеток от коммерчески приобретенного основного человеческого паек культуры (B). Обе образцы были очищены с анти CD146 колонка, фиксированной и permeablized как описано в протоколе, до анализ СУИМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : SSC/FSC профили типичных катетер шар подсказка урожай от легочной гипертензии пациента (A) и последовательный 1:10 разрежения Ficoll градиент очищенная человека Баффи пальто (B, C, D). (A) был очищен с столбце анти CD146, тогда как (B-D) не были. Все образцы клетки были исправлены и permeablized как описано в протоколе, до анализ СУИМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : SSC/FSC профили урожая кончик катетера шар от больного легочной гипертензии, в которой кровь была видна на кончик катетера до обработки. До шаг 3.1 протокола образец был разбит и буфера lysis был добавлен один Алиготе и удерживаются от другого. (A) и (C) Показать профили SSC/FSC лизированных образца, как клетки сохранили столбец (A) и потока через из столбца. (B) и (D) показывают SSC/FSC профили unlysed образца, как клетки сохранили столбец (B) и потока через из столбца (D). Мы заключаем, что лизис удаляет некоторые, но не все из лейкоцитов, но что лейкоциты не сохраняются в столбце и таким образом исключены из окончательного сбора урожая, независимо от lysis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Пример | Дата | Урожайность ячейки | Диагностика |
| 433 | 4/17/2018 | 7364 | PH-интерстициальная легочных заболеваний |
| 279 | 4/17/2018 | 7130 | PH-склеродермия |
| 432 | 4/13/2018 | 3976 | PH-многофакторного |
| 431 | 4/13/2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 4/13/2018 | 5666 | ПАУ |
| 423 | 3/23/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 3/23/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 2/27/2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 2/14/2018 | 10376 | PH-ASD + болезни митрального клапана |
| 396 | 1/26/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 1/26/2018 | 7672 | Нормальный гемодинамики |
| 318 | 1/4/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD настоящего |
Таблица 1: CD146 + дает от различных паек урожаи. Представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов.
Discussion
Метод, описанный в этой статье лучше всего ценится в контексте предыдущих экспериментальных парадигм для изучения легочного эндотелия. Предыдущие попытки получить PAECs от людей были ограничены описаны трупной легкие5 и недолго попытка разработать катетер, способных легочной артерии биопсии6. Как отмечается в недавно обзор7, настоящий техника отличается от легких тканей урожая по ее способности для получения PAECs от жизни человека и сделать это в нескольких точках время прогрессирования заболевания и/или терапии. Следует, однако, отметить, что метод компаньон недавно сообщалось whereby индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) может быть transdifferentiated в PAECs4,5. Этот метод производит обильные культур PAECs конкретного пациента и позволяет исследование воздействия конкретного пациента генетический фон на биологии паек. Несмотря на эти преимущества эти IPSC-производные PAECs не может предложить любую информацию о взаимодействии между местными микроокружения и генетический фон конкретного пациента. Наш собственный группа представила считает, что «Кэт наконечник» и методы IPSC, скорее всего будет синергетический в продвижении поле8.
В рамках этой настоящей и историческом контексте следует отметить ограничения этой техники. Во-первых важно отметить, что урожайность PAECs, производные от данного метода может существенно различаться. Предположительно пациент-, болезни государства - и врач специфические факторы способствуют этой изменчивости, как протокол не содержит шаги, которые будут, как ожидается, привести к крупным потерям исходного материала. Таблица 1 показывает представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов. Во-вторых клеток дает общий низкий, и их жизнеспособности культуры оказался ниже, но в наших руках. В то время как ранее мы выросли культур PAECs, используя этот метод1, мы себя эти результаты представляют собой спасение подмножество прогениторных клеток после отмирания большинства образца и периодически успешна только в наших руках. Например это не редкость найти только несколько десятков сторонник PAECs в культуре на следующее утро после покрытием урожай. Часто эти микро культуры не доживает до расширения. Чтобы оптимизировать этот протокол в манере, которая будет поддерживать жизнеспособность PAECs и их условий в культуре для достижения желаемой цели распространения конкретного пациента паек урожаи необходима дальнейшая работа. Наконец положительный выбор CD146, которую мы адаптировали нельзя исключить загрязнение с другими CD146 + клеток, таких как циркулирующих эндотелиальные клетки4, pericytes, гладких мышечных клеток и редких CD146 + T клетки9,10. Тем не менее предполагается, что эти клетки являются очень малочисленны в пробах, собранных таким образом, и CD146 является значительно более конкретным, для этого протокола чем другие ячейки маркеры эндотелиальных клеток, таких как CD31 (которая также присутствует на различных кровь клетки, включая тромбоциты11). Любых будущих улучшений, направленных на улучшение специфики должны быть сбалансированы против их потенциально негативное влияние на урожайность.
Disclosures
ДСМ и RLB являются изобретателей по патентам, утверждая части описанных методов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить врачей и вспомогательного персонала службы Advanced сердечной недостаточности и легочной гипертензии Аллеени Генеральной больницы для предоставления сотни образцов катетер в течение нескольких лет, которые способствовали оптимизации этой методологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).
- Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization. Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).
- Benza, R. L., et al. In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction. Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).
- Bull, T. M., et al. Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).
- Kaneko, F. T., et al. Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).
- Rothman, A., et al. Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model. Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).
- Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era. European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).
- Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).
- Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood. Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).
- Elshal, M. F., et al. A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile. BMC Immunolology. 8, 29 (2007).
- Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
