Summary
Det här protokollet beskriver borttransport och rening av lungartären endotelceller (PAECs) som följer ballong tips av Swan-Ganz katetrar medan de är inklämd i lungartären under höger hjärtkateterisering och förbli vidhäftat till den deflaterat ballong efter borttagning från patientens kropp.
Abstract
En mängd olika patologier leda till pulmonell hypertension (PH), som definieras som en genomsnittlig lungartärtryck överstiger 25 mmHg vid vila. För att ytterligare diagnostisera och hantera PH, genomgå patienter upprepade rätt hjärta catheterizations (RHC) vari en Swan-Ganz kateter är avancerade in en gren av lungartären och en ballongen är fylld för att kila kateterspetsen. Denna artikel visar ett protokoll där lungpulsådern endotelceller (PAECs) kan skördas från ballong tips av Swan-Ganz katetrar efter RHC, och renas med en anti-CD146 affinitet kolumn teknik att rena förmodade PAECs. Dessa celler kan användas för att ge en jordbaserad ögonblicksbild av biologiska tillståndet för pulmonell kärlsystemet endotelet att komplettera hemodynamiska mätningar erhållits under RHC. Skördas och renade PAECs kan användas för antingen cellkultur eller för efterföljande analytisk analyser såsom flöde cytometery.
Introduction
Aktuella amerikanska och Europeiska riktlinjer kräver rätt hjärtkateterisering för diagnostik av pulmonell hypertension1. Läkare och forskare försöka förstå denna sjukdom lust biologiska prover från den pulmonell kärlsystemet att komplettera de hemodynamiska data som samlas in under RHC. Tyvärr, riskerna med pulmonell vaskulär biopsi är mycket hög, och därför biologiska prover för att pulmonell kärlsystemet är sällan om någonsin erhållits från levande patienter som genomgår RHC. Medan mycket insikt har vunnits från pulmonell kärlvävnad från avlidna eller explanterad lungorna, dessa prover är inte kan reflektera biologi PH sjukdomsprocessen som det utspelas i en levande patient. Under 2013 rapporterade vi först att lungpulsådern endotelceller (PAECs) är utblottad från grenar av lungartären genom fysisk kontakt med ballong spets den Swan-Ganz katetern under RHC och kan återvinnas i litet numrerar från katetern tips efter den procedur2.
Denna artikel illustrerar vår teknik för borttransport och rening av lungartären endotelceller (PAECs) från ballong tips av Swan-Ganz katetrar efter höger hjärtkateterisering. Hittills, har metoden för att utföra denna skörd teknik beskrivits tillräckligt ingående i litteraturen att säkerställa enhetliga resultat mellan laboratorier som utför tekniken. Denna artikel syftar till att övervinna denna brist, erbjuder visualiserade demonstration av tekniken, från sängkanten samling av katetern tips till den slutliga produkten av renat CD146 + endotelceller. Denna teknik bör stöd främja forskning i patobiologi av olika etiologier av PH och möjligen resultera i utveckling av nya diagnostiska analyser att komplettera hemodynamiska data som samlats in under RHC.
Vikten av denna teknik till fältet för pulmonell vaskulär medicin och forskning är att det ger tillgång till en ögonblicksbild av biologin av pulmonell endotelet i situ och i motsats till tidigare studier på explanterad eller avlidna lungorna, representerar inte en slutpunkt för försökspersonens lung. Nyligen har vi visat att ett anti-apoptotiska biomarkör i dessa celler kan ha användbarhet i mer exakt fenotypning med sorter av pulmonell hypertension3. Utbytet av celler som erhållits är relativt små, ~ 5, 000-25 000 PAECs per prov, och dessa celler är svårt (men inte omöjligt) att kultur. Vi tror att smarta kliniker och forskare hittar synergier mellan dessa följeslagare tekniker för att avancera pulmonell vaskulär forskning, diagnostik och prognostisering.
Protocol
Alla studier som beskrivs i denna artikel godkändes av den institutionella Review Board av Allegheny hälsa nätverket. Alla patienter gett informerat samtycke innan behandling med lugnande medel och var avidentifieras genom tilldelas en studienummer.
1. sängkanten samling
Obs: Allt i detta protokoll skall göras på is, använda pre kylda lösningar. Det är viktigt att framkalla kalla Stas i cellerna för att bevara deras jordbaserad biologiskt fenotypen. Detta protokoll innefattar hantering av blod och celler från människor och därför allmänna försiktighetsåtgärder bör iakttas.
- Efter tillbakadragandet av katetern från skidan, omedelbart fördjupa katetern i ett 50 mL centrifugrör som innehåller 40 mL kylt steril koksaltlösning. Snurra runt katetern flera gånger ta bort blod och spola linjen om nödvändigt att avlägsna blod kvar inom linjen.
- Skära av den distala 5 cm av cath spetsen och låt den falla i de 50 mL centrifugrör som innehåller kyld saltlösning. Omedelbart ta bort cath spetsen med pincett och överföra den till en 15 mL centrifugrör innehållande 15 mL odlingsmedium endotelceller (EG).
- Förslut röret, placera den på is och överföra till labbet för att förbereda för bearbetning eller frakt. Det är viktigt att ballongen förblir nedsänkt i medium, så se till att det finns minimal headspace i 15 mL röret genom att fylla den helt med EG odlingsmedium.
- Processen provet omedelbart genom att gå vidare till steg 2.1 eller sigill och fartyget provet på våt is över natten för bearbetning vid ett laboratorium som är skicklig i detta protokoll. Om celler i slutändan kommer att användas för cellodling, är det rekommenderar att cath spetsen behandlas omedelbart på samma plats som insamlats.
2. cellen skörd
Obs: Allt i detta protokoll skall göras på is, använda pre kylda lösningar. Cellerna är i kalla stasis, och det är viktigt att undvika uppvaknande dem tills de är redo att fasta eller odlade. Hela protokollet bör utföras i en LAF, med hjälp av sterila instrument, om den ultimata avsikten är kultur av de skördade PAECs. Om kultur inte är planerad (t.ex. flöde flödescytometri analys), det är inte nödvändigt att vidta sterila försiktighetsåtgärder.
- Tillsätt 5 mL av cell avlossning lösning till en 15 mL centrifugrör; Placera på is.
- Dra 1 mL EG media från det återstående i sängkanten samling röret in i 1 mL-sprutan.
- Snabbt slutföra steg 2.3 genom 2,5. Grepp skär slutet av kateterspetsen med Peanger.
- Försiktigt in nålen på 1 mL sprutan i ”vita” hålet mittemot ledaren (”svart hål”). Ta stor omsorg för att undvika skada med nålen.
- Överföra cath spetsen i de 15 mL centrifugrör som innehåller cell avlossning lösningen.
- Blåsa upp ballongen, vara noga med att inte brista det; blåsa upp ballongen med cirka 200 µL av media fungerar bra.
- Låt katetern sitta i cellen avlossning lösning på is för 5 min med ballongen uppblåst. Om ballongen töms på egen hand under 5 min ruvning, är detta godtagbart.
- Häll innehållet i de 15 mL centrifugröret i 100 mm skålen. Placera ballongen i cell avlossning lösningen ”pöl”.
- Skrapa uppblåsta ballongen med en cell skrapa. Cell skrapan kan dras runt ballongen i en cirkulär rörelse eller en borstning rörelse. Fokusera på ”polackerna” av ballongen, där den möter katetern. Kontrollera att cellen skrapan kontakterna hela ytan av ballongen minst två gånger. Skölj cellen skrapan i cell avlossning lösningen ”pöl” regelbundet.
- Tömma ballongen och skrapa den med en borsta rörelse. Skölj cellen skrapan i cell avlossning lösningen ”pöl”.
- Kassera cath tip, nål och cell skrapan i den lämpliga avfallsbehållaren.
- Häll cell avlossning lösningen innehållande cell skörden i en 50 mL centrifugrör. Skaka tuben samling och häll insamlade provet samt återstående media från samling röret.
- Centrifugera provet vid 650 x g vid 4 ° C i 10 min. Det är viktigt att notera att ofta en pellet inte syns. Det kan vara bra att markera den plats där en pellet skulle ses, om det är synligt, att undvika aspirera pelleten i händelse av att det är för liten för att synas.
Obs: En pellet ses normalt endast när provet har förorenats av blod. Blod kontaminering är utan betydelse för produktens ultimata skörd eftersom blod misslyckas att binda CD146 pärlor och tvättar genom kolonnen. Omfattande tester har visat att det specifikt märket av 1,5 mL mikrocentrifugrör refereras i Tabellen av material minimerar cellförlust i förhållande till övriga rör utnyttjas under protokollet optimering. - Försiktigt aspirera media och undvika störande eller aspirera pelleten.
3. cell rening
Obs: Allt i detta protokoll skall göras på is, använda pre kylda lösningar. Cellerna är i kalla stasis, och det är viktigt att undvika uppvaknande dem tills de är redo att fasta eller odlade.
- Återsuspendera pelleten i 1 mL kylt röd blod cell lysis lösning, och överföra det till ett 1,5 mL mikrofugrör; försiktigt rock under 10 minuter vid 4 ° C.
- Centrifugera under 5 minuter vid 500 x g - och 4 ° C. Aspirera RBC lysis lösningen.
- Återsuspendera pelleten i 60 μl av PBS, 20 μL av FcR blocker och 20 μL av anti-humant CD146 mikrokulor. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 1 mL kylt PBS. Centrifugera under 5 minuter vid 500 x g - och 4 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL av kylda PBS.
- Placera en magnetisk LS kolumn på en magnetisk rack (se Tabell av material för specifika kommersiella identiteter av dessa objekt) vid rumstemperatur. Prime kolumn genom att tillsätta 1 mL PBS och tillåta hela volymen att flöda genom. Kassera genomflöde.
- Placera provet i kolumnen magnetiska. Kassera genomflöde.
- Tvätta kolonnen med 3 mL kylt PBS tre gånger. Kassera genomströmmande från varje tvätt.
- Tillsätt 3 mL kylt PBS till en 15 mL centrifugrör. Ta bort kolumnen magnetiska från magnet, häll den 3 mL PBS från de 15 mL centrifugröret i kolumnen och snabbt placera kolumnen i centrifugröret att fånga genomflöde. Omedelbart djupdykning med kolven levereras med kolumn. Provet är nu renat, redo för fixering/färgning eller kultur.
Representative Results
Detta protokoll resulterar i rening av celler, från Swan-Ganz kateter tips efter höger hjärtkateterisering, som binder till en CD146 val av kolumn och framåt/side scatter profiler som är omöjlig att skilja från odlade primära mänskliga pulmonell artär endotelceller (figur 1). Med tanke på att katetern ballongen är i fysisk kontakt med endast införingshylsa (ett cell-fritt material), pulmonella arteriella kärlväggen, och blodet, data tillhandahålls häri för att påvisa att dessa celler inte härrör från blodet (figur 2) , och därför antas det att de faktiskt härrör från pulmonella arteriella kärlväggen. Läsaren bör Observera att anti-CD146 magnetiska pärlor som används för att rena cellerna förblir anhängare till cellytan efter förfarandet, och thus det är suboptimalt att försöka analysera cell skördar för CD146 som en markör för endotelceller. CD31 eller andra endothelial markörer skulle förmodligen vara tillgänglig för märkning och skulle kunna övervägas som alternativ.
Viktiga delar i detta protokoll har identifierats som kan påverka resultaten. Först, är det viktigt att skölja kateterspetsen på sängkanten för att avlägsna blod. Figur 3 visar Side scatter (SSC) / framåt scatter (FSC) profiler av genomströmmande från kolumnen anti-CD146 för ett provexemplar som var ordentligt sköljda och en som inte var. Kolumnen visas att utesluta blod-derived celler från skördar (figur 2), men de skölja steget säkerställer minimal eventuell förorening från cirkulerande endotelceller (som förekommer normalt i < 50 celler/mL blod4). Vi har observerat att eluatet från den CD146 kolumnen är helt klart, även när det gäller mycket blodiga katetern tip prover. Detta tyder på att kolumnen ska kunna hantera betydande mängder blod utan igensättning eller behålla icke-CD146 + bloodborne-celler.
Andra, det är viktigt att blåsa upp ballongen spets minst en gång under cell avlossning lösning deponicell skrapan steg. Med tanke på att de förmodade PAECs ballong spets förbli vidhäftat trots den saltlösning skölj steg, det verkar troligt kan de vara delvis instängd av veck i vinyl ballongen som det är deflaterad förberedelse för borttagning från patienten. Förmodligen frigör det inflationen steget de PAECs, att låta dem vara försiktigt skrapas bort. Det är inte omedelbart klart man kan testa denna hypotes, men lägre avkastning av celler har observerats när ballongen är inte uppblåst (inga data anges).
Slutligen är det viktigt att notera att avkastning av PAECs härrör från denna metod kan variera avsevärt. Förmodligen, patient-, sjukdom stat - och läkare-specifika faktorer bidra till denna variation, eftersom protokollet inte innehåller steg som skulle förväntas leda till betydande förlust av källmaterial. Tabell 1 visar representant CD146 + avkastning från en mängd PAEC skördar utnyttja katetern tips från en mängd patienter med olika sjukdomstillstånd av pulmonell hypertension och en mängd läkare operatörer.
Figur 1 : SSC/FSC profiler av en typisk katetern ballong spets skörd från en pulmonell hypertension patient (A) och ett liknande antal celler från ett kommersiellt förvärvade primära mänskliga PAEC kultur (B). Båda proverna var renas med kolumnen anti-CD146, fast, och permeablized som beskrivs i protokollet, före FACS analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : SSC/FSC profiler av en typisk kateterns ballong spets skörd från en pulmonell hypertension patienten (A) och seriell 1:10 utspädning av Ficoll gradient-renat mänskliga buffy coat (B, C, D). (A) renades med anti-CD146 kolumnen medan (B-D) var inte. Alla cellprover var fast och permeablized som beskrivs i protokollet, före FACS analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : SSC/FSC profiler av en kateter ballong spets skörd från en pulmonell hypertension patient där blodet var synliga på kateterspetsen före bearbetning. Innan steg 3.1 i protokollet, provet delades och lyseringsbuffert lades till en alikvot och undanhållit från den andra. (A) och (C) Visa SSC/FSC profilerna lyserat provets båda cellerna behålls av kolumn (A) och genomströmmande från kolumnen. (B) och (D) Visa SSC/FSC profiler av unlysed provet, båda cellerna behålls av kolumnen (B) och genomströmmande från kolumnen (D). Vi konstatera att lysis tar bort en del men inte alla cellväggar men att leukocyter behålls inte av kolumnen och är därmed undantagna från den sista skörden, oavsett lysis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Datum | Cell avkastning | Diagnos |
| 433 | 4/17/2018 | 7364 | PH-interstitiell lungsjukdom |
| 279 | 4/17/2018 | 7130 | PH-sklerodermi |
| 432 | 4/13/2018 | 3976 | PH-multifaktoriell |
| 431 | 4/13/2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 4/13/2018 | 5666 | PAH |
| 423 | 3/23/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 3/23/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 2/27/2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 2/14/2018 | 10376 | PH-ASD + mitral sjukdom |
| 396 | 1/26/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 1/26/2018 | 7672 | Normal hemodynamik |
| 318 | 1/4/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD närvarande |
Tabell 1: CD146 + avkastning från en mängd PAEC skördar. Representativ CD146 + avkastning från en mängd PAEC skördar utnyttja katetern tips från en mängd patienter med olika sjukdomstillstånd av pulmonell hypertension och en mängd läkare operatörer.
Discussion
Tekniken som beskrivs i denna artikel är bäst uppskattas i samband med tidigare experimentella paradigm för att studera den pulmonella vaskulära endotelet. Tidigare försök att få PAECs från människor begränsats till explanterad/avlidna lungorna5 och ett kortvarigt försök att utveckla en kateter som är kapabel av lungartären biopsi6. Som påpekas i en senaste granskning7, är den nuvarande tekniken distingerad från lunga vävnad skörd genom dess förmåga att få PAECs från en levande människa, och att göra det vid flera tidpunkter i förloppet av sjukdomen eller behandlingen. Det bör dock noteras att en kamrat teknik har nyligen rapporterats whereby inducerade pluripotenta stamceller (IPSCs) kan vara transdifferentiated i PAECs4,5. Denna teknik ger riklig kulturer av patient-specifika PAECs och tillåter studier av effekterna av patient-specifika genetiska bakgrunden på PAEC biologi. Trots dessa fördelar, kan inte dessa IPSC-derived PAECs erbjuda någon information om samspelet mellan lokala närmiljön och patientspecifika genetisk bakgrund. Vår egen grupp har lagt fram anser att de ”cath spets” och IPSC tekniker är sannolikt att vara synergistisk framåt i fält8.
Begränsningarna i denna teknik bör noteras i detta nuvarande och historiska sammanhang. Först, är det viktigt att notera att avkastning av PAECs härrör från denna metod kan variera avsevärt. Förmodligen, patient-, sjukdom stat - och läkare-specifika faktorer bidra till denna variation, eftersom protokollet inte innehåller steg som skulle förväntas leda till betydande förlust av källmaterial. Tabell 1 visar representant CD146 + avkastning från en mängd PAEC skördar utnyttja katetern tips från en mängd patienter med olika sjukdomstillstånd av pulmonell hypertension och en mängd läkare operatörer. Andra, cell avkastningen är allmänt låg, och deras livskraft för kultur har visat sig vara lägre än i våra händer. Medan vi har tidigare vuxit kulturer av PAECs som använder denna metod1, vi tar dessa resultat representerar räddning av en delmängd av stamceller efter die-off av mest av provet och lyckas bara periodvis i våra händer. Det är till exempel inte ovanligt att hitta bara ett par dussin anhängare PAECs i kultur morgonen efter en skörd har varit klädd. Ofta överlever inte dessa mikro-kulturer till expansion. Det krävs ytterligare arbete för att optimera detta protokoll på ett sätt som kommer att upprätthålla lönsamheten för PAECs och deras villkor i kultur att nå det önskade målet av förökningen av patientspecifika PAEC skördar. Slutligen utesluta CD146 positiva val har vi anpassat inte kontamination med andra CD146 + celler, såsom cirkulerande endotelceller4, pericyter, glatta muskelceller och sällsynta CD146 + T celler9,10. Ändå, dessa celler antas vara mycket få till antalet i prov som samlats på detta sätt, och CD146 är betydligt mer specifik för detta protokoll än andra cell markörer av endothelial celler såsom CD31 (som är också närvarande på en mängd blodburna celler inklusive blodplättar11). Eventuella framtida förbättringar som syftar till att förbättra specificitet bör vägas mot deras potentiellt negativa inverkan på avkastningen.
Disclosures
MJP och RLB är uppfinnare på patent hävdar delar av metoderna.
Acknowledgments
Författarna vill tacka läkarna och stödpersonal i tjänsten avancerad hjärtsvikt och Pulmonell Hypertension av Allegheny General Hospital för tillhandahållande av hundratals katetern prover under flera år som har underlättat den optimering av denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).
- Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization. Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).
- Benza, R. L., et al. In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction. Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).
- Bull, T. M., et al. Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).
- Kaneko, F. T., et al. Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).
- Rothman, A., et al. Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model. Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).
- Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era. European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).
- Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).
- Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood. Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).
- Elshal, M. F., et al. A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile. BMC Immunolology. 8, 29 (2007).
- Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
