Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

For zebrafisk er et modelsystem, der har mange værdifulde funktioner, herunder optisk klarhed, hurtige ekstern udvikling, og af særlig betydning for feltet af hørelse og balance, eksternt placeret sensoriske hårceller. Denne artikel beskriver hvordan transgene zebrafisk kan bruges til at analyse både hår-celle mechanosensation og præsynaptiske funktion i toto.

Abstract

Sensoriske hårcellerne er mechanoreceptors fundet i det indre øre, der er nødvendige for hørelse og balance. Hår celler aktiveres i reaktion på sensoriske stimuli, der mekanisk aflede apikale fremspring kaldt hår bundter. Afbøjning åbner mechanotransduction (MET) kanaler i hår bundter, fører til en tilstrømning af kationer, herunder calcium. Denne kation tilstrømning depolarizes cellen og åbner spænding-gated calcium kanaler ligger basalt på hår-celle presynapse. I pattedyr, hårcellerne er indkapslet i knoglen, og det er udfordrende at funktionelt vurdere disse aktiviteter in vivo. Derimod larve zebrafisk er gennemsigtige og besidder en eksternt placeret laterale-line orgel, der indeholder hårceller. Disse hårcellerne er funktionelt og strukturelt svarer til pattedyr hårceller og kan være funktionelt vurderet in vivo. I denne artikel beskrives en teknik, der udnytter en genetisk kodet calcium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, til at måle stimulus-fremkaldte calcium i zebrafisk laterale-line hårceller. GCaMP6s kan sammen med Konfokal imaging, bruges til at måle in vivo calciumsignaler på apex og base af laterale-line hårceller. Disse signaler giver en real-time, kvantificerbare udlæsning af både mechanosensation - og presynapse-afhængige calcium aktiviteter inden for disse hårceller. Disse calciumsignaler også give vigtige funktionelle oplysninger om hvordan hårceller registrere og transmittere sensoriske stimuli. Samlet set denne teknik genererer nyttige data om relative ændringer i calcium aktivitet in vivo. Det er mindre velegnet til kvantificering af absolut størrelsesklasse af calcium ændringer. Denne in vivo teknik er følsomme over for bevægelse artefakter. Et rimeligt beløb af praksis og dygtighed er nødvendige for korrekt positionering, immobilisering og stimulation af larver. I sidste ende, når korrekt udført, den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver en kraftfuld måde at samle værdifulde oplysninger om aktiviteten af hårcellerne i deres naturlige, fuldt integreret stater inden for et levende dyr.

Introduction

Funktionelle calcium imaging er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at overvåge aktiviteten på mange celler samtidigt1. Især har calcium imaging ved hjælp af genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) vist sig at være fordelagtig, fordi GECIs kan udtrykkes i specifikke celletyper og lokaliseret subcellularly2. I neurovidenskab forskning, har disse funktioner gjort calcium imaging ved hjælp af GECIs en kraftfuld metode til både definere aktivitet mønstre inden for neuronal netværk og måle calcium tilstrømning på individuelle synapser3,4. Drage fordel af disse funktioner, en nylig undersøgelse bruges Konfokal mikroskopi og GECIs til at overvåge subcellulært aktivitet inden for samlinger af sensoriske hårceller5.

Hår celler er de mechanoreceptors, der registrerer lyd og vestibulære stimuli i det indre øre og lokale vandbevægelse i det laterale-line system i akvatiske vetebrates6,7. Hår celler er ofte mål for skader eller genetiske mutationer, der resulterer i den mest almindelige form for hørenedsættelse hos mennesker kendt som sensorineural hearing tab8,9. Derfor er det vigtigt at forstå, hvordan disse celler funktion for at forstå hvordan man kan behandle og forebygge høretab. For at fungere ordentligt, udnytte hårceller to specialiserede strukturer, der kaldes mechanosensory-hår bundter og synaptic bånd til at registrere og transmittere stimuli, henholdsvis. Hår bundter er placeret på toppen af hårcellerne og består primært af fine, hår-lignende fremspring kaldes stereocilia (fig. 1A). I vestibulære og laterale-line hårceller har hver hår bundle også en enkelt lang kinocilium (cellens eneste sande cilium), som kan udvide langt over stereocilia (fig. 1A). Mechanosensory stimuli aflede hår bundter, og afbøjning sætter spændingen på forbindelser kaldet "tip-links" at sammenkoble stereocilia10. Denne spænding åbner mechanotransduction (MET) kanaler ligger i stereocilia, hvilket resulterer i en apikale tilstrømning af kationer, herunder calcium11,12. Denne apikale aktivitet i sidste ende depolarizes håret cellen og åbner spænding-gated calcium kanaler (Cav1.3) i bunden af cellen. Cav1.3 kanaler findes ved siden af synaptic bånd, en præsynaptiske struktur, der bindsler vesikler på aktive zoner. Basal calcium tilstrømning gennem Cav1.3 kanaler er nødvendig for vesikel fusion, neurotransmission og aktivering af afferente neuroner13,14.

I mange år, elektrofysiologiske teknikker som helhed-celle patch fastspænding har været brugt til sonde de funktionelle egenskaber af hårcellerne i mange arter, herunder zebrafisk15,16,17, 18,19,20. Disse elektrofysiologiske optagelser har været særligt værdifulde i felterne hørelse og balance, fordi de kan bruges til at opnå yderst følsomme målinger fra individuelle sensoriske celler, hvis formål er at indkode ekstremt hurtig stimuli over en bred vifte af frekvenser og intensiteter21,22. Desværre, hele-celle optagelser kan ikke måle aktivitet af populationer af hårceller. For at studere aktivitet af populationer af celler i zebrafisk laterale-line, er microphonic potentialer og afferente handling potentialer blevet brugt til at måle den summerede mechanosensitive og postsynaptiske respons egenskaber af individuelle neuromasts23 ,24. Desværre har hverken hele-celle optagelser eller lokale potentielle feltmålinger den rumlige opløsning at lokalisere hvor aktivitet foregår inden for enkelte celler eller måler aktiviteten af hver celle i en befolkning. Mere nylig, calcium farvestoffer og GECIs har været ansat til at omgå disse udfordringer25,26.

I zebrafisk, har GECIs vist sig for at være en kraftfuld tilgang til behandlingen af hår-celle funktion på grund af den relativt let at skabe transgene zebrafisk og den optisk klarhed af larver27. På zebrafisk larver der hårcellerne i det indre øre samt laterale-line system. Sidelinjen består af roset-lignende klynger af hår celler kaldet neuromasts, der bruges til at registrere lokale ændringer i vandbevægelse (figur 1). Sidelinjen er især nyttigt, fordi det ligger eksternt langs overfladen af fisken. Denne adgang har gjort det muligt at stimulere hårcellerne og måle calciumsignaler optisk i intakt larver. Lethed, hvormed transgenese, gennemsigtighed af larver, og laterale-line hårceller uovertruffen adgang har generelt gjort zebrafisk en uvurderlig model til at studere aktiviteten af hår celler in vivo. Dette er en betydelig fordel i forhold til pattedyr systemer som hår celler er omgivet af benede strukturer i det indre øre. Denne manglende adgang har gjort det meget vanskeligt at erhverve funktionelle in vivo målinger af pattedyr hårceller.

Protokollen skitseret her beskriver hvordan man kan overvåge MET kanal - og presynapse-afhængige ændringer i calcium inden for enkelte hårceller og mellem celler inden for neuromasts i larve zebrafisk. Denne protokol udnytter en etableret transgene zebrafisk linje, der udtrykker en membran-lokaliseret GCaMP6s under kontrol af hår-celle specifikke myosin6b promotor28. Denne membran lokalisering holdninger GCaMP6s for at opdage calcium tilstrømning gennem Ionkanaler placeret i plasma membran, der er afgørende for hår-celle funktion. For eksempel, membran-lokaliseret GCaMP6s kan afsløre calcium tilstrømning gennem MET kanaler i apikale hår bundter og gennem CaV1,3 kanaler nær synaptic bånd i bunden af cellen. Dette er i kontrast med hjælp af GECIs lokaliseret i cytosol, som cytosole GECIs opdage calciumsignaler, der er en kombination af markedsøkonomisk behandling og CaV1,3 kanal aktivitet samt calcium bidrag fra andre kilder (f.eks., store udgivelse). Denne protokol beskriver, hvordan at immobilisere og lamme GCaMP6s transgene larver inden billeddannelse. Derefter beskrives det hvordan du forbereder og bruge en væske-jet til at aflede hår bundter for at stimulere laterale-line hårcellerne i en kontrolleret og reproducerbar måde. Præsenteres repræsentative data, der kan opnås ved hjælp af denne protokol. Eksempler på data, der repræsenterer bevægelsen artefakter er også præsenteret. Kontrol eksperimenter, der bruges til at kontrollere resultaterne og udelukke artefakter er beskrevet. Endelig, en metode til at visualisere rumlige calciumsignaler i Fiji software er beskrevet. Denne Fiji analyse er tilpasset fra tidligere etablerede visualisering metoder udviklet ved hjælp af MATLAB5. Samlet set skitserer denne protokol en kraftfuld forberedelse teknik, som anvender GECIs larve zebrafisk at måle og visualisere hår-celle calcium dynamics in vivo.

Protocol

Alle dyr arbejde blev godkendt af dyr brug Udvalget på National Institutes of Health dyr undersøgelse protokollens #1362-13.

Bemærk: Denne protokol tager ca 0.5 til 1 h komplet med ingen afbrydelser, hvis løsninger og udstyr er forberedt og sat op på forhånd. Denne protokol er optimeret til Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 zebrafisk larver på 3-7 dage efter befrugtning (dpf). Denne transgene linje udtrykker en membran-lokaliseret GCaMP6s (zebrafisk codon-optimeret) specifikt i alle zebrafisk hårceller. Før imaging, er larver rejst i embryo buffer (E3) under standardbetingelser. Henvises til Tabel af materialer til katalog numre af alle udstyr og narkotika kræves for at udføre denne protokol.

1. forberedelse af løsninger

  1. Forberede 1 mL af α-bungarotoxin (125 µM), som bruges til at lamme zebrafisk larver under funktionel billeddannelse.
    1. Tilføje 968.6 µL sterilt ultrarent vand og 33.4 µL af phenol red til 1 mg af α-bungarotoxin (hele flasken). Gøre 100 µL delprøver og gemme dem på-20 ° C.
      Forsigtighed: Bære handsker og træffe forberedelser i kalechen, når du håndterer α-bungarotoxin pulver. Handsker anbefales også, når du håndterer α-bungarotoxin løsning.
  2. Forberede 1 L 60 x embryo buffer (E3).
    1. Tilføje 17,2 g NaCl og 0,76 g af KCl pulver til 954.4 mL i ultrarent vand.
    2. Tilføje 19,8 mL 1 M CaCl2, 19,8 mL 1 M MgSO4og 6 mL 1 M HEPES buffer til løsningen. Gemme x E3 60 stamopløsningen ved 4 ° C i op til 6 måneder.
  3. Forberede 10 L 1 x E3 (5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7,2), hvilket er en løsning, som larver er opformeret i forud for funktionel billeddannelse.
    1. 167 mL 60 x E3 stamopløsning tilsættes til 10 L ultrarent vand at gøre en 1 x E3 løsning. Gemme den 1 x E3 løsning ved stuetemperatur (RT) for op til 6 måneder.
  4. Forberede neuronal buffer (NB) (140 mM NaCl; 2 mM KCl; 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES buffer, pH 7.3), som bruges til at fordybe larver under funktionel billeddannelse.
    Bemærk: 1 x E3 kan også bruges til funktionelle imaging, men svarene er mere robust og pålidelig i NB.
    1. Kombinere 28 mL 5 M NaCl, 2 mL 1 M KCl, 2 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgCl2og 10 mL 1 M HEPES buffer med 957 mL i ultrarent vand. Bringe pH til 7,3 med 1 M NaOH.
    2. Filter sterilisere. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
      Bemærk: Bringe til RT før du bruger løsning.
  5. Forberede MS-222 materiel (tricaine, 0,4%), der bruges til bedøver larver.
    1. Opløses 400 mg ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate salt og 800 mg Na2HPO4 i 100 mL destilleret vand. PH indstilles til 7. Opbevares ved 4 ° C.
    2. Bruge 0,04% MS-222 til bedøver larver under immobilisering og α-bungarotoxin injektion.

2. forberedelse af Imaging kammer og Pins

  1. Forberede den billeddiagnostiske afdeling (fig. 2A). Påfør et tyndt lag af højt vakuum siliconefedt til bunden af perfusion kammer langs kanterne af pladsen som coverslip vil overholde. Efterlad ikke huller i fedt. Fast Tryk ned omkring kanterne af coverslip til at forsegle den billeddiagnostiske afdeling. Tør væk overskydende fedt.
    Bemærk: 5 mL sprøjte med en 200 µL mikropipette tip anbefales til fedt program.
  2. Forberede silikone encapsulant at fylde salen. Bland forholdet 10:1 (efter vægt) af basen til hærder. Blandes grundigt, men forsigtigt, ved hjælp af en mikropipette tip til at oprette minimale bobler.
    1. Hælde silikone encapsulant ind på de anbragt coverslip, så det er plan med overfladen af salen. Ca. 3 g encapsulant vil fylde salen.
    2. Omhyggeligt tryk kammer mod en flad overflade samtidig vandret, eller bruge en mikropipette tip (under et stereomikroskop) til at fjerne eller trække bobler til kanten af salen.
    3. Sted i salen i et laboratorium ovn overnatning på 60 – 70 ° C. Placer kammer inde i en ventileret for at sikre, at varm luft ikke blæser direkte på encapsulant at undgå at skabe bølger.
  3. Brug fine pincet og wolfram tråd til at mode nåle bruges til at immobilisere larver gennem hoved og hale (figur 2B1) på den hærdede encapsulant.
    1. For at gøre hoved pins, hold et stykke af 0,035 mm wolfram tråd i den ene hånd under et stereomikroskop. Bruger fine pincet i anden hånden, bøje wire 1 mm op fra slutningen på 90°. Udveksle pincet til fine saks og klippe 1 mm efter bøje oprette pin.
    2. Gentag trin 2.3.1 med 0,025 mm stålwire til at gøre hale pins, men forlade 0,5 mm ledning på begge sider af svinget. Bruge pincet til at indsætte benene i den hærdede encapsulant på kammer (til opbevaring).

3. forberedelse af nåle til lammelse og Stimulation

  1. Forberede hjerte injektion nåle ved hjælp af glas kapillærer med en glødetråd. Trække nåle til en indre tip diameter på 1-3 µm (figur 2C).
  2. Forberede væske-jet nåle ved hjælp af glas kapillærer uden en glødetråd. Trække nåle med en tynd, lang spids, der kan brydes til den korrekte tip diameter.
    1. Knækker den tynde, lange spids af væske-jet nålen ved at gnide det vinkelret mod en anden væske-jet nål eller en keramiske fliser lige over hvor nål-spids kan være bøjet for at skabe en indre tip diameter på 30 – 50 µm [figur 2C (midterste billede) og Figur 3 A2]. Sikre, at pausen er selv på tværs af spidsen (figur 2C, midterste billede) og ikke takkede eller for stor (figur 2C, højre billede) at garantere selv og nøjagtige væske flow under hår-celle stimulation.
      Bemærk: En nål poler kan bruges til at rette ujævne pauser.

4. fastgørelse og immobilisere larve til Imaging kammer

  1. Bade en Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) larve i ca. 1 mL E3 buffer indeholdende 0,04% MS-222 for 1-2 min. på silikone encapsulant overfladen af imaging salen indtil larve bliver immobile eller ikke reagerer på røre.
    1. Under et stereomikroskop placere larve på midten af perfusion kammer, så det ligger fladt på sin side mod silikone encapsulant.
      Bemærk: For konsistens, altid montere larver på den samme side (f.eks. højre side ned, venstre side op) (figur 2B1).
  2. Brug fine pincet, bringe en 0,035 mm hoved pin ned vinkelret på larve og kammer. Indsæt hoved pin mellem øjet og eksotiske vesikel og ned i encapsulant (tal 2B1 og 2B2). Bruge et andet sæt af tang til at stabilisere larve langs dens dorsale eller ventrale side mens fastgørelse. Sikre, at den vandrette del af stiften kontakter larve og ikke trykke hele vejen ind i encapsulant. Vinkel pin ventrally (figur 2B1) eller peger lidt mod den forreste af fisk til at undgå at blande sig med efterfølgende hjerte injektion og hår-celle imaging.
    1. Brug af pincet, indsætte en 0,025 mm hale pin i notochord så tæt som muligt på udgangen af halen (figur 2B1).
      Bemærk: Vær omhyggelig med at undgå at strække larve. PIN larve flade. Øjne bør være overlejret (figur 2B1). Dette er meget vigtigt for at lette hjertet injektion (figur 2B2-B2', trin 5), at lette et ønskeligt tænkelig plan (figur 1B1-B2'', trin 8 og 9), og kvantificere intensiteten af væske-jet stimulus ( Figur 3A3, skridt 7).

5. indsprøjtning af α-Bungarotoxin i hjertet hulrum til at lamme larve

Bemærk: Bære handsker ved håndtering af α-bungarotoxin.

  1. Der centrifugeres α-bungarotoxin alikvot kortvarigt forudgående at bruge til at forhindre tilstopning af hjertet injektion nål.
    1. Opfyldning 3 µL af α-bungarotoxin løsning til et hjerte injektion nålen ved hjælp af en gel ladning pipette tip. Indlæse løsningen jævnt på spidsen med ingen bobler.
    2. Indsæt hjerte injektion nålen i en pipette indehaveren er knyttet til en manuel micromanipulator. Placer nålen under et stereomikroskop, så det er tilpasset vinkelret A-P akse af de fastgjorte og bedøvede larver, peger ned i en vinkel på ~ 30°.
    3. Tilslut indehaveren pipette til pres injektor. Anvende de følgende foreslåede indstillinger: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s, og Pcompensation = 5 hPa. Indsprøjte en bolus i løsning at afprøve om needle-tip er patent.
    4. Kigge efter en lille pust af den røde løsning (fra phenol red) for at forlade spidsen af nålen. Hvis ingen rød farve ses, meget forsigtigt skrabe nål spidsen mod kanten af en PIN-kode og prøv igen indtil nålen er patent. Alternativt kan du trække en nål med en større tip åbning.
  2. Forhånd nål mod hjertet, indtil det rører huden uden for hjertet (figur 2B2). Tryk på nålen i larve og kigge efter indrykningen af pigment cellen på huden foran hjertet til at sikre, at nålen placeres i den rigtige fly i forhold til larver (figur 2B2 ").
    1. Forhånd nålen yderligere, indtil det gennemborer huden og ind i hjertet hulrum. Træk nålen tilbage lidt. Indsprøjte en bolus af α-bungarotoxin i hjertet hulrum. Ser for inflation i hjertet hulrum eller for rødt farvestof ind i hulrummet.
  3. Forsigtigt skyl larve 3 gange med 1 mL af NB at fjerne resterende MS-222. Aldrig fjerne alle af væsken. Vedligeholde larve i ca. 1 mL af NB på perfusion kammer.
    Bemærk: Sikre, at larver hjerterytme og blodgennemstrømningen er fortsat robust efter pinning og hjertet injektion og i hele den hele imaging eksperiment.

6. forberedelse af mikroskop og væske-jet Setup

  1. Samle en opretstående Konfokal mikroskop ved hjælp af de komponenter, der er beskrevet i Tabel af materialer: en Konfokal mikroskop med en 488 nm laser og passende filtre, mikroskop software til at styre og koordinere imaging og stimulation, 10 x luft mål, 60 x vand mål, piezo-Z objektive Skanner (nemlig z-stacks), højhastighedskamera, cirkulær kammer adapter, motoriserede stadium, og scenen Indsæt adapter. Henvise til Zhang et al.29 yderligere indstillinger og vejledning om mikroskop opsætninger.
  2. Saml flydende jet består af 3 hovedkomponenter: en vakuum og tryk pumpe, højhastigheds tryk klemmen og hoved fase (også beskrevet i tabel materialer). Brug højhastigheds tryk klemmen til at kontrollere timing og varighed af tryk eller vakuum udledning fra stadiet hoveder og til væske-jet pipette.
    1. Forbind udgangen af hoved scenen til væske-jet pipette indehaveren via tykvæggede silikoneslanger.

7. justering af larve og væske-jet

Bemærk: Der er 3 fly af interesse inden for hver neuromast: (1) tips af hår bundter (figur 3A3: kinocilia, bruges til at måle stimulus intensitet); (2) hår-bundle MET fly (figur 1B1-B1': base af apikale hår bundter hvor MET-kanal-afhængige calciumsignaler registreres); og (3) den synaptiske fly (figur 1B2-B2': hvor præsynaptiske calciumsignaler registreres i bunden af hår celle). Disse fly er skitseret i figur 1A.

  1. Opfyldning 10 µL af NB i en korrekt brudt væske-jet nål (fra trin 3.2) ved hjælp af en gel ladning tip. Indlæse løsningen jævnt på spidsen med ingen bobler. Indsætte nålen i pipette indehaveren er knyttet til den motoriserede micromanipulator.
  2. Placere perfusion kammer i en cirkulær kammer adapter på stadiet mikroskop.
    Bemærk: For konsistens, altid placere larve i den samme retning (fx, salen indeholdende larve med sin bagdel mod flydende jet og ventrale side vender mod eksperimentatoren).
    1. Flytte den motoriserede stadium, så larve er i midten af synsfeltet. Slå den cirkulære kammer-adapter, så A-P akse af larve er nogenlunde på linje med bane af væske-jet nålen.
    2. Ved hjælp af overførte lys og differential interferens kontrast (DIC), bringe larve i fokus og centrere det under målet om 10 x. Rejse 10 x mål.
  3. Ved hjælp af en motoriseret micromanipulator, bringe væske-jet nålen ned i midten af synsfeltet så det er belyst i modlys og knap røre NB løsning.
    1. Lavere 10 x mål. Fokusere på larve at bekræfte beliggenheden. Fokusere op for at finde væske-jet nålen. Flytte væske-jet nålen med micromanipulator i x - og y - akserne indtil den er på stand parallelt med den dorsale side af fisk.
    2. Fokus tilbage på larve. Bringe nålen ned i z-aksen. Placer nålen langs den dorsale side af fisk og ~ 1 mm væk fra kroppen (figur 3A1).
    3. Omhyggeligt flytte cirkulære kammer-adapteren (om nødvendigt) at sikre, at væske-jet nålen er afstemt langs A-P midterlinjen af larver (figur 3A1).
    4. Flytte den motoriserede stadium at placere neuromast af interesse i midten af synsfeltet. Holde væske-jet nål tip langs den dorsale side af fisken. Rør ikke ved spidsen af væske-jet nålen til larve eller kammer overflade.
  4. Skifte til 60 x vand mål. Sikre, at målet er nedsænket i NB løsning. Brug fine fokus på at finde en neuromast ved hjælp af overførte lys og DIC optik.
    Bemærk: Denne opsætning er designet til at stimulere neuromasts langs den primære posterior sidelinjen. Hår celler inden for disse neuromasts reagerer på enten anterior eller posterior styret flydende flow. Se Chou et al.31 for en nøjagtig kort over neuromast væske følsomhed i det laterale-line system.
    1. Placer væske-jet nålen med micromanipulator, så er det 100 µm fra yderkanten af neuromast (figur 3A2).
      Bemærk: Vælg neuromasts, der tilbyder klar top-down visninger (tal 1B1'-B2' og figur 3A3) i stedet for side-vinklet visninger (figur 1C1-C2). Klart oppefra giver mulighed for samtidige imaging af alle apikale hår bundter i et enkelt optisk fly eller imaging af synaptic områder i færre optiske fly (figur 3A3).
    2. Fokus op til spidsen af de apikale hår-bundter (kinocilia) (figur 1A, tal 3A2 og 3A3). Bunden af væske-jet nålen skal være i fokus i denne plan.
  5. Sæt højhastigheds tryk klemmen fra manualen til eksterne mode at modtage input fra de billedbehandlingsprogrammer.
    1. Nul højhastigheds tryk klemmen ved at trykke på knappen "nul". Brug sætpunkt knop til at indstille den hvilende pres lidt positiv (~ 2 mmHg). Bekræfte den hvilende output af højhastigheds tryk klemmen ved hjælp af en PSI manometer knyttet til hovedet fase output.
      Bemærk: Sæt lidt overtryk i hvile til at undgå den gradvise udbredelse af væske ind i væske-jet nålen over tid. Hvis væske træder slangen tilsluttet væske-jet og når hovedet scenen, kan det beskadige udstyr.
    2. Bestemme det tryk der er nødvendige til at stimulere hår bundter. Bruge en 0,125 og 0,25 V input (6,25 og 12,5 mmHg) for 200-500 ms til at anvende en test stimulus (figur 3A3-A3'').
      Bemærk: Højhastigheds tryk klemmen konverterer en spænding input (fra software eller andre enheder, der forbinder til BNC-porten på højhastigheds tryk klemmen kommando port) i pres, der udledes fra hoved scenen, og i sidste ende, væske-jet nål (1,0 V = 50 mmHg, mens -1,0 V =-50 mmHg). I denne konfiguration (Se trin 7.2) positive pres (push) afbøjer hår bundter mod den forreste, og undertryk (pull) afbøjer hår bundter mod bageste.
    3. Brug gennemlyset og DIC optik sammen med en skalalinjen, måle afstand af indbøjningen af 6,25 og 12,5 mmHg stimuli af tips af hår bundter, kinocilia (figur 1A og tal 3A3-3''). Vælg et pres, der bevæger sig i bundter (som 1 sammenhængende enhed) en afstand af ca 5 µm (figur 3A3''). Sikre, at spidsen af kinocilia forbliver i fokus hele tiden.
    4. Flytte væske-jet ± 25 µm langs A-P aksen af larve til at finde en afstand og pres, der afbøjer tips af kinocilia 5 µm.
      Bemærk: Brug GCaMP6s i larver 3 – 7 dpf, 5 µm fordrejninger bør opnå nær mætte GCaMP6s calciumsignaler og bør ikke skade apikale hår-bundle strukturer (figur 3A3''). Mindre forskydning afstande kan bruges til at levere ikke-mætte stimuli (figur 3A3'). Forskydning afstande > 10 µm er svære at estimere ( figur 3A3'' ') og kan være skadeligt over tid. Signal mætning er afhængig af alder af neuromast (og kinocilial højde) samt indikatoren bruges. Kontrollere passage af væske-jet nålen i hver retning (pres/tryk og vakuum/pull) periodisk under imaging. Væske-jet nåle tilstopper let og miste vakuum passage, men de bevare resttryk passage. Bruge DIC optik og en kort test stimulus i hver retning for at kontrollere for væske-jet passage.
    5. Fokusere prøven ind i flyet af interesse (f.eks. bunden af apikale hår bundter eller bunden af hår celle i den synaptiske flade; Figur 1 B1-B2').

8. imaging erhvervelse Procedure mulighed 1: Single-plane erhvervelse

Bemærk: Alle tænkelig skitseret i denne protokol er udført på RT.

  1. Indstille imaging software til at erhverve en streaming eller kontinuerlig 80-frame erhvervelse med en fange hver 100 ms for at opnå en rammehastighed på 10 Hz.
  2. Indstille gain, blænde og laser power til at optimere signal detection, men undgå mætning, photobleaching og støj. Eksempel indstillingerne for en Opterra/SFC er som følger: 488 nm laser power: 50 (hår-bundle MET fly), 75 (synaptic flade); 35 µm slids; få = 2,7; EM gevinst = 3900.
    Bemærk: Anvende 2 X binning hvis signaler er for svage eller støjende eller have overdreven photobleaching. 2 x binning vil øge signal detection på bekostning af rumlige opløsning.
  3. Vælg et incitament til at levere i løbet af 80-frame (8 s) erhvervelse efter ramme 30, på 3 s.
    Bemærk: Nogle eksempel stimuli er som følger: 200 ms (+ eller - 0,25 V) op til 2 s (+ eller - 0,25 V) trin i den forreste eller bageste retning at identificere retningsbestemt følsomheden af hvert hår celle; 2 s, 5 Hz firkantbølge (0,25 V til 200 ms,-0.25 V til 200 ms, gentages 5 gange) til at stimulere alle hår celler samtidigt. Et positivt pres (anterior stimulus) vil aktivere halvdelen af hårceller. Et undertryk (posterior stimulus) vil aktivere den anden halvdelen af hårceller. Sørg for den stimulus software eller enheden returnerer pres klemme tilbage til 0 V efter stimulus er færdig.
  4. Foranstaltning mechanosensitive calcium svar. Fokusere på basis af de apikale hår bundter (tal 1A og 1B1-B1') og begynde at image erhvervelse.
    Bemærk: Hvis neuromast ses tydeligt fra toppen ned (figur 1B1-B1'), alle apikale hår bundter kan være afbildet samtidig i et enkelt fly.
  5. Måle præsynaptiske calcium svar. Fokus i bunden af hårcellerne (tal 1A og 1B2-B2') og begynde at image erhvervelse.
    Bemærk: Hvis neuromast ses tydeligt fra toppen ned (figur 1B2-B2'), de præsynaptiske imaging fly af alle hårceller kan erhverves i 2-3 fly sæt 2 µm fra hinanden. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] transgene fisk kan bruges til at identificere og lokalisere præsynaptiske bånd og websteder af calcium posten29.

9. imaging erhvervelse Procedure mulighed 2: Flere fly erhvervelse

  1. Tune piezo-Z knyttet til 60 x mål for hurtig erhvervelser (12-18 ms). Sikre, at max-hastighed indstillinger er markeret.
  2. Oprette en Z-stakken erhvervelsen ved hjælp af et piezo-Z. Erhverve hår-bundle MET aktivitet i 5 fly med trin størrelse 0,5 µm. anskaffe de præsynaptiske signaler i 5 fly med trin størrelse på 1 µm.
  3. Indstil billedfrekvensen til 10 Hz. Hver ramme vil være fanget hver 20 ms og hver Z-stak hver 100 ms.
  4. Opsætning af anskaffelsessum for 400 rammer eller 80 Z-stakke ved 10 Hz i en 8 s streaming erhvervelse.
  5. Indstille laser power, blænde og gevinst i at optimere signal detection, men undgå mætning, photobleaching og støj. Eksempel indstillingerne for en Opterra/SFC system er som følger: 488 nm laser power: 75 (hår-bundle MET fly), 125 (synaptic flade); 35 µm slids; få = 2,7; EM gevinst = 3900.
    Bemærk: Anvende 2 X binning hvis signaler er for svag,støjende, eller have overdreven photobleaching. 2 x binning vil øge signal detection på bekostning af rumlige opløsning.
  6. Vælg et incitament til at levere i løbet af erhvervelse startende ramme 150, efter 3 s.
  7. Fortsætte protokollen, som beskrevet ovenfor for enkelt fly erhvervelse, men centrere Z-stak i de apikale eller basal fly (trin 8,4 og 8.5).

10. kontrol: Farmakologiske blok af alle Evoked calciumsignaler

Bemærk: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) Ethan-N, N, N′, N′-tetraacetic syre) behandling er en kritisk kontrol når først etablering af denne protokol.

  1. Når du har fuldført trin 8 eller 9, skal du erstatte NB med 1 mL af NB indeholdende 5 mM BAPTA til kløver tip links skal gate apikale MET kanaler ligger i hår bundter.
  2. Der inkuberes i 10 – 20 min på RT.
  3. Vaske BAPTA 3 gange med 1 mL af NB.
  4. Gentag trin 8 eller 9. Efter BAPTA behandling, bør der ikke ændres i GCaMP6s fluorescens i svar til væske-jet stimulation i enten apikale hår bundter eller synaptic fly. Hvis ændringer i GCaMP6s fluorescens fortsætter, disse er ikke sandt calciumsignaler og kan være motion artefakter.

11. kontrol: Farmakologiske blok af præsynaptiske calciumsignaler (valgfri)

  1. Når du har fuldført trin 8 eller 9, skal du erstatte NB med NB indeholdende 10 µM isradipine med 0,1% dimethylsulfoxid (DMSO) at blokere L-type calcium kanaler på hår-celle presynapse.
  2. Der inkuberes i 10 min. ved RT.
  3. Uden at udføre en vask, skal du gentage trin 8 eller 9. Efter behandling, skal der stadig være GCaMP6s fluorescens ændringer som reaktion på væske-jet stimulation i apikale hår-bundter, men ikke synaptic flyet. Hvis ændringer i GCaMP6s fluorescens fortsætter i synaptic flyet, disse er ikke sandt calciumsignaler og muligvis bevægelse artefakter.

12. billede forarbejdning og grafisk repræsentation af Data

Bemærk: Bruge Fiji (trin 12.1 – 12.1.5) og en graftegning program (trin 12.2 – 12.2.3) til trin 12. StackReg, TurboReg (trin 12.1.3), tid serien Analyzer V3 (trin 12.1.4–12.1.6), og Fiji plugins er også påkrævet (Se Tabel af materialer).

  1. Åbne en billedsekvens i Fiji, enten en enkelt-plane tidsserier (80-frame enkelt fly) eller Z-stakken tidsserier (400-rammen multi fly). Klik på "Fil," Vælg "Importer" fra drop-down menuen, og klik på "Billedsekvens."
    1. For en Z-stakken gange serie, Z-projekt hver gang punkt (5 fly pr. tidspunkt) til at oprette en 80-frame billedsekvens. Klik på "Billede," Vælg "Stakke" fra drop-down menuen, Vælg "Værktøjer" fra drop-down menuen, og klik på "Grupperet Z-projekt." Vælg "Gennemsnitlige intensitet" som metoden projektion, og Angiv "5" for "Gruppestørrelse".
      Bemærk: Hvert fly inden for Z-stak kan analyseres særskilt for yderligere geografisk information.
    2. Fjern det første 1 s (10 billeder) fra 8 s (80 frames) af image erhvervelse. Klik på "Billede," Vælg "Stakke" fra drop-down menuen, Vælg "Værktøjer" fra drop-down menuen og klik på "Make Substack." Indtast "11-80" for "Skiver".
      Bemærk: Denne substack vil blive omtalt som stk1.
    3. Registrere billedsekvens (stk1) bruger StackReg plugin32. Klik på "Plugins," Vælg "StackReg" og vælg "Oversættelse" som metoden til registrering af 70-frame tidsserier.
      Bemærk: Denne registrerede substack vil blive omtalt som stk2.
    4. Bruge gange serie Analyzer V3 plugin til at udtrække GCaMP6 intensitet (F) målinger. Placer en region af interesse (ROI) på apikale hår bundter eller præsynaptiske websteder i stk2. Henvise til ImageJ hjemmeside (Se Tabel af materialer for linket) for instruktioner om hvordan man bruger tid serien Analyzer V3.
      Bemærk: Bruge en cirkulær 1 – 2 µm ROI for apikale hår bundter og en cirkulær 3-5 µm ROI for synaptic flyet (tal 4A1 og 4A2).
    5. Vælg parametrene måling. Klik på "Analyze," Vælg "Sæt måling", og sikre, at kun "mener grå værdi" er markeret.
    6. Vælg alle ROIs i ROI manager, og brug funktionen støtteaftaler for flere foranstaltninger til at generere (F) intensitetsværdierne for hver ROI i tidsserierne. Inden for ROI Manager, klik på "Mere >>", og vælg "Multi foranstaltning" fra drop-down menuen.
  2. Plot (F) værdier. Indsæt værdier (F) fra "Multi foranstaltning" resultater i en graftegning program til at oprette en X-Y Graf (tal 4A1 'og 4A2').
    Bemærk: Oprette (X) værdier manuelt eller bruge tidsstempel fra metadataene.
    1. Kvantificere baseline (Fo) for hver ROI af gennemsnit (F) værdier i graftegning programmet fra før stimulus rammer 1-20.
    2. For hver ROI, Subtraher (Fo) fra værdierne af (F) ved hvert tidspunkt til at oprette ΔF (F-Fo) værdier. Replot, hvis det ønskes.
    3. Beregne og plot ΔF/Fo. For hver ROI, opdele ΔF måling af (Fo) og replot (tal 4A1'' og 4A2'').

13. image Processing og varme kort repræsentation af Spatio-temporale calciumsignaler

Bemærk: Tidligere arbejde at skabe rumlige varme kort repræsentation af calciumsignaler i zebrafisk laterale-line hårceller har anvendt brugerdefinerede software skrevet Matlab5,28. Denne analyse er blevet tilpasset for open source-analysesoftwaren Fiji33. Brug Fiji for alle trinene nedenfor. StackReg og TurboReg Fiji plugins er også påkrævet (Se Tabel af materialer).

  1. Udfør trin 12.1 – 12.1.3 for hver Z-stakken eller enkelt fly tidsserier til at oprette de registrerede substack omtales som stk2.
  2. Bruge stk2 til at skabe en baseline billede. Klik på "Billede," Vælg "Stakke" fra drop-down menuen og vælg "Z projekt". Vælg "Gennemsnitlige intensitet" for "Projektion type", og indtast "1" til "Start skive" og "20" for "Stop slice".
    Bemærk: Denne Z-projektion vil blive omtalt som baselineIMG.
    1. Tidsligt bin 70-frame (F) billedsekvens (stk2) i 14 0,5-s siloer. Klik på "Billede," Vælg "Stakke" fra drop-down menuen, Vælg "Værktøjer" fra drop-down menuen, og klik på "Grupperet Z projekt". Vælg "Gennemsnitlige intensitet" som metoden"projektion", og Indtast 5 til "Gruppestørrelse."
      Bemærk: Denne grupperede Z-projektion vil blive henvist til som stk2bin og F i figur 5.
    2. Subtrahere pixelværdi af baseline (baselineIMG) fra binned (F) billede sekvensen (stk2bin) til at oprette en ΔF billedsekvens. Klik på "Processen" og vælg "Billede regnemaskine" fra drop-down menuen. Vælg stk2bin som "Billede1" og baselineIMG som"Image2." Vælg trække"" for "Drift."
      Bemærk: Denne baseline-trækkes Z-projektion omtales som stk2binBL og F-BL = ΔF i figur 5.
  3. Vælg en opslagstabel (LUT) af valg for at vise ΔF billedsekvens (stk2binBL). Klik på "Billede," Vælg "Opslagstabeller" fra drop-down menuen, og klik på en LUT valg.
    Bemærk: "Red Hot" er LUT bruges i figur 5. Denne baseline-trækkes Z-projektion med LUT omtales som stk2binBL-LUT og ΔF LUT i figur 5.
    1. Sat minimum (min) og maksimum (max) lysstyrkeværdierne for stk2binBL-LUT. Klik på "Billede," Vælg "Juster", og klik på "Lysstyrke/kontrast". ØNSKEVÆRDI min fjerne baggrundsstøj fra stk2binBL-LUT. Indstille max værdier at bevare signaler af interesse men undgå signal mætning [fx 200 til 1600 (12-bit billede intensitet Interval = 0 til 4095)].
      Bemærk: Bruge samme min og max værdierne, når du foretager en visuel sammenligning eller repræsentationer. En ΔF kalibrering LUT bar kan genereres i Fiji for hver LUT billedsekvens (f.eks. stk2binBL-LUT). Klik på "Analyze," Vælg "Værktøjer" og klik på "Kalibrering Bar". Unclick "Overlay" til at generere en separat, individuelle billede med LUT kalibrering bar dokumentationsredskab.
    2. Konvertere begge ΔF (stk2binBL-LUT)med den ønskede LUTand tidsligt binned (F) billede (stk2bin) sekvenser til RGB. Klik på "Billede," Vælg "Type", og klik på "RGB farve."
      Bemærk: De RGB-konverteret Z-fremskrivninger vil blive omtalt som stk2binBL-LUT-RGB og stk2bin-RGB, henholdsvis.
  4. Overlay ΔF LUT billeder (stk2binBL-LUT-RGB) på arkiveret lodret (F) billeder (stk2bin-RGB). Klik på "Processen" og derefter "Image Calculator". Vælg stk2bin-RGB som billede1 og stk2binBL-LUT-RGB som Image2. Vælg "Gennemsigtig-nul" for "Operation".
    Bemærk: Hvis der er for meget støj eller baggrund i ΔF LUT overlay, skal du gentage trin 13.3 at øge min værdi. Hvis der er mætning, Gentag trin 13.3 og forøge værdien max.

14. billedet forarbejdning og Spatio-temporale varme kort repræsentation ved hjælp af en Fiji makro

Bemærk: Følgende afsnit henviser til en Fiji makro kaldet LUToverlay baseret på trin 13 som vil automatisk skabe rumlige varme kort repræsentation af GCaMP6s signaler. Denne analyse kræver open source analyse software Fiji33 og StackReg og TurboReg Fiji plugins (Se Tabel af materialer).

  1. Download Fiji LUT overlay makro (LUToverlay.ijm) ledsager denne protokol (Se Supplerende kodning fil).
  2. Åbn enten en multi fly tidsserier eller single-plane tidsserier (Se trin 12.1).
  3. Klik på "Plugins", Vælg "Makroer," Klik på "Kør", og vælg makroen LUToverlay. En dialogboks vises med teksten, "Fortæl mig om dit billede erhvervelse".
    Bemærk: Dialogboksen, de nuværende numre er foreslåede værdier og kan ændres efter installationen bruges af eksperimentatoren. Værdierne der er angivet i boksen og nedenfor er angivet en multi fly tidsserie med 400 billeder og 5 fly pr. tidspunkt (trin 9).
  4. Efter "Antal fly pr. tidspunkt", indtaste antallet af fly pr. tidspunkt (f.eks trin 12.1.1 ved hjælp af en multi flyet 400 tidsserier med 5 fly pr. tidspunkt, Indtast "5"). For et enkelt fly erhvervelse (f.eks., trin 8) indtaste "1".
    Bemærk: I de resterende dialogbokse, en multi fly tidsserie, "Timepoints" henviser til nummer billederne i den forventede Z-stak (f.eks.for trin 12.1.1 er 80 timepoints).
    1. Brug indstillingen "Definere interval til at analysere" fjerne den første 1 s af billedsekvens (f.eks trin 12.1.2 Vælg "11-80" til at fjerne de første 10 rammer og første 1 s).
    2. Efter "definere timepoints i baseline", Indtast antallet af billeder der skal bruges til at oprette det oprindelige billede [f.eks trin 13.2., indtaste "20" til at bruge pre stimulus billeder (11-30)].
    3. Efter "Timepoints per tidsmæssige bin" Indtast antallet af billeder til bin til overlejringen. (f.eks. for trin 13.2.2. Vælg "5" til at oprette 14 0,5-s placeringer).
    4. Efter "Min intensitet" og "Max intensitet" Angiv de minimale og maksimale lysstyrke værdier, der vil fjerne baggrundsstøj (minimum) og fastholde signaler af interesse samtidig undgå mætning (maksimum).
    5. Efter "Vælg en opslagstabel", Vælg LUT ønskes til overlejringen. Klik på "OK".
      Bemærk: Makroen slutter analysere billederne i overensstemmelse med vejledningen i trin 13. Billeder genereret med makroen vil også være opkaldt efter anvisningerne i trin 13.
  5. Luk alle analyse windows før du behandler en ny billedsekvens.

Representative Results

Efter myo6b:GCaMP6s-caax transgene fisk er korrekt immobiliserede og væske-jet stimulus er leveret til laterale-line hårceller, robust calciumsignaler kan visualiseres og målt (tal 4 og 5, taget på 2 X binning). Under væske-jet stimulation signalerer calcium, kan enten måles i de apikale hår bundter, hvor MET kanaler åbne som svar på stimuli, eller i bunden af hårcellerne, hvor præsynaptiske Cav1.3 calcium kanaler udløse neurotransmission. Et repræsentativt eksempel på calcium svar i disse regioner med en enkelt neuromast er vist i figur 4A1-A2''. I dette eksempel, blev en 2-s 5 Hz væske-jet stimulus leveret for at aktivere alle hår celler inden for den repræsentative neuromast. Under stimulus, robust calciumsignaler kan påvises i hår bundter (figur 4A1-A1'', svar fra 8 hår bundter er vist). I dette system vise næsten alle modne hårceller denne apikale tilstrømning af calcium5. Derimod inden for den samme neuromast, der er påviselig calciumsignaler i basal, synaptic flyet i kun en delmængde (~ 30%) af hårcellerne (figur 4A2-A2'', 4 celler med præsynaptiske svar er vist)5. 4 grønne ROIs Vis celler med ingen betydelig præsynaptiske calciumsignaler (figur 4A2-A2'') trods robust apikale calciumsignaler (figur 4A1-A1''). I denne repræsentativt eksempel (figur 4A1-A2''), farvet ROIs matche op hår bundter i det apikale markedsøkonomisk behandling plan (figur 4A1) med deres celle organer i basal synaptic flyet (figur 4A2). Dette eksempel fremhæver, hvordan begge MET afhængige - og præsynaptiske-calcium signaler kan måles inden for enkelte hårceller og blandt befolkningerne i hårceller.

Calciumsignaler i både hår bundterne og på presynapse kan afbildes grafisk som enten rå (F) GCaMP6s intensitet eller ΔF/Fo GCaMP6s intensitet (Se trin 12, tal 4A1'-A1'' og 4A2'-A2''). (F) GaMP6s grafer fremhæve at baseline fluorescens intensitet for hver celle kan variere (tal 4A1' og 4A2'). I ΔF/Fo GCaMP6s grafer, hver celle er normaliseret til sin oprindelige værdi og relative intensitet ændringen fra baseline er afbildet (tal 4A1'' og 4A2''). I begge (F) og ΔF/Fo GCaMP6s parceller, calciumsignaler i både apikale hår bundt og basal præsynaptiske plan indlede med udbruddet af stimulus (grå boks) og falde eksponentielt efter stimulus slutter. Under stimulus, calciumsignaler i hår bundter stige hurtigt og mætte Hvis styrken af indbøjningen ikke ændrer (figur 4A1-A1''). Derimod inden for delmængden af hårcellerne med påviselig calciumsignaler i synaptic flyet, calciumsignaler stiger mere gradvist og er mindre tilbøjelige til mætning (figur 4A2-A2''). I hårceller uden præsynaptiske calciumsignaler (grøn ROIs) forbliver calciumsignaler nær baseline.

Ud over disse grafiske repræsentationer (figur 4), kan calciumsignaler visualiseres rumligt inden for den hele neuromast tid i løbet af indspilningen. Et eksempel på en spatiotemporelle repræsentation er vist i figur 5 for præsynaptiske GCaMP6s signaler i basal flyet af en neuromast. I figur 5, er de vigtigste skridt til at behandle en billedsekvens til rumlig visualisering skitseret som beskrevet i trin 13. Først, de rå (F) GCaMP6s billeder er tidsligt arkiveret lodret [figur 5: række 1 (5 af de 14 placeringer er vist); trin 13.2.1]. Derefter, baseline billedet, beregnet fra før stimulus rammer (trin 13.2), trækkes fra (F) GCaMP6s fluorescens signaler til at opnå ΔF billeder (figur 5: række 2; trin 13.2.2). Næste, gråtonebilleder ΔF konverteres til en farve LUT (figur 5: række 3, Red Hot LUT; trin 13.3). Endelig, ΔF billeder med LUT konvertering er overlejret på de tidsligt binned (F) billeder (figur 5, første række) til at afsløre de spatiotemporelle signaler inden for neuromast under stimulation (figur 5: række 4; trin 13.4). Varme kort ΔF GCaMP6s signaler giver både værdifulde rumlige og tidsmæssige oplysninger, der ikke er let at parse ud fra enkelt ROIs og grafer i figur 4. Varme kort kan hjælpe med at visualisere kritiske spatiotemporelle oplysninger, herunder subcellulært oplysninger om indtræden og varighed af calciumsignaler inden for hvert hår celle samt timing og intensitet forskellene blandt hårceller inden for hele neuromast.

Det er vigtigt at kontrollere, at de grafer og rumlige varme kort repræsenterer sande calciumsignaler og er ikke artefakter som følge af bevægelse. I denne protokol, kan motion artefakter være et resultat af overdreven drift eller bevægelse af larve eller motion på grund af væske-jet stimulation. Alle disse artefakter er udfordrende for helt at eliminere i dette in vivo forberedelse. Mens registrering af billedsekvenser (trin 12.1.3) kan korrigere for skal størstedelen af bevægelse i x - og y-axes, billedsekvenser med overdreven bevægelse i z-aksen være identificeret og fjernet fra analyser. Motion artefakter er lettest at identificere ved graftegning calciumsignaler. Eksempler på GCaMP6s intensitet ændringer, der er artefakter ikke og sandt GCaMP6s signaler kan observeres på apex (fig. 4B1'-B1'') og base (figur 4C1'-C1'') af hårceller.

I de apikale hår bundter, motion artefakter er fælles, når væske-jet stimulus er for stærk (figur 3A3'' '). Under disse alt for stærke stimuli, apikale hår-pakken fly kan flytte ud af fokus under væske-jet stimulation og derefter vende tilbage til det oprindelige brændplanet efter stimulus ophører (figur 4B1'-B''). Dette gør det vanskeligt at præcist at måle apikale MET-afhængige calciumsignaler. Et eksempel på hår-bundle bevægelse artefakter kan ses i figur 4B1'-B1''. Her, grafer viser et fald i GCaMP6s signaler under stimulus (grå boks) når hår bundter er out-of-fokus. Efter stimulus slutter, øge GCaMP6s signalerne hurtigt som hår bundter vende tilbage til deres oprindelige holdning og komme tilbage i fokus. Dette er i kontrast med eksemplet i figur 4A1 «-A1'' hvor de apikale calciumsignaler øge ved starten af stimulus og mindske når stimulien slutter.

Mens bevægelsen på grund af overdreven væske-jet stimuli kan også flytte synaptic flyet ud af fokus, er denne type af motion artefakt mindre almindelige i denne plan. I stedet, ændringer i fokus i z-akse bevægelse eller drift af larve er de mest almindelige årsager til motion artefakter. Larve bevægelse eller drift kan påvirke GCaMP6s målinger på både apex og base af hårceller. I figur 4er vist et eksempel af larve bevægelse, der øger GCaMP6s i basal, synaptic flyet under stimulienC'-C''. Motion artefakter (figur 4C1'-C1'') kan skelnes fra sande præsynaptiske signaler (figur 4A2'-A2'') ved at undersøge tidsforløb af GCaMP6s signalerne. I stedet for at øge og mindske eksponentielt med stimulus (figur 4A2'-A2''), den motion-induceret stigning i GCaMP6s signal har en firkantet form og stiger og falder brat med debut og forskydningen af stimulus, henholdsvis () Figur 4 C1'-C1'').

Ud over omhyggelig undersøgelse naturligvis tid af GCaMP6s signaler, kan kontrol eksperimenter ved hjælp af farmakologi bruges til at skelne sande GCaMP6s signaler fra motion artefakter. For eksempel, kan BAPTA (trin 10) anvendes for at kløve tip-links, der er nødvendige for markedsøkonomisk behandling-kanals funktion i hår bundter. BAPTA skal fjerne både væske-jet-fremkaldte apikale MET-kanal-afhængige calcium tilstrømning samt den efterfølgende basal, præsynaptiske calcium tilstrømning gennem Cav1.3 kanaler. I den repræsentative eksempel på ægte stimulus-fremkaldte calciumsignaler (figur 4A1-A2'') under væske-jet stimulation, alle ændringer i GCaMP6s fluorescens i både de apikale og basal fly ville blive fjernet efter BAPTA behandling. Derimod ændres i GCaMP6s fluorescens på grund af motion som dem vist i tal 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1'' ville ikke blive elimineret af BAPTA behandling.

Ud over at bruge BAPTA til at fjerne alle stimulus-fremkaldte GCaMP6s signaler, der kan anvendes isradipine (trin 11) specifikt blokere Cav1.3-afhængige calcium tilstrømning i basal synaptic flyet mens apikale MET-kanal-afhængige calcium tilstrømning intakt5. Efter anvendelse af isradipine, i en individuel neuromast med ingen bevægelse artefakter, ændringer i GCaMP6s fluorescens i apikale hår bundter (figur 4A1 «-A1'') under væske-jet stimulation ville være uændret, mens alle synaptic GCaMP6s Fluorescens ændringer i bunden ville blive elimineret (figur 4A2'-A2''). Enhver ændring i GCaMP6s signal i synaptic flyet efter isradipine program (f.eks.,figur 4C1-C1'') ville højst sandsynligt svare til motion artefakter.

Figure 1
Figur 1 : Oversigt over en laterale-line neuromast og funktionel billeddannelse fly. (A) i diagrammet til venstre viser en side-visning af en neuromast med fire hår-celle organer (sort) at kontakte postsynaptiske afferente neuroner (blå). Bånd (grøn) tether vesikler på præsynaptiske aktive websteder inden for hver celle. Apikale til hver celle organ er et bundt af stereocilia (1 µm), der indeholder MET kanaler. Hvert hår bundt har en kinocilium, der overfører den mekaniske styrke af vand bevægelse til bunden af hår bundle. I diagrammet til højre viser den samme model i en oppefra. I denne top-down se, sort bruges til at angive de fire celler afbildet i diagrammet til venstre, og grå bruges til at angive andre celler i neuromast. Inden for denne model, og disse 2 visninger tre vigtige fly er fremhævet: (1) tips af hår bundter (kinocilia) bruges til at opgøre omfanget af hår-bundle afbøjning, (2) den apikale MET plane i bunden af hår bundter hvor calcium ind i cellen under stimulation, og (3) den synaptic plane i bunden af den celle, hvor calcium ind i nærheden af synaptic bånd. (B1-B1') DIC og GCaMP6s top-down billeder af markedsøkonomisk plane i bunden af hår bundter, hvor mechanosensation-afhængige calciumsignaler kan registreres. (B2-B2 ") DIC og GCaMP6s top-down billeder fra den samme neuromast som B1-B1', men i bunden af neuromast i synaptic flyet, hvor præsynaptiske calciumsignaler kan påvises. (C1-C2) Billeder af en neuromast udtrykker GCaMP6s hvor larverne er forkert monteret. I dette eksempel, er apikale MET fly (C1) og synaptic fly (C2) i bunden af cellen placeret på en ikke-optimal vinkel. Denne holdning ikke tillader alle hår bundter til afbildning i et enkelt fly, og mange flere billeddannelse fly er nødvendig for at fange aktivitet på alle synapser inden for denne neuromast i forhold til B1-B2 ". Billeder er af larver på 5 dpf. Skalalinjen i C2 svarer til alle billeder i B1-C2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Imaging kammer, zebrafisk montering og hjertet injektion procedurer og nåle. (A) vist er en billedbehandling kammer med en larve (skitseret af et stiplet rektangel) fastgjort til center på toppen af silikone encapsulant. (B1) Vist er en 5 dpf larve immobiliserede af to ben. En stor hoved pin er placeret vinkelret på kroppen lige posteriort for øjet. De to øjne er helt overlejret så bunden øjet er helt skjult af det øvre øje. En lille hale pin skærer notochord i halen. Larve er flad og ikke snoet. (B2) For at lamme larve, en hjerte injektion nål er orienteret vinkelret på kroppen og bragt støder op til hjertet. Hjertet injektion nålen skal kontakte pigment cellen foran hjertet. (B2 ") Depression af nålen ind i huden forårsager indrykningen af pigment cellen foran hjertet. (C) nåle i rækkefølge fra venstre mod højre: eksempel på en hjerte injektion nål med en åbning på ca 3 µm; eksempel på en god væske-jet nål med en åbning på ca. 50 µm; eksempel på et dårligt brudt væske-jet nål, som er store og takkede, og vil sandsynligvis producere overdreven og uregelmæssige stimuli. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Væske-jet justering, positionering og stimulus kalibrering. (A1) Vist er en larve orienteret med de hoved vendende mod venstre og hale til højre, og en væske-jet nål orienteret parallelt med A-P akse af zebrafisk kroppen. Denne væske-jet nål er justeret for at stimulere den neuromasts, der reagerer på forreste (push/pres) og posterior (pull/vakuum) instrueret væske-flow. (A2) Vist er en neuromast (beskrevet af stiplede hvid linje) og tips af apikale hår bundter (kinocilia) på venstre side panel og væske-jet nålen på højre side af panelet. Væske-jet er placeret cirka 100 µm fra kanten af neuromast. (A3-A3'' ') Skudspidserne af apikale hår bundter (kinocilia) er afrettet forskellige afstande af varierende væske-jet stimulus pres. Banen af en enkelt kinocilial tip er vist for 1,5 µm (A3') og 5 µm (A3'') afbøjning afstande. Den sorte cirkel angiver den hvilende placering af kinocilium. Det er vigtigt, at kinocilia ikke er afvige alt for langt, ellers stimulus intensitet ikke kan kvantificeres pålideligt og kan blive skadelig (A3'' '). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Apikale MØDTE og basal præsynaptiske GCaMP6s signaler under væske-jet stimulation i laterale-line hårceller. (A1-A2'') GCaMP6s intensitet ændringer i væske-jet stimulation i et repræsentativt neuromast. Billederne til venstre viser apikale MET fly (A1) og basal synaptic fly (A2) inden for den samme neuromast. ROIs farvekodede i A1 og A2 blev brugt til at afbilde tidsforløb (f) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til højre for hvert billede. (B1-B1'') Eksempel på en apikale MET billedsekvens med overskydende bevægelse under væske-jet stimulation. Billedet til venstre (B1) viser ROIs bruges til plot (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til højre. (C1-C1'') Eksempel på en billedsekvens i basal synaptic plan at viser bevægelse artefakter og GCaMP6s signalerer ændringer, ikke der rigtigt calcium signaler. Billedet til venstre (C1) viser ROIs bruges til plot (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til højre. Den grå boks i hver graf repræsenterer varigheden af væske-jet stimulus under hver enkelt billedsekvens. En 2-s 5 Hz væske-jet stimulus blev brugt for eksempel i A1-A2'' og B1-B1''. I C1-C1'', en 2 s forreste trin stimulus blev brugt. Y-aksen for (F) GCaMP6s grafer skildrer arbitrære enheder (A.U.) fremstillet af Fiji billede intensitet målinger. Alle eksempler er fra larver på 4-5 dpf. Skalalinjen = 5 µm af alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Spatiotemporelle visualisering af præsynaptiske GCaMP6s signaler under væske-jet stimulation. De skridt til at visualisere de spatiotemporelle ændringer i GCaMP6s intensitet i en neuromast under stimulus er skitseret. Tid er repræsenteret fra venstre til højre efter tidsstempel på toppen af billeder. Den øverste række viser 5 af 14 tidsmæssige placeringerne fra en 70-frame GCaMP6s (F) billedsekvens (trin 13.2.1). I den anden række, er baseline (trin 13.2) blevet fjernet fra hver (F) GCaMP6s binned billede til at skabe ΔF billeder (trin 13.2.2). I den tredje række, ΔF billeder er blevet konverteret fra gråtoner (anden række) til Red Hot LUT (trin 13.3). Min og Maks i disse LUT billeder indstilles efter Red Hot LUT zonekort relative ΔF intensitet (A.U.) til højre (trin 13.3.1). I den nederste række, er den tredje række overlejret på (F) billeder i den øverste række (trin 13.4). Den grå linje øverst i figuren angiver timingen af 2-s 5 Hz væske-jet stimulus. For eksempel er fra en 5 dpf larver. En legende af Red Hot LUT zonekort relative ΔF intensitet (A.U.) er vist til højre. Skalalinjen = 5 µm af alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

In vivo billeddannelse i intakte dyr er i sagens natur udfordrende. Flere trin i denne metode er afgørende for at indhente pålidelige i vivo målinger af calcium fra laterale-line hårceller. For eksempel, er det meget vigtigt, at larve er fastgjort og lammet ordentligt før imaging for at minimere bevægelse under imaging. Overskydende bevægelse under imaging kan føre til ændringer i GCaMP6s fluorescens, der er ikke rigtigt signaler og svarer ikke til ændringer i calcium niveauer (f.eks. tal 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1''). Hale pins kan placeres flere anteriorly til at hjælpe med at minimere bevægelse, selvom det kan gøre mere posterior neuromasts utilgængelige. Efter injektion af hjertet, kan der desuden drejes et hoved pins, således at den vandrette del af pin ligger på tværs af blommesækken. Ud over at ændre placeringen af pins, er det også muligt at bruge en hjerne-skive harpe i stedet for nåle til at immobilisere larver34. Når det placeres over larverne korrekt, er en harpe et supplerende, potentielt mindre invasiv metode til at immobilisere larver. Mens betydelig bevægelse kan skyldes utilstrækkelig fastgørelse, kan manglende korrekt udføre hjerte injektion for at levere α-bungarotoxin og lamme larver resultere i ufuldstændig lammelse, bevægelse, og i sidste ende bevægelse artefakter. Selv om anvendte anæstetika har vist sig at påvirke ophidselse af zebrafisk hårceller, har seneste arbejde vist, at den bedøvende benzocain ikke forstyrrer mange aspekter af hår-celle aktivitet. På samme måde, mere almindeligt anvendte bedøvelsesmiddel MS-222 kun griber ind i visse aspekter af hår-celle aktivitet15. Derfor, på grund af de udfordrende karakter af α-bungarotoxin injektion, benzocain eller MS-222 ansøgning kan vise sig for at være et nyttigt alternativ metode til lammelse at forhindre bevægelse i larve under funktionelle calcium imaging.

Ud over de tekniske udfordringer i denne protokol er selv en perfekt monteret prøve ubrugelige, hvis larve og hår celler ikke er sundt, før og under hver tænkelig eksperiment. For at sikre, at larver og hårceller er sundt, er det vigtigt, at larver er fastholdt i E3 buffer, der er fri for snavs som chorions (æggeskaller), affald og mikroorganismer. Selv om den overfladiske placering af laterale-line hårcellerne er fordelagtige for billedbehandling, denne beliggenhed gør dem mere sårbare over for cellulære skader når E3 buffer er forurenet. En ren, vandige miljø er særlig vigtigt for unge larver (2-4 dpf) eller mutanter, der ikke kan opretholde en opretstående svømning position og primært ligge på bunden af petriskålen. I disse situationer, kan laterale-line hårceller og beskyttende cupula omkring hår bundter nemt blive kompromitteret. Selv når du starter med sunde larver og hårceller, i løbet af hvert forsøg, er det afgørende at sikre, at larve har et hjerteslag og hurtige blodgennemstrømning. Hvis blodgennemstrømningen bremser eller stopper, kan blive kompromitteret af hårcellerne sundhed. I kompromitteret forberedelserne involverer usunde larver eller tab af blodgennemstrømningen, døende hårceller kan identificeres på flere måder: første, ved udseendet af karyopyknosis eller nukleare kondens, som manifesterer sig som en boble i cellen under DIC optik; for det andet af celle svind og forekomst af hurtigt flytte partikler i cytoplasmaet; og tredjedel, når kinocilia tips splay i forskellige retninger35. Når hår bundter er afbrudt, den spredte kinocilia ikke flytte fasthed sammen under stimulation.

Dette præparat har flere mindre begrænsninger, nemlig at præparatet kun forbliver robust for 1-3 timer efter det er etableret. Ændringer som ved hjælp af mindre stifter eller en hjerne-skive harpe til at immobilisere larver og tilføje en perfusion system kan forlænge levetiden for denne i vivo forberedelse. En anden begrænsning er, at photobleaching og fototoksicitet kan forekomme efter gentagen imaging forsøg. En spændende måde at overvinde denne udfordring er at tilpasse denne protokol til lys-ark mikroskopi. Lys-ark mikroskopi er en kraftfuld måde at reducere ud af fokus lys, hvilket fører til mindre photobleaching og fototoksicitet36. Sammen, kan blidere immobilisering og mindre foto-eksponering hjælpe forlænge hver tænkelig session. Længere imaging sessioner kan bruges til at undersøge den fulde varighed af funktionelle ændringer ledsager udvikling og processer underliggende hår-celle clearance og regeneration efter skade. Det er vigtigt at påpege, at, ud over lys-ark mikroskopi, denne protokol kan tilpasses andre typer Konfokal systemer (punkt-scanning, 2-foton og spinning disk) og relativt enkle widefield systemer28,34 . Samlet set gør sin alsidighed denne protokol et værdifuldt redskab, der kan tilpasses og bruges med flere Billeddannende systemer.

Mens denne protokol kan tilpasses og bruges med mange Billeddannende systemer, kan dele af denne protokol også tilpasses og anvendes (1) med andre indikatorer ud over GCaMP6s og (2) til billedet aktivitet i andre sensoriske celler og neuroner i larve zebrafisk. For eksempel, i en tidligere undersøgelse brugte vi denne protokol til billede aktivitet af flere genetisk kodet indikatorer inden for laterale-line hårceller til påvisning af cytosole calcium (RGECO1), vesikel fusion (SypHy), membran spænding (Bongwoori) og membran calcium (jRCaMP1a-caax og GCaMP6s-caax), og inden for laterale-line afferente processer til at opdage membran calcium (GCaMP6s-caax)5. Baseret på vores erfaring med at bruge disse indikatorer, tilbyder den transgene linje Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrevet i denne protokol en fremragende start for imaging aktivitet i laterale-line neuromasts. Af alle de indikatorer, der er anført ovenfor, har vi fundet, at GCaMP6s er den mest følsomme og photostable. Ud over disse funktioner, vi fremhæve Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene linje, fordi det kan bruges til at lave to forskellige målinger: hår-celle mechanosensation og præsynaptiske calcium inden for en enkelt transgene linje.

Den teknik, der er beskrevet i denne artikel viser, hvordan calcium imaging i sidelinjen zebrafisk kan være en kraftfuld metode til at studere, hvordan hårceller fungere i deres oprindelige miljø. Denne tilgang er et supplement til studier af pattedyr i hvilken hår-celle funktion er i øjeblikket undersøgt i ex vivo explants. Desuden kan zebrafisk model fortsat anvendes som en platform til at afprøve effekten af genetisk kodet indikatorer, der kan derefter anvendes til at undersøge aktivitet i pattedyrceller hår.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH/NIDCD murene forskning midler 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi vil gerne anerkende Candy Wong for hendes hjælp i at skrive makroen Fiji. Vi vil også gerne takke Doris Wu og Candy Wong for deres hjælpsomme forslag med protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Tags

Neurovidenskab sag 141 zebrafisk calcium imaging Konfokal imaging i vivo billeddannelse hårcellerne sensoriske neurovidenskab sidelinjen genetisk kodet indikatorer GCaMP
I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo… More

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter