Summary
このプロトコル記述除去および Swan-ganz カテーテルのバルーン ヒントに準拠して、右心カテーテル検査中に肺動脈に挟まがまま肺動脈内皮細胞 (PAECs) の精製に付着、デフレートバルーン患者の体内からの除去に続きます。
Abstract
さまざまな病態は肺高血圧症 (PH), 平均肺動脈圧が安静時 25 mmHg を超えると定義されるに します。さらに診断して PH を管理、患者は繰り返し右心における (迎え) 前記 Swan-ganz カテーテル、肺動脈の枝に高度なカテーテル先端部をくさびにバルーンを膨張を受けます。この記事では、という肺動脈内皮細胞 (PAECs) を迎え後に、スワン ・ ガンツ ・ カテーテルのバルーン ヒントから収穫し、推定 PAECs を浄化する抗 CD146 親和性列法による精製がプロトコルを示しています。これらの細胞は、迎え時に得られる血行動態の測定を補完するために肺の血管内皮細胞の生物学的状態の場でのスナップショットを提供するために使用可能性があります。収穫し、いずれかの細胞培養またはフロー cytometery など後続の分析アッセイ精製 PAECs を使用可能性があります。
Introduction
現在の米国と欧州のガイドライン1肺高血圧症の診断のため右心カテーテル検査が必要です。医者および科学者のこの病気を理解しようとして迎え中に収集血行動態データを補完するために肺の血管から試料を望みます。残念ながら、肺血管生検に関連するリスクが非常に高い、したがって肺の血管系の生体試料、ほとんどこれまで迎えを受けて生きている患者から得られた場合。多くの洞察力をから得た死体から得られた肺の血管組織や explanted 肺、これらのサンプルがそれは生きた患者で繰り広げられる PH 病気プロセスの生物学を反映するようにことができます。2013 年に我々 はまず肺動脈内皮細胞 (PAECs) を迎え中、Swan-ganz カテーテルのバルーン ヒントと物理的な接触によって肺動脈の枝から全部落とすカテーテル先端から小さな数字で回復できると報告後の手順2。
この記事は、右心カテーテル検査の後 Swan-ganz カテーテルのバルーン ヒントから除去および肺動脈内皮細胞 (PAECs) の浄化のための技術を示します。これまで、この収穫方法を実行するための方法論は、文学研究室のテクニックを実行する間一貫した結果を確保するために十分な詳細に記載されています。この資料では、浄化された CD146 + 内皮細胞の最終製品にカテーテル先端のベッドサイドのコレクションから、技術の可視化のデモを提供している、この欠乏を克服するために。この技術必要があります ph, 様々 な病因の病理学に研究を進める上での援助、迎え時に収集した血行動態データを補完するために新しい診断法の開発に至る。
肺血管医学研究の分野にこのテクニックの重要性はそれが explanted または死体肺の肺血管内皮細胞の in situ と以前の研究と対照をなしての生物学のスナップショットへのアクセスを提供しますを表さない被写体の肺のエンドポイントです。最近では、我々 はこれらの細胞におけるアポトーシス マーカーより正確に表現型解析の有用性があることを示されている関連肺高血圧症の3品種。得られた細胞の収量は比較的小さく、~ 5, 000 25,000 1 サンプルあたりの PAECs とこれらの細胞が困難 (不可能ではない) の文化に。巧妙な臨床医および研究者が肺血管研究、診断、故障予測を進めるためにこれらの仲間の技術間のシナジー効果を見つけることと考えています。
Protocol
この資料に記載されているすべての研究は、アレゲニー健康ネットワークの制度検討委員会によって承認されました。すべての患者は鎮静剤投与前にインフォームド コンセントを提供し、試験番号を割り当てられることによって識別された解除。
1. ベッドサイド コレクション
注:このプロトコルのすべては、事前冷却ソリューションを使用して氷の上行ってください。寒いのうっ滞の場での生物学的表現型を維持するために細胞を誘導することが重要です。このプロトコルは、血と人間から得られる細胞の処理を含み、したがって普遍的な注意事項を守らなければなりません。
- カテーテル シースからの撤退後、すぐに冷蔵滅菌生理食塩水 40 mL を含む 50 mL の遠心管にカテーテルを浸します。血、血ライン内で保持を削除する必要がある場合にラインをフラッシュしカテーテルの数回を旋回します。
- カテーテル先端の遠位 5 cm 切って、冷たい生理食塩水を含む 50 mL の遠心管に落ちることができます。すぐに鉗子でカテーテル先端を削除し、内皮細胞 (EC) 成長培地 15 mL を含む 15 mL 遠心管にそれを転送します。
- チューブをシール、氷の場所、準備処理や配送のために研究室に転送。バルーン滞在中に浸漬が重要です、ので、EC 培地で完全に塗りつぶすことにより 15 mL チューブに最小限のヘッド スペースがあることを確認します。
- プロセス ステップ 2.1 シールや船所このプロトコルで熟練した処理のために夜通し濡れた氷のサンプルに進み、すぐにサンプル。細胞は最終的に細胞培養に使用しようとしている場合、カテーテル先端が収集する同じサイトですぐに処理されることを強く推奨しています。
2. 細胞収穫
注:このプロトコルのすべては、事前冷却ソリューションを使用して氷の上行ってください。細胞は寒い、うっ滞で、固定または培養する準備ができるまで、それらを覚醒を避けるために重要です。このプロトコルの全体は、層流フードは、究極の目的が収穫された PAECs のカルチャの場合、滅菌器具を使用して行わなければなりません。文化が計画されていない場合 (例えば、フローサイトメトリー解析の流れ)、滅菌対策を観察する必要はありません。
- 細胞剥離溶液 5 mL を 15 mL 遠心管; に追加します。氷の上を配置します。
- その 1 mL 注射器にベッドサイドのコレクションの管に残っているから EC メディアの 1 つの mL を描画します。
- 手順 2.3 2.5 からに迅速に完了します。グリップ止血剤でカテーテル先端の切り口。
- 慎重にガイド線 (「ブラック ホール」) 反対「白」穴に 1 mL の注射器針を挿入します。針で損傷を避けるために大きい心配を取る。
- 細胞剥離溶液 15 mL 遠心管にカテーテル先端を転送します。
- それをバーストしないように注意しながら、バルーンを膨らませるうまくメディアの約 200 μ L でバルーンを膨らませます。
- 膨らませたバルーンを 5 分間氷の上細胞剥離液に座ってカテーテルを許可します。バルーンを 5 分孵化の間に独自に縮小する場合、これは許容されます。
- 100 mm ディッシュに 15 mL 遠心管の中身を注ぐ。細胞剥離液「水たまり」バルーンを配置します。
- 細胞スクレーパーで膨らんだバルーンをこすり。細胞スクレーパーは、円形の動きまたはブラッシング運動でバルーン周り描画できます。それがカテーテルを満たしている、風船の「極」に焦点を当てます。細胞スクレーパーが風船の表面全体を少なくとも 2 回連絡先を確認します。細胞剥離液「水たまり」で細胞スクレーパーを定期的にすすいでください。
- バルーンを収縮し、ブラッシング運動で落とします。細胞剥離液「水たまり」で細胞スクレーパーをすすいでください。
- 適切な廃棄容器でカテーテル先端、針および細胞スクレーパーを破棄します。
- 50 mL の遠心管にセル収穫を含む細胞剥離溶液を注ぐ。コレクションの管を振る、採取試料を同様にコレクションの管から残りのメディアを注ぐ。
- 650 × g 10 分のための 4 ° c でサンプルを遠心します。多くの場合、ペレットが見えないように注意してくださいすることが重要です。それは見られることをそれが小さすぎる場合は、ペレットを吸引を避けるために、表示されている場合、ペレットが見られる場所をマークすることができます。
注:通常、ペレットは、サンプルが血液で汚染されている場合にのみ表示します。血 CD146 ビーズをバインドに失敗して列を洗うため血液汚染は究極の収穫製品材料です。広範なテストは、1.5 mL 遠心チューブ材料のテーブルで参照されている特定のブランドがプロトコル最適化時に利用されるその他の管を基準にしてセル損失を最小化を実証しています。 - 慎重にメディアを吸引、不安やペレットの吸引を避けます。
3. 細胞精製
注:このプロトコルのすべては、事前冷却ソリューションを使用して氷の上行ってください。細胞は寒い、うっ滞で、固定または培養する準備ができるまで、それらを覚醒を避けるために重要です。
- チルド赤血球溶解液の 1 mL にペレットを再懸濁します、1.5 mL および microfuge の管; に転送4 ° C で 10 分間やさしくロック
- 500 x gと 4 ° C で 5 分間遠心赤血球溶解ソリューションを吸い出しなさい。
- 60 μ L の PBS、FcR のブロッカーの 20 μ L、抗ひと CD146 マイクロ ビーズの 20 μ L でペレットを再懸濁します。4 ° C で 15 分間インキュベートします。
- 冷やした PBS の 1 mL を追加します。500 x gと 4 ° C で 5 分間遠心上清を吸引し、1 mL の冷やした PBS でペレットを再懸濁します。
- 磁気ラックに磁気 LS 列を置き (これらの項目の特定の商業アイデンティティの材料表を参照してください) 室温で。1 mL の PBS を追加して列をプライムし、流れるにボリューム全体を許可します。流れを破棄します。
- 磁気の列にサンプルを配置します。流れを破棄します。
- 冷やした PBS の ml の 3 列を 3 回洗浄します。各洗浄から流水を破棄します。
- 冷やした PBS の 3 mL を 15 mL 遠心管に追加します。磁石から磁気の列を削除、列に 15 mL 遠心管から 3 mL の PBS を注ぐし、すぐに流れをキャッチする遠心管中列を配置します。すぐに列に付属しているプランジャーで突入します。サンプルは、今精製の準備ができて固定/汚すか、または文化。
Representative Results
このプロトコルは CD146 選択列にバインドし、培養の主要な人間の肺と区別できない前方・側方散乱プロファイルを持っている右心カテーテル検査後 Swan-ganz カテーテル先端からの細胞の浄化の結果します。動脈内皮細胞 (図 1)。考えるとカテーテルのバルーンは、物理的な接触のみのイントロデューサー シース (携帯無料素材)、肺動脈の血管壁と血液データにこれらの細胞は、血液 (図 2) から派生していないことを示す記載、従ってそれは、彼らは確かに肺動脈の血管壁から派生すると見なされます。リーダー、細胞を浄化するために使用される抗 CD146 磁気ビーズが残ることに注意してください手順、およびこうしてそれの後の細胞表面に付着は内皮細胞のマーカーとしての CD146 の細胞収穫を分析しようとする次善のです。CD31 や他の血管内皮マーカー ラベルに使用できるだろうし、の選択肢として考えられます。
このプロトコルの主な要素が識別されている結果に影響する可能性があります。まず、血液を除去するためにベッドサイドでカテーテル先端部を洗浄することが重要です。図 3側方散乱 (SSC) を示しています/フロースルー反 CD146 列からの前方散乱 (FSC) プロファイルのサンプル 1 つ正しく洗浄し、1 つはなかった。(図 2)、収穫から血液細胞を除外する列が表示されますが、洗浄のステップは内皮細胞から可能な汚染を最小限を確保 (通常存在である < 50 セル/mL の血液4)。我々 は、CD146 の列が完全に明確、非常に血カテーテル先端のサンプルの場合、溶出を観察しました。これは列が目詰まりまたは非保持せずに大量の血液を処理することができることを示唆している-CD146 + 媒介細胞。
第二に、細胞剥離ソリューション/細胞スクレーパー ステップ中に少なくとも一度バルーン ヒントを膨らませることが重要です。バルーン ヒントに推定 PAECs まま付着性にもかかわらず生理食塩水リンス ステップ、それと思われることを考える彼ら可能性があります部分的に閉じ込められるビニール風船の折目によってそれは患者からの除去のための準備に自信をなくすよう。おそらく、インフレのステップは優しく掻きするように、PAECs を解放します。1 つはこの仮説をテストがありますが、セルの利回りが低いがバルーン膨張 (データ表示されません) では観察されている明確ではありません。
最後に、このメソッドから派生した PAECs の利回りがかなり変わることに注意してくださいすることが重要です。おそらく、患者 - 病状態と医師固有の要因に貢献この変動プロトコルにソースの材料の主要な損失が期待される手順が含まれていません。表 1に示す代表 CD146 + さまざまなさまざまな異なる肺高血圧症の病態の患者から得られたカテーテル先端を利用した PAEC 収穫からさまざまな医師演算子が得られます。
図 1: 文化の肺高血圧症患者 (A) と同じような商業的に獲得した主要な人間 PAEC から細胞数から典型的なカテーテルのバルーン ヒント収穫の SSC/FSC プロファイル (B) です。両方のサンプルが反 CD146 列と精製、修正、および FACS 解析の前に、プロトコルで説明されているように permeablized。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 典型的なカテーテルのバルーンの SSC/FSC プロファイル ヒント収穫肺高血圧症から患者 (A) とシリアル 1:10 Ficoll グラデーション精製人間バフィー コート (B, C, D) の希釈します。一方、抗 CD146 列によって精製したは (A) (B D) ではなかった。セルのすべてのサンプルは固定され、FACS 解析の前に、プロトコルで説明されているように permeablized。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 血で肺高血圧症患者からカテーテルのバルーン ヒント収穫の SSC/FSC プロファイルは処理の前にカテーテル先端上に表示されました。ステップ 3.1 プロトコルの前にサンプルが分割されたとの換散バッファー 1 つの因数を添加し、他から天引き。(A) と (C) (A) の列、列の通過によって保持される両方細胞分離のサンプルの SSC/FSC プロファイルを表示します。(B) と (D) と列 (B)、(D) の列から通過によって保持される両方セル unlysed サンプルの SSC/FSC プロファイルを表示します。結論付ける換散をいくつか削除しますが、ないすべての白血球が、白血球は列では維持されません、したがって溶解に関係なく、最後の収穫から除外されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| サンプル | 日付 | 細胞収率 | 診断 |
| 433 | 2018/04/17 | 7364 | PH 間質性肺疾患 |
| 279 | 2018/04/17 | 7130 | PH 強皮症 |
| 432 | 2018/04/13 | 3976 | PH 多因子 |
| 431 | 2018/04/13 | 3634 | 原因の寄与について |
| 390 | 2018/04/13 | 5666 | ウン パッパ |
| 423 | 2018/03/23 | 9024 | 原因の寄与について |
| 272 | 2018/03/23 | 7098 | 原因の寄与について |
| 408 | 2018/02/27 | 4784 | 原因の寄与について |
| 403 | 2018/02/14 | 10376 | PH ASD + 僧帽弁膜症 |
| 396 | 2018/01/26 | 4890 | HFpEF IPCPH |
| 397 | 2018/01/26 | 7672 | 通常の血行動態 |
| 318 | 2018/01/04 | 7002 | 原因の寄与について LVAD 存在 |
表 1: CD146 + PAEC 収穫の品種から得られます。代表 CD146 + さまざまなさまざまな異なる肺高血圧症の病態の患者から得られたカテーテル先端を利用した PAEC 収穫からさまざまな医師の演算子を生成します。
Discussion
この資料で説明する手法は、肺の血管内皮細胞を研究するため実験的パラダイムを以前のコンテキストで最高感謝です。人間から PAECs を取得する以前の試みは短命カテーテル肺動脈生検6の能力を開発しようと仔/死体肺5に限られています。最近レビュー7で説明したように、本手法は肺組織の収穫から人間生活から PAECs を取得し、病気や治療の進行の複数の時点でそう能力によって区別されます。ただし、そのコンパニオン技術最近報告されている誘導という多能性幹細胞 (Ips) は、PAECs4,5に transdifferentiated をすることができます。この手法患者固有の PAECs の豊富な文化ほか、PAEC 生物に及ぼす患者固有の遺伝的背景の研究をできます。これらの利点にもかかわらず、これらの IPSC 由来の PAECs はローカル微小環境と患者固有の遺伝的背景との間の相互作用についての情報を提供できません。当社グループは、「カテーテル先端」と IPSC テクニック フィールド8を進める上での相乗効果があるビューを発表しています。
この現状と歴史のコンテキスト内でこの技術の制限を注意してください。まず、このメソッドから派生した PAECs の利回りがかなり変わることに注意してくださいすることが重要です。おそらく、患者 - 病状態と医師固有の要因に貢献この変動プロトコルにソースの材料の主要な損失が期待される手順が含まれていません。表 1に示す代表 CD146 + さまざまなさまざまな異なる肺高血圧症の病態の患者から得られたカテーテル先端を利用した PAEC 収穫からさまざまな医師演算子が得られます。第二に、セル利回りが全面的に低いと文化の彼らの生存率が低くまだ我々 の手で証明されています。一方、我々 は以前、この方法1を使用して PAECs の文化を成長している、次のサンプルのほとんどのダイオフ前駆細胞のサブセットのそれらの結果を表す救助を想定し、断続的に我々 の手で成功しただけ。たとえば、めっきされた収穫後の朝文化の数十の付着のみ PAECs を検索することは珍しくありません。多くの場合これらのマイクロ文化は拡大に保持されません。さらに作業は、PAECs の生存を維持する方法でこのプロトコルと患者固有 PAEC 収穫の伝播の目的目標を達成するために文化の彼らの条件を最適化するために必要です。最後に、我々 が適応している CD146 の肯定的な選択は循環内皮細胞4血管、平滑筋細胞と珍しい CD146 + T 細胞9,10など、他の CD146 + 細胞の混入を除外できません。それにもかかわらず、これらの細胞は、この方法で収集されたサンプルの数は非常に少ないと推定される、CD146 はかなり (これは血液媒介性の様々 な存在も CD31 などの内皮細胞の他の細胞のマーカーよりもこのプロトコルの特定血小板11を含むセル) です。特異性の改善に向けた今後の改善は、収量への潜在的に否定的な影響に対するバランスする必要があります。
Disclosures
MJP と RLB が説明する方法の部分を主張している特許の発明者です。
Acknowledgments
著者は医師に感謝し、カテーテル サンプルの何百もを容易にした数年間を提供するためのアレゲニー総合病院の高度な心不全や肺高血圧症のサービス スタッフをサポートしたい、この手法の最適化。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
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