Summary
Denne protokollen beskriver fjerning og rensing av lungearterien endotelceller (PAECs) som følger tipsballonger av Swan-Ganz katetre mens de er klemt fast i lungearterien under høyre hjerte catheterization og forbli tilhenger til den deflatert ballong etter fjerning fra pasientens kropp.
Abstract
En rekke patologi føre til pulmonal hypertensjon (PH), som er definert som mener lungearterien presset overstiger 25 mmHg på resten. Videre diagnostisere og behandle PH, gjennomgår pasienter gjentatte høyre hjertet catheterizations (RHC) der en svane-Ganz kateter er rykket inn i en gren av lungearterien og en ballongen er oppblåst for å kile kateter spissen. Denne artikkelen beskriver en protokoll der lungearterien endotelceller (PAECs) kan være høstet fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter RHC og renset med en anti-CD146 affinitet kolonnen teknikk å rense antatte PAECs. Disse cellene kan brukes til å gi en i situ øyeblikksbilde av biologiske lunge blodkar endotelet å utfylle hemodynamic mål oppnås under RHC. Høstes og renset PAECs kan brukes for enten cellekultur eller etterfølgende analytisk analyser som flyt cytometery.
Introduction
Gjeldende amerikanske og europeiske retningslinjer krever riktig hjerte catheterization for diagnostisering av pulmonal hypertensjon1. Leger og forskere søker å forstå denne sykdommen ønsker biologiske prøver fra er lunge blodkar å utfylle hemodynamic dataene som er samlet under RHC. Dessverre risikoen forbundet med lunge vaskulær biopsi er svært høy, og derfor biologiske prøver av lunge blodkar er sjelden hvis noen gang fått fra levende pasienter som gjennomgår RHC. Mens mye innsikt har fått fra lunge vaskulær vev hentes fra cadaveric eller explanted lungene, disse prøvene er ikke reflektere biologi PH sykdommen prosessen som den utfolder seg i en levende pasient. I 2013 rapportert vi først at lungearterien endotelceller (PAECs) er blottet fra greinene av lungearterien fysisk kontakt med tipsboblen av Swan-Ganz kateter under RHC og kan gjenopprettes i små tall fra kateter tips etter prosedyren2.
Denne artikkelen illustrerer vår teknikk for fjerning og rensing av lungearterien endotelceller (PAECs) fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter høyre hjerte catheterization. Hittil, har metodikk for å utføre denne harvest teknikken blitt beskrevet i tilstrekkelig detalj i litteraturen å sikre ensartet resultater mellom laboratorier utføre teknikken. Denne artikkelen er ment å overvinne denne mangel, tilbyr visualisert demonstrasjon av teknikken, fra sengen samling av kateter tips til det endelige produktet av renset CD146 + endotelceller. Denne teknikken bør hjelpe fremme forskning i pathobiology av ulike etiologies av PH, og muligens resultere i utviklingen av nye diagnostiske analyser å utfylle hemodynamic data samlet under RHC.
Betydningen av denne teknikken til lunge vaskulær medisin og forskning er at det gir tilgang til et øyeblikksbilde av biologi lunge endotelet i situ og i motsetning til tidligere studier på explanted eller cadaveric lungene, representerer ikke et sluttpunkt for emnet lunge. Nylig vi har vist at en anti-apoptotisk biomarkør i disse cellene kan ha nytte i mer presist phenotyping relaterte varianter av pulmonal hypertensjon3. Avkastningen av celler innhentet er relativt liten, ~ 5, 000-25,000 PAECs per prøve, og disse cellene er vanskelig (men ikke umulig) å kultur. Vi mener at smarte leger og forskere vil finne synergier mellom disse følgesvenn teknikker for å fremme lunge vaskulær forskning, diagnostikk og prognostics.
Protocol
Alle studiene beskrevet i denne artikkelen ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret Allegheny helse nettverket. Alle pasienter gitt samtykke før administrasjonen av beroligende midler og de ble identifisert av tildeles en studere antallet.
1. sengen samling
Merk: Alt i denne protokollen bør gjøres på is, med pre kjølt løsninger. Det er viktig å indusere kaldt stasis i cellene å bevare deres i situ biologiske fenotypen. Denne protokollen innebærer håndtering av blod og celler fra mennesker og derfor universell forholdsregler bør overholdes.
- Etter tilbaketrekning av kateter av skjeden, umiddelbart fordype kateter i et 50 mL sentrifuge rør som inneholder 40 mL kjølt sterilt saltvann. Swirl kateter flere ganger å fjerne blod og tømme linjen om nødvendig å fjerne blod beholdt i linjen.
- Klipp av den distale 5 cm cath tips og la den falle i 50 mL sentrifuge røret som inneholder kjølt saltvann. Umiddelbart fjerne cath spissen med tang og overføre den til en 15 mL sentrifuge rør som inneholder 15 mL av endothelial celle (EC) vekst medium.
- Seal røret, plassere den på is og overføre til laboratoriet for å klargjøre for behandling eller frakt. Det er viktig at ballongen forblir midt i middels, så sørg for at det er minimal headspace i 15 mL tube av fylle den helt med EF oppblomstringen medium.
- Prosessen prøven umiddelbart ved fortsetter til trinn 2.1 eller segl og skipet prøven på våt is over natten for behandling i et laboratorium dyktig i denne protokollen. Hvis cellene til slutt skal brukes for cellekultur, er det anbefaler at cath spissen behandles umiddelbart på samme sted som den ble samlet inn.
2. celle Harvest
Merk: Alt i denne protokollen bør gjøres på is, med pre kjølt løsninger. Cellene er i kalde stasis, og det er viktig å unngå oppvåkning dem før de er klare til å være fast eller kulturperler. Denne hele protokollen skal utføres i laminær strømning hette, bruker sterilt instrumenter, hvis ultimate hensikten er høstet PAECs kultur. Hvis kulturen ikke er planlagt (f.eks flow cytometri analyse), er det ikke nødvendig å observere sterilt forholdsregler.
- Legge til 5 mL av cellen avdeling løsning slik 15 mL sentrifuge; Plasser på isen.
- Trekke 1 mL av EC media fra den gjenværende i sengen samling røret i 1 mL sprøyte.
- Fullføre trinnene 2.3 gjennom 2.5. Grep det kutte slutten av kateter spissen med hemostats.
- Nøye inn nålen av 1 mL "hvit" hullet overfor guidekabelen ("black hole"). Ta stor forsiktighet for å unngå skade med nålen.
- Overføre cath spissen til 15 mL sentrifuge røret som inneholder cellen avdeling løsningen.
- Økning av ballongen, være forsiktig med å briste. blåse ballongen med ca 200 µL av medier fungerer bra.
- Tillate kateter å sitte i cellen avdeling løsning på is 5 min med ballongen oppblåst. Hvis boblen deflates på egen hånd under 5 min incubation, er akseptabel.
- Hell innholdet i 15 mL sentrifuge røret i 100 mm parabolen. Plass ballongen i cellen avdeling løsningen "Dam".
- Skrap oppblåst ballong med cellen skraper. Celle-skraper kan trekkes rundt boblen i en sirkulær bevegelse eller en børsting bevegelse. Fokus på "polakker" på ballongen, der den møter kateter. Kontroller at celle skrapen kontakter hele overflaten av ballongen minst to ganger. Skyll celle skrapen i cellen avdeling løsningen "Dam" regelmessig.
- Deflate ballongen og skrape den med en børsting bevegelse. Skyll celle skrapen i cellen avdeling løsningen "Dam".
- Kast cath tips, nål og celle skrapen i riktig avfallsbeholderen.
- Hell celle avdeling løsningen inneholder cellen høsting inn i et 50 mL sentrifuge rør. Riste den samling rør og hell gjenværende media fra samlingen røret i samlet prøven også.
- Sentrifuge prøven på 650 x g ved 4 ° C i 10 min. Det er viktig å merke seg at ofte pellets ikke vil bli sett. Det kan være nyttig å markere stedet der pellets ville bli sett, hvis synlig, å unngå aspirating av pellets i tilfelle det er for liten til å bli sett.
Merk: Normalt er pellets bare sett når prøven er forurenset av blod. Blod forurensning er uvesentlig for ultimate harvest produktet fordi blod ikke binde CD146 perler og vasker gjennom kolonnen. Omfattende tester har vist at bestemt merke 1,5 mL microcentrifuge rør i Tabellen for materiale minimerer celle tap i forhold til andre rør brukes under protokollen optimalisering. - Nøye Sug opp media, og unngå forstyrre eller aspirating pellet.
3. celle rensing
Merk: Alt i denne protokollen bør gjøres på is, med pre kjølt løsninger. Cellene er i kalde stasis, og det er viktig å unngå oppvåkning dem før de er klare til å være fast eller kulturperler.
- Resuspend pellet i 1 mL av kjølt røde blodlegemer lysis løsning, og overføre den til en 1,5 mL microfuge rør; forsiktig rock i 10 min på 4 ° C.
- Sentrifuge for 5 min på 500 x g og 4 ° C. Sug opp RBC lysis løsningen.
- Resuspend pellet i 60 μL PBS, 20 μL FcR blokkering og 20 μL av anti-CD146 microbeads. Inkuber i 15 min på 4 ° C.
- Legg 1 mL av kjølt PBS. Sentrifuge for 5 min på 500 x g og 4 ° C. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av kjølt PBS.
- Plassere en magnetisk LS-kolonne på en magnetisk rack (se Tabell for materiale for bestemte kommersielle identiteten til disse elementene) i romtemperatur. Prime kolonne ved å legge til 1 mL av PBS og la hele volumet å strømme gjennom. Kast gjennomflytsenhet.
- Plass prøven i kolonnen magnetisk. Kast gjennomflytsenhet.
- Vask kolonnen med 3 mL kjølt PBS tre ganger. Kast gjennomflytsenhet fra hver vask.
- Legge 3 mL kjølt PBS slik 15 mL sentrifuge. Fjerne kolonnen magnetiske fra magnet, hell i 3 mL PBS fra 15 mL sentrifuge røret i kolonnen og raskt plassere kolonnen i sentrifuge røret å fange gjennomflytsenhet. Umiddelbart stupe med stempelet leveres med kolonnen. Prøven er nå renset, klar for fiksering/flekker eller kultur.
Representative Results
Denne protokollen gir rensing av celler, svane-Ganz kateter tips etter høyre hjerte catheterization, som binder seg til en CD146 utvalg kolonne og forover/side scatter profiler som er utvisket fra kulturperler primære menneske lunge arterie endotelceller (figur 1). Gitt at kateter ballongen er i fysisk kontakt med bare introducer skjede (en celle-fritt materiale), lungearterien fartøyet veggen, og blodet, data er tilgjengelig her for å demonstrere at disse cellene ikke er utledet fra blodet (figur 2) , og derfor er det antatt at de er faktisk utledet fra lungearterien fartøyet veggen. Leseren bør merke seg at de anti-CD146 magnetiske perlene som brukes til å rense cellene forblir tilhenger til celleoverflaten etter prosedyren, og dermed det er suboptimal å forsøke å analysere cellen høsting for CD146 som en markør av endotelceller. CD31 eller andre endothelial markører ville antagelig være tilgjengelig for merking og kan anses som alternativer.
Nøkkelelementer i denne protokollen har blitt identifisert som kan påvirke resultatene. Først er det viktig å skylle kateter spissen på sengen for å fjerne blod. Figur 3 viser siden xy (SSC) / fremover xy (FSC) profiler av gjennomflytsenhet anti-CD146-kolonnen for en prøve som var riktig skylt og en som ikke var. Kolonnen vises blod-avledet celler hindre høsting (figur 2), men det skyllingsprosess trinnet sikrer minimal mulig smitte sirkulere endotelceller (som er normalt finnes på < 50 celler/mL blod4). Vi har observert at eluate fra CD146 kolonnen er helt klart, selv i svært blodig kateter tips prøver. Dette tyder på at kolonnen er kjøpedyktig hånd betydelige mengder blod uten tilstopping eller beholde ikke-CD146 + bloodborne celler.
Det andre er det viktig å blåse tipsboblen minst en gang i cellen avdeling løsning/mobiltelefon skraper trinn. Gitt at de antatte PAECs på tipsboblen være tilhenger tross saltvann skylling steg, det synes kan de være delvis fanget av folder i vinyl boble som det er deflatert i forberedelse til fjerning av pasienten. Antagelig frigjør inflasjon trinnet PAECs, la dem forsiktig skrapes bort. Det er ikke umiddelbart klart man kan teste denne hypotesen, men lavere avkastning av celler er observert når boblen er ikke oppblåst (data ikke vist).
Endelig, er det viktig å merke seg at rentene av PAECs fra denne metoden kan variere betraktelig. Antagelig pasient-, sykdom state - og lege-spesifikke faktorer bidrar til denne variasjon, som protokollen inneholder trinn som forventes å medføre store kildematerialet. Tabell 1 viser representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører.
Figur 1 : SSC/FSC profiler av en typisk kateter ballong tips høst fra en lunge hypertensjon pasient (A) og et tilsvarende antall celler fra et kommersielt ervervet primære menneskelige PAEC kultur (B). Begge eksemplene var renset med kolonnen anti-CD146, fast og permeablized som beskrevet i protokollen, før FACS analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : SSC/FSC profiler av en typisk kateter ballong tips høst fra en lunge hypertensjon pasienten (A) og føljetong 1:10 fortynning av Ficoll forløpning-renset menneskelige buffy pels (B, C, D). (A) var renset med anti-CD146 kolonnen mens (B-D) var ikke. Alle cellen prøver ble fast og permeablized som beskrevet i protokollen, før FACS analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : SSC/FSC profiler av et kateter ballong tips harvest fra en lunge hypertensjon pasient i blodet som var synlig på kateter spissen før behandling. Før trinnet 3.1 av protokollen prøven ble delt og lyseringsbuffer ble lagt til en aliquot og trukket fra den andre. (A) og (C) viser SSC/FSC profiler av lysed prøven, begge cellene beholdes av kolonnen (A) og gjennomflytsenhet kolonnen. (B) og (D) Vis SSC/FSC profiler av unlysed prøven, begge cellene beholdes av kolonnen (B) og gjennomflytsenhet fra kolonnen (D). Vi konkludere med at lysis fjerner noen, men ikke alle av leukocytter men at leukocytter beholdes ikke i kolonnen og er derfor utelukket fra siste innhøstingen, uansett lysis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | Dato | Cellen avkastning | Diagnose |
| 433 | 4/17/2018 | 7364 | PH-interstitiell lungesykdom |
| 279 | 4/17/2018 | 7130 | PH-sklerodermi |
| 432 | 4/13/2018 | 3976 | PH-multifaktoriell |
| 431 | 4/13/2018 | 3634 | HFrEF |
| 390 | 4/13/2018 | 5666 | PAH |
| 423 | 3/23/2018 | 9024 | HFrEF |
| 272 | 3/23/2018 | 7098 | HFrEF |
| 408 | 2/27/2018 | 4784 | HFrEF |
| 403 | 2/14/2018 | 10376 | PH-ASD + mitral sykdom |
| 396 | 1/26/2018 | 4890 | HFpEF-IPCPH |
| 397 | 1/26/2018 | 7672 | Normal hemodynamics |
| 318 | 1/4/2018 | 7002 | HFrEF-LVAD finnes |
Tabell 1: CD146 + gir fra en rekke PAEC avlinger. Representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører.
Discussion
Teknikken er beskrevet i denne artikkelen er best verdsatt i sammenheng med tidligere eksperimentelle paradigmene for å studere lunge vaskulære endotelet. Tidligere forsøk på å hente PAECs fra mennesker har vært begrenset til explanted/cadaveric lungene5 og en kortvarig forsøk på å utvikle et kateter kan lungearterien biopsi6. Som nevnt i en fersk gjennomgang7, kjennetegnes stede teknikken fra lunge vev harvest av dens evne til å hente PAECs fra en levende menneske, og å gjøre det på flere tidspunkt i progresjon av sykdommen eller terapi. Det bør imidlertid bemerkes at en følgesvenn teknikk er nylig rapportert der indusert pluripotent stamceller (IPSCs) kan transdifferentiated i PAECs4,5. Denne teknikken gir rike kulturer av pasient-spesifikke PAECs og lar studie av virkningene av pasient-spesifikke genetisk bakgrunn på PAEC biologi. Til tross for disse fordelene gi disse IPSC-avledet PAECs ikke opplysninger om samspillet mellom lokale microenvironment og pasient-spesifikke genetisk bakgrunn. Vår egen gruppe har presentert den oppfatning at de "cath tips" og IPSC teknikker er vil være synergistisk fremme feltet8.
I denne nåværende og historiske sammenheng bemerkes begrensninger av denne teknikken. Først er det viktig å merke seg at rentene av PAECs fra denne metoden kan variere betraktelig. Antagelig pasient-, sykdom state - og lege-spesifikke faktorer bidrar til denne variasjon, som protokollen inneholder trinn som forventes å medføre store kildematerialet. Tabell 1 viser representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører. Andre cellen rentene er generelt lav, og sin levedyktighet for kultur har vist seg for å være lavere, men i våre hender. Mens tidligere har vi vokst kulturer av PAECs ved hjelp av denne metoden1, vi antar de resultatene representerer redningen av et delsett av progenitor celler etter die-off over det meste av prøven og er bare midlertidig vellykket i våre hender. For eksempel er det ikke uvanlig å finne bare noen få dusin tilhenger PAECs i kultur morgenen etter en avling er belagt. Ofte overleve disse mikro-kulturer ikke til utvidelse. Videre arbeid er nødvendig for å optimalisere denne protokollen på en måte som vil tåle levedyktigheten til PAECs og deres forhold i kultur å oppnå ønsket sikte på overføring av pasient-spesifikke PAEC avlinger. Til slutt, CD146 positive utvalget vi har tilpasset kan ikke utelate forurensning med andre CD146 + celler, som sirkulerer endotelceller4, pericytes, glatte muskelcellene og sjeldne CD146 + T celler9,10. Likevel, disse cellene antas å være svært få i prøver samlet på denne måten, og CD146 er betydelig mer spesifikt for denne protokollen enn andre cellen markører av endotelceller som CD31 (som er også til stede på en rekke blodbårne celler inkludert blodplater11). Alle fremtidige forbedringer å bedre spesifisitet bør balanseres mot deres potensielt negative innvirkning på avkastning.
Disclosures
MJP og RLB er oppfinnere på patenter hevde deler av metodene som er beskrevet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke legene og støtte ansatte i tjenesten avansert hjertesvikt og pulmonal hypertensjon Allegheny General Hospital for levering av hundrevis av kateter prøver over flere år som lettet det optimalisering av denne metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
| 16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
| Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
| Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
| Forceps | any | ||
| Hemostat | any | ||
| LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
| Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
| Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
| Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
| Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| PBS | Fisher | BP2438-4 | |
| Scissors | any | ||
| Syringes | BD | 309597 |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).
- Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization. Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).
- Benza, R. L., et al. In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction. Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).
- Bull, T. M., et al. Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).
- Kaneko, F. T., et al. Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).
- Rothman, A., et al. Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model. Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).
- Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era. European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).
- Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).
- Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood. Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).
- Elshal, M. F., et al. A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile. BMC Immunolology. 8, 29 (2007).
- Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
