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Neuroscience

Vivo में लार्वा Zebrafish में पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

zebrafish एक मॉडल प्रणाली है कि ऑप्टिकल स्पष्टता, तेजी से बाह्य विकास सहित कई मूल्यवान विशेषताएं है, और, विशेष महत्व की सुनवाई और संतुलन के क्षेत्र के लिए, बाह्य संवेदी बाल कोशिकाओं स्थित है । इस लेख रूपरेखा कैसे ट्रांसजेनिक zebrafish दोनों बाल-कोशिका mechanosensation और टोटो में presynaptic समारोह परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

संवेदी बालों की कोशिकाओं को भीतरी कान में पाया mechanoreceptors है कि सुनवाई और संतुलन के लिए आवश्यक हैं । बाल कोशिकाओं संवेदी उत्तेजनाओं कि यांत्रिक बाल बंडलों शिखर दखलंदाजी को ध्यान से हटाने के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं । विक्षेपन mechanotransduction खोलता है (मुलाकात) बालों के बंडलों में चैनल, cations की आमद के लिए अग्रणी, कैल्शियम सहित । यह कटियन आमद कोशिका का ध्रुवीकरण और वोल्टेज-gated कैल्शियम चैनल बाल कोशिका presynapse पर बेसल स्थित खोलता है । स्तनधारियों में, बालों की कोशिकाओं को हड्डी में डिब्बे में है, और यह कार्यात्मक vivo में इन गतिविधियों का आकलन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसके विपरीत, लार्वा zebrafish पारदर्शी और एक बाह्य स्थित पार्श्व लाइन अंग है कि बालों की कोशिकाओं को शामिल अधिकारी हैं । इन बालों की कोशिकाओं को कार्यात्मक और संरचनात्मक स्तनधारी बाल कोशिकाओं के समान है और कार्यात्मक vivo में मूल्यांकन किया जा सकता है । यह लेख एक तकनीक है कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECI), GCaMP6s, उत्तेजना-zebrafish पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए इस्तेमाल की रूपरेखा । GCaMP6s इस्तेमाल किया जा सकता है, फोकल इमेजिंग के साथ, vivo में उपाय करने के लिए शीर्ष और पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के आधार पर कैल्शियम संकेतों । इन संकेतों को एक वास्तविक समय प्रदान करते हैं, इन बालों की कोशिकाओं के भीतर दोनों mechanosensation-और presynapse निर्भर कैल्शियम की गतिविधियों की quantifiable readout । इन कैल्शियम संकेतों को भी महत्वपूर्ण कार्यात्मक कैसे बाल कोशिकाओं का पता लगाने और संवेदी उत्तेजनाओं संचारित के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । कुल मिलाकर, इस तकनीक vivo में कैल्शियम गतिविधि में रिश्तेदार परिवर्तन के बारे में उपयोगी डेटा उत्पंन करता है । यह कम अच्छी तरह से कैल्शियम परिवर्तन के निरपेक्ष परिमाण के ठहराव के लिए अनुकूल है । vivo तकनीक में यह गति कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है । उचित स्थिति, स्थिरीकरण और लार्वा की उत्तेजना के लिए उचित मात्रा में अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है । अंततः, जब ठीक से मार डाला, इस लेख में उल्लिखित प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तरीका अपने प्राकृतिक में बाल कोशिकाओं की गतिविधि के बारे में बहुमूल्य जानकारी एकत्र प्रदान करता है, एक जीवित जानवर के भीतर पूरी तरह से एकीकृत राज्यों ।

Introduction

कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है कि एक साथ कई कोशिकाओं की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है1. विशेष रूप से, कैल्शियम इमेजिंग आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) का उपयोग करने के लिए लाभप्रद होना दिखाया गया है क्योंकि GECIs विशिष्ट कोशिका प्रकार में व्यक्त किया जा सकता है और स्थानीय सेलुलर2। तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में, इन सुविधाओं कैल्शियम इमेजिंग बना दिया है GECIs एक शक्तिशाली विधि का उपयोग कर दोनों को परिभाषित करने के लिए ंयूरॉन नेटवर्क के भीतर गतिविधि पैटर्न और मापने के व्यक्तिगत synapses3,4पर कैल्शियम की आमद । इन सुविधाओं का लाभ उठाते हुए, एक ताजा अध्ययन फोकल माइक्रोस्कोपी और GECIs संवेदी बाल कोशिकाओं के संग्रह के भीतर उपसेलुलर गतिविधि की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया5.

बाल कोशिकाओं mechanoreceptors कि भीतरी कान और जलीय vetebrates6,7में पार्श्व लाइन प्रणाली में स्थानीय पानी के आंदोलन में ध्वनि और vestibular उत्तेजनाओं का पता लगाने हैं । बाल कोशिकाओं को अक्सर नुकसान या आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का लक्ष्य है कि sensorineural सुनवाई8,9के रूप में जाना जाता मनुष्यों में सुनवाई हानि का सबसे आम रूप में परिणाम कर रहे हैं । इसलिए, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि इन कोशिकाओं को कैसे इलाज और सुनवाई हानि को रोकने के क्रम में काम करते हैं । ठीक से कार्य करने के लिए, बाल कोशिकाओं mechanosensory नामक दो विशेष संरचनाओं का उपयोग-बाल बंडलों और synaptic रिबन का पता लगाने और उत्तेजनाओं संचारित, क्रमशः । बाल बंडलों बाल कोशिकाओं के शीर्ष पर स्थित है और कर रहे है मुख्य रूप से ठीक है, बाल stereocilia के रूप में जाना जाता है (चित्रा 1A) के रूप में दखलंदाजी की तरह । vestibular और पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं में, प्रत्येक बाल बंडल भी एक लंबी kinocilium है (है सेल केवल सच पपनी), जो अभी तक stereocilia (चित्रा 1a) से ऊपर का विस्तार कर सकते हैं । Mechanosensory उत्तेजनाओं बालों के बंडलों से ध्यान हटाने, और झुकाव "टिप-लिंक" कहा जाता है कि10stereocilia आपस में संपर्क पर तनाव डालता है । यह तनाव stereocilia में स्थित mechanotransduction (MET) चैनल खोलता है, जिसके परिणामस्वरूप cations की एक शिखर आमद हुई, जिसमें कैल्शियम11,12शामिल है । इस शिखर गतिविधि अंततः बाल कोशिका ध्रुवीकरण और कोशिका के आधार पर वोल्टेज-gated कैल्शियम चैनल (सीएv१.३) खोलता है. Cav१.३ चैनल synaptic रिबन, एक presynaptic संरचना है कि सक्रिय क्षेत्रों में बुलबुले tethers के आसंन पाया जाता है । सीएv१.३ चैनलों के माध्यम से बेसल कैल्शियम की आमद पुटिका फ्यूजन, neurotransmission, और afferent ंयूरॉंस13,14के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है ।

कई वर्षों के लिए, electrophysiological तकनीक जैसे पूरे सेल पैच clamping zebrafish15,16,17 सहित कई प्रजातियों में बाल कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 18,19,20. इन electrophysiological रिकॉर्डिंग सुनवाई और शेष क्षेत्रों में विशेष रूप से मूल्यवान है क्योंकि वे व्यक्तिगत संवेदी कोशिकाओं से अत्यंत संवेदनशील माप प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसका उद्देश्य एक पर अत्यंत तेज उत्तेजनाओं सांकेतिक शब्दों में बदलना है आवृत्तियों और तीव्रता21,22की वाइड रेंज । दुर्भाग्य से, पूरे सेल रिकॉर्डिंग बाल कोशिकाओं की आबादी की गतिविधि को मापने नहीं कर सकते । zebrafish पार्श्व लाइन में कोशिकाओं की आबादी की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए, microphonic क्षमता और afferent कार्रवाई संभावितों के लिए संक्षेप mechanosensitive और postsynaptic प्रतिक्रिया गुणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है व्यक्तिगत neuromasts23 ,24. दुर्भाग्य से, न तो पूरे सेल रिकॉर्डिंग और न ही स्थानीय क्षेत्र संभावित माप स्थानिक संकल्प को तुच्छ जहां गतिविधि व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर हो रही है या एक जनसंख्या के भीतर प्रत्येक कोशिका की गतिविधि को मापने के लिए है । हाल ही में, कैल्शियम रंजक और GECIs इन चुनौतियों बाईपास करने के लिए नियोजित किया गया है25,26.

zebrafish में, GECIs बाल कोशिका ट्रांसजेनिक zebrafish और27लार्वा की ऑप्टिकल स्पष्टता बनाने के रिश्तेदार आसानी के कारण समारोह की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण साबित किया है । zebrafish लार्वा में बाल कोशिकाएँ भीतरी कान के साथ-साथ पार्श्व-रेखा प्रणाली में विद्यमान होती हैं. पार्श्व रेखा से बना है rosette बाल कोशिकाओं के समूहों की तरह neuromasts कहा जाता है कि जल आंदोलन में स्थानीय परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 1) । पार्श्व पंक्ति विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि यह बाहरी रूप से मछली की सतह के साथ स्थित है । यह पहुँच बाल कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए संभव बना दिया है और कैल्शियम संकेतों बरकरार लार्वा में ऑप्टिकली उपाय. कुल मिलाकर, transgenesis की आसानी, लार्वा की पारदर्शिता, और पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के अद्वितीय उपयोग zebrafish एक अमूल्य मॉडल को vivo में बाल कोशिकाओं की गतिविधि का अध्ययन किया है । स्तनधारी सिस्टम की तुलना में यह एक महत्वपूर्ण लाभ है जिसमें बालों की कोशिकाएं भीतरी कान की बोनी संरचनाओं से घिरी होती हैं । प्रवेश के इस कमी यह बहुत स्तनधारी बाल कोशिकाओं के vivo माप में कार्यात्मक प्राप्त मुश्किल बना दिया है ।

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे मुलाकात की निगरानी करने के लिए चैनल-और presynapse-निर्भर में कैल्शियम में परिवर्तन व्यक्तिगत बाल कोशिकाओं के भीतर और कोशिकाओं के बीच में neuromasts भीतर लार्वा zebrafish. यह प्रोटोकॉल एक स्थापित ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन है कि बाल कोशिका विशिष्ट myosin6b प्रवर्तक28के नियंत्रण में एक झिल्ली-स्थानीयकृत GCaMP6s व्यक्त करता है का इस्तेमाल । इस झिल्ली स्थानीयकरण स्थिति बाल कोशिका समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्लाज्मा झिल्ली में स्थित आयन चैनलों के माध्यम से कैल्शियम की आमद का पता लगाने के लिए GCaMP6s. उदाहरण के लिए, झिल्ली-स्थानीयकृत GCaMP6s शिखर बालों के बंडलों में मिले चैनलों के माध्यम से और सेल के आधार पर synaptic रिबन के पास सीएV१.३ चैनलों के माध्यम से कैल्शियम की आमद का पता लगा सकते हैं । इस cytosol में स्थानीयकृत GECIs का उपयोग कर के साथ विरोधाभासों, के रूप में cytosolic GECIs कैल्शियम संकेतों का पता लगाने कि मिले और CaV१.३ चैनल गतिविधि के साथ ही अन्य स्रोतों से कैल्शियम का योगदान का एक संयोजन कर रहे हैं (जैसे, स्टोर रिलीज). यह प्रोटोकॉल कैसे स्थिर और पंगु बना GCaMP6s ट्रांसजेनिक लार्वा इमेजिंग करने से पहले रूपरेखा । यह तो एक नियंत्रित और reproducible तरीके से पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए बाल बंडलों को ध्यान में रखना कैसे तैयार करने और एक द्रव जेट का उपयोग करने के लिए वर्णन करता है । प्रतिनिधि डेटा है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता प्रस्तुत कर रहे हैं । आंदोलन कलाकृतियों का प्रतिनिधित्व करने वाले डेटा के उदाहरण भी प्रस्तुत किए गए हैं । परिणाम सत्यापित करने और कलाकृतियां बहिष्कृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नियंत्रण प्रयोग बताए गए हैं । अंत में, एक विधि फिजी सॉफ्टवेयर में स्थानिक कैल्शियम संकेतों कल्पना करने के लिए वर्णित है । इस फिजी विश्लेषण पहले से स्थापित दृश्य MATLAB5का उपयोग कर विकसित तरीकों से अनुकूलित है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तैयारी तकनीक है कि लार्वा zebrafish में GECIs का उपयोग करता है को मापने और vivo में बाल कोशिका कैल्शियम गतिशीलता कल्पना रूपरेखा ।

Protocol

पशु अध्ययन प्रोटोकाल #1362-13 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों में पशु उपयोग समिति द्वारा सभी पशु कार्य स्वीकृत किए गए ।

नोट: यह प्रोटोकॉल लगभग ०.५ करने के लिए 1 h लेता है कोई व्यवधान के साथ पूरा करने के लिए यदि समाधान और उपकरण तैयार है और अग्रिम में सेट । इस प्रोटोकॉल टीजी (myo6b: GCaMP6s-caax)5,29 zebrafish लार्वा के लिए 3-7 दिनों के बाद निषेचन (dpf) के लिए अनुकूलित है । यह ट्रांसजेनिक लाइन सभी zebrafish बालों की कोशिकाओं में एक झिल्ली स्थानीयकृत GCaMP6s (zebrafish codon-अनुकूलित) विशेष रूप से व्यक्त करता है । इमेजिंग करने से पहले, लार्वा मानक शर्तों के तहत भ्रूण बफर (E3) में उठाया जाता है । सभी उपकरणों और इस प्रोटोकॉल को अंजाम देने के लिए आवश्यक दवाओं की सूची संख्या के लिए सामग्री की तालिका को देखें ।

1. समाधान की तैयारी

  1. α-bungarotoxin (१२५ µ m) की 1 मिलीलीटर तैयार करें, जो कार्यात्मक इमेजिंग के दौरान zebrafish लार्वा को पंगु बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    1. जोड़ें ९६८.६ µ ultrapure बाँझ पानी और ३३.४ µ l के एल phenol लाल के लिए 1 मिलीग्राम के α-bungarotoxin (पूरी बोतल). १०० µ l aliquots बनाएं और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
      सावधानी: दस्ताने पहनें और α-bungarotoxin पाउडर संभालते समय हुड में तैयारी करें । दस्ताने भी जब α-bungarotoxin समाधान से निपटने की सिफारिश कर रहे हैं ।
  2. 60x भ्रूण बफर (E3) के 1 एल तैयार करें ।
    1. KCl पाउडर के NaCl और ०.७६ ग्राम के १७.२ ग्राम को ultrapure पानी के ९५४.४ मिलीलीटर में डालें ।
    2. 1 मीटर CaCl के2, १९.८ मिलीलीटर के 1 मीटर MgSO4, और समाधान के लिए 1 मीटर HEPES बफर के 6 मिलीलीटर जोड़ें । 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 60x E3 स्टॉक समाधान की दुकान ।
  3. 1x E3 के 10 एल तैयार (5 मिमी NaCl; ०.१७ मिमी KCl; ०.३३ मिमी CaCl2; ०.३३ मिमी MgSO4, पीएच ७.२), जो एक समाधान है कि लार्वा कार्यात्मक इमेजिंग करने से पहले में प्रचारित किया जाता है.
    1. जोड़ें १६७ 60x E3 स्टॉक समाधान के 10 एल के लिए ultrapure पानी की एक 1x e3 समाधान करने के लिए । 6 महीने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 1x E3 समाधान की दुकान ।
  4. न्यूरॉन बफर (नायब) तैयार (१४० मिमी NaCl; 2 मिमी KCl; 2 मिमी CaCl2; 1 मिमी MgCl2; 10 मिमी HEPES बफर, पीएच ७.३), जो कार्यात्मक इमेजिंग के दौरान लार्वा विसर्जित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    नोट: 1x E3 भी कार्यात्मक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रतिक्रियाओं और अधिक मजबूत और विश्वसनीय नायब में हैं ।
    1. गठबंधन के 28 मिलीलीटर की 5 एम NaCl, 2 मिलीलीटर की 1 m KCl, 2 मिलीलीटर की 1 m CaCl2, 1 एम MgCl2की मिलीलीटर, और 1 मीटर HEPES बफ़र के 10 मिलीलीटर ultrapure पानी की मिलीलीटर ९५७ एमएल के साथ । 1 मीटर NaOH के साथ ७.३ के लिए पीएच लाओ ।
    2. फ़िल्टर निष्फल । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: समाधान का उपयोग करने से पहले RT पर लाएं.
  5. MS-२२२ शेयर (tricaine, ०.४%), जो लार्वा anesthetize करने के लिए उपयोग किया जाता है तैयार करें ।
    1. भंग ४०० एथिल 3 के मिलीग्राम-aminobenzoate methanesulfonate नमक और एनए2HPO4 की ८०० मिलीग्राम १०० मिलीलीटर में आसुत जल । 7 करने के लिए पीएच समायोजित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. स्थिरीकरण और α-bungarotoxin इंजेक्शन के दौरान anesthetize लार्वा के लिए ०.०४% MS-२२२ का उपयोग करें ।

2. इमेजिंग चैंबर और पिंस की तैयारी

  1. इमेजिंग चैंबर तैयार (चित्रा 2ए) । वर्ग है जो coverslip पालन करेंगे के किनारों के साथ छिड़काव चैंबर के नीचे करने के लिए उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल की एक पतली परत लागू करें । चर्बी में अंतराल न छोड़ें । मजबूती से coverslip के किनारों के चारों ओर नीचे प्रेस करने के लिए यह इमेजिंग चैंबर को सील । अतिरिक्त चर्बी दूर पोंछ ।
    नोट: एक २०० µ एल micropipette टिप के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज तेल आवेदन के लिए सिफारिश की है ।
  2. चैंबर को भरने के लिए सिलिकॉन encapsulant तैयार करें । मिश्रण एक 10:1 अनुपात (वजन से) एजेंट के इलाज के आधार के लिए । मिश्रण अच्छी तरह से लेकिन धीरे, एक micropipette टिप का उपयोग करने के लिए ंयूनतम बुलबुले बनाएं ।
    1. चिपका coverslip पर सिलिकॉन encapsulant डालो इतना है कि यह चैंबर की सतह के साथ स्तर है । लगभग 3 गाम के encapsulant को चैंबर भरना होगा ।
    2. ध्यान से एक सपाट सतह के खिलाफ चैंबर नल जबकि यह क्षैतिज रखते हुए, या एक micropipette टिप का उपयोग करें (एक stereomicroscope के तहत) को हटाने या चैंबर के किनारे पर बुलबुले खींचने के लिए ।
    3. 60-70 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक प्रयोगशाला ओवन में चैंबर प्लेस । एक हवादार बॉक्स के अंदर चैंबर जगह सुनिश्चित करने के लिए कि गर्म हवा सीधे encapsulant पर उड़ाने के लिए लहर बनाने से बचने नहीं है ।
  3. फैशन के लिए ठीक संदंश और टंगस्टन तार का उपयोग करें पिन कठोर encapsulant पर सिर और पूंछ (चित्रा 2B1) के माध्यम से लार्वा स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया ।
    1. सिर पिन बनाने के लिए, एक हाथ में एक stereomicroscope के तहत ०.०३५ mm टंगस्टन तार का एक टुकड़ा पकड़ । दूसरे हाथ में ठीक संदंश का प्रयोग, ९० ° पर अंत से तार 1 मिमी मोड़ । संदंश ठीक कैंची के लिए विनिमय और पिन बनाने के लिए मोड़ के बाद 1 मिमी काटा.
    2. पूंछ पिन बनाने के लिए एक ०.०२५ mm तार का उपयोग कर चरण 2.3.1 दोहराएँ, लेकिन मोड़ के दोनों ओर तार के ०.५ मिमी छोड़ दें. कक्ष (संग्रहण के लिए) पर कठोर encapsulant में पिन डालने के लिए संदंश का उपयोग करें ।

3. पक्षाघात और उत्तेजना के लिए सुई की तैयारी

  1. दिल इंजेक्शन सुई एक रेशा के साथ कांच केशिकाओं का उपयोग कर तैयार करें । 1 के एक भीतरी टिप व्यास-3 µm (चित्रा 2सी) के लिए सुई खींचो ।
  2. एक रेशा के बिना कांच केशिकाओं का उपयोग कर द्रव-जेट सुई तैयार करें । एक पतली, लंबी टिप है कि सही टिप व्यास को तोड़ा जा सकता है के साथ सुई खींचो ।
    1. बंद पतले, द्रव की लंबी टिप-जेट सुई इसे सीधा एक और द्रव के खिलाफ-जेट सुई या एक सिरेमिक टाइल बस के ऊपर जहां सुई टिप के लिए 30 की एक आंतरिक टिप व्यास बनाने के लिए तुला हो सकता है-50 µm [चित्रा 2सी (मध्य छवि) और चित्रा 3 A2] । सुनिश्चित करें कि तोड़ भी टिप भर में है (चित्रा 2सी, मध्य छवि) और नहीं दांतेदार या बहुत बड़ी (चित्रा 2सी, सही छवि) बाल कोशिका उत्तेजना के दौरान भी और सही द्रव प्रवाह की गारंटी है ।
      नोट: एक सुई पालिशगर फूटे टूटता को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

4. लगाए और इमेजिंग चैंबर के लिए लार्वा स्थिर

  1. स्नान एक टीजी (myo6b: GCaMP6s-caax) के लगभग 1 मिलीलीटर में लार्वा ०.०४% MS-२२२ युक्त के लिए 1 – 2 इमेजिंग चैंबर के सिलिकॉन encapsulant सतह पर मिनट जब तक लार्वा या स्पर्श करने के लिए अप्रतिसादी हो जाती है ।
    1. एक stereomicroscope के तहत, छिड़काव चैंबर के केंद्र में लार्वा की स्थिति तो यह सिलिकॉन encapsulant के खिलाफ अपने पक्ष में फ्लैट है ।
      नोट: स्थिरता के लिए, हमेशा एक ही पक्ष पर लार्वा माउंट (जैसे, दाईं ओर नीचे, बाईं ओर) (चित्रा 2B1) ।
  2. ठीक संदंश का प्रयोग, एक ०.०३५ mm सिर पिन नीचे सीधा लार्वा और चैंबर के लिए ले आओ । आंख और भड़काऊ और पुटिका और encapsulant (आंकड़े 2B1 और 2B2) में नीचे के बीच सिर पिन डालें । संदंश के एक दूसरे सेट का उपयोग करने के लिए अपने पृष्ठीय या ventral पक्ष के साथ लार्वा को स्थिर जबकि पिन । सुनिश्चित करें कि पिन के क्षैतिज भाग लार्वा संपर्क करता है और encapsulant में सभी तरह से प्रेस नहीं है । कोण पिन ventrally (चित्रा 2बी 1) या मछली के पूर्वकाल की ओर थोड़ा इशारा बाद दिल इंजेक्शन और हेयर सेल इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए ।
    1. संदंश का प्रयोग, notochord में एक ०.०२५ mm पूंछ पिन डालने के रूप में बंद के रूप में पूंछ के अंत करने के लिए संभव के रूप में (चित्रा 2B1) ।
      नोट: लार्वा को खींचने से बचने के लिए सावधान रहें । लार्वा फ्लैट पिन । आंखें आरोपित (चित्रा 2B1) होना चाहिए । यह दिल इंजेक्शन की आसानी के लिए बहुत महत्वपूर्ण है (चित्रा 2b2-b2, चरण 5), एक वांछनीय इमेजिंग विमान (चित्रा 1B1-बी 2 ' ', कदम 8 और 9) की सुविधा, और द्रव की तीव्रता बढ़ाता-जेट उत्तेजना ( चित्रा 3A3, चरण 7) ।

5. α के इंजेक्शन-हृदय गुहा में Bungarotoxin लार्वा पंगु बना

नोट: α-bungarotoxin संभालते समय दस्ताने पहनें ।

  1. α-bungarotoxin aliquot संक्षेप में दिल इंजेक्शन सुई की कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए उपयोग करने से पहले केंद्रापसारक ।
    1. एक दिल इंजेक्शन सुई में α-bungarotoxin समाधान के 3 µ एल Backfill एक जेल लोड हो रहा है पिपेट टिप का उपयोग कर । समाधान समान रूप से कोई बुलबुले के साथ टिप करने के लिए लोड ।
    2. एक मैनुअल micromanipulator से जुड़ी एक पिपेट धारक में दिल इंजेक्शन सुई डालें । एक stereomicroscope के तहत, सुई की स्थिति तो यह पिन किए गए और anesthetized लार्वा के एक-पी धुरी के लिए सीधा गठबंधन है, ~ 30 डिग्री के एक कोण पर नीचे की ओर इशारा करते ।
    3. पिपेट धारक को प्रेशर इंजेक्टर से कनेक्ट करें । निंन सुझाई गई सेटिंग्स लागू करें: Pinjection = १०० hPa, tinjection = ०.५ s, and Pcompensation = 5 hPa । सुई टिप पेटेंट है कि क्या परीक्षण करने के लिए समाधान में एक बोल्स सुई.
    4. लाल समाधान का एक छोटा सा कश के लिए देखो (phenol लाल से) को सुई की नोक छोड़ दें । यदि कोई लाल रंग देखा है, बहुत धीरे से एक पिन के किनारे के खिलाफ सुई टिप परिमार्जन और फिर कोशिश जब तक सुई पेटेंट है । वैकल्पिक रूप से, एक बड़ा टिप खोलने के साथ एक सुई खींचो ।
  2. दिल की ओर सुई अग्रिम जब तक यह दिल के बाहर त्वचा को छूता है (चित्रा 2B2) । लार्वा में सुई दबाएँ और दिल के सामने त्वचा पर वर्णक कोशिका के इंडेंट के लिए देखो कि सुई सही लार्वा के सापेक्ष विमान में तैनात है सुनिश्चित करने के लिए (चित्रा 2B2 ').
    1. आगे सुई अग्रिम जब तक यह त्वचा छेदने और हृदय गुहा में प्रवेश करती है । सुई थोड़ा वापस खींचो । दिल की गुहा में α-bungarotoxin के एक बोल्स इंजेक्षन । हृदय गुहा की मुद्रास्फीति के लिए देखो या गुहा में प्रवेश लाल डाई के लिए ।
  3. अवशिष्ट MS-२२२ को दूर करने के लिए 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार लार्वा कुल्ला करें । कभी भी सभी द्रव को निकाल दें । छिड़काव चैंबर पर नायब के लगभग 1 मिलीलीटर में लार्वा बनाए रखें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि लार्वा दिल की धड़कन और रक्त प्रवाह लगाए और दिल इंजेक्शन के बाद मजबूत और पूरे इमेजिंग प्रयोग भर में रहते हैं ।

6. माइक्रोस्कोप और द्रव की तैयारी-जेट सेटअप

  1. सामग्री की तालिकामें वर्णित घटकों का उपयोग कर एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप इकट्ठा: एक ४८८ एनएम लेजर और उचित फिल्टर, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर नियंत्रण और इमेजिंग और उत्तेजना, 10x हवा समंवय के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप उद्देश्य, 60x पानी उद्देश्य, पीजो-z उद्देश्य स्कैनर (जेड के लिए ढेर), उच्च गति कैमरा, परिपत्र चैंबर अनुकूलक, मोटर चालित चरण, और चरण सम्मिलित एडेप्टर. अतिरिक्त विकल्प और माइक्रोस्कोप setups पर मार्गदर्शन के लिए झांग एट अल.29 का उल्लेख ।
  2. तरल पदार्थ जेट इकट्ठा 3 मुख्य घटकों से बना: एक वैक्यूम और दबाव पंप, उच्च गति दबाव दबाना, और सिर मंच (भी सामग्री की तालिका में वर्णित) । समय और सिर मंच से बाहर दबाव या वैक्यूम निर्वहन की अवधि को नियंत्रित करने के लिए और द्रव-जेट पिपेट में उच्च गति दबाव दबाना का प्रयोग करें ।
    1. मोटी घिरी सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से तरल पदार्थ-जेट पिपेट धारक के लिए सिर मंच के उत्पादन से कनेक्ट करें ।

7. लार्वा और द्रव का संरेखण-जेट

नोट: प्रत्येक neuromast के भीतर ब्याज के 3 विमानों रहे हैं: (1) बाल बंडलों की युक्तियाँ (चित्रा 3A3: kinocilia, उत्तेजना तीव्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया); (2) बाल-बंडल मिले विमान (चित्रा 1b1-b1 ': शिखर बाल बंडलों के आधार जहां मिले-चैनल पर निर्भर कैल्शियम संकेतों का पता लगाया है); और (3) synaptic विमान (चित्रा 1b2-b2 ': बाल कोशिका के आधार पर जहां presynaptic कैल्शियम संकेतों का पता लगाया जाता है) । ये विमान चित्रा 1एमें उल्लिखित हैं ।

  1. Backfill 10 एक ठीक से टूट द्रव में एनबी के µ एल-जेट सुई (३.२ कदम से) एक जेल लोड हो रहा है टिप का उपयोग कर । समाधान समान रूप से कोई बुलबुले के साथ टिप करने के लिए लोड । पिपेट मोटर चालित micromanipulator से जुड़ी धारक में सुई डालें.
  2. माइक्रोस्कोप मंच पर एक परिपत्र चैंबर एडाप्टर में छिड़काव चैंबर प्लेस ।
    नोट: स्थिरता के लिए, हमेशा एक ही अभिविन्यास में लार्वा की स्थिति (जैसे, द्रव जेट और ventral ओर का सामना करना पड़ पक्ष की ओर इसके पीछे के साथ लार्वा युक्त चैंबर).
    1. मोटर चालित चरण ताकि लार्वा देखने के क्षेत्र के केंद्र में है ले जाएँ । गोलाकार कक्ष एडेप्टर को चालू करें ताकि लार्वा की A-P अक्ष मोटे तौर पर द्रव-जेट सुई की गति के साथ संरेखित हो ।
    2. संचारित प्रकाश और विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) का उपयोग करना, लार्वा को ध्यान में लाएं और इसे 10x उद्देश्य के अंतर्गत केंद्र करें । 10x उद्देश्य बढ़ाएं ।
  3. मोटर micromanipulator का उपयोग करना, देखने के क्षेत्र के केंद्र में द्रव-जेट सुई नीचे लाने के लिए तो यह संचारित प्रकाश से प्रबुद्ध है और बमुश्किल एनबी समाधान छू रहा है ।
    1. कम 10x उद्देश्य । अपने स्थान की पुष्टि करने के लिए लार्वा पर ध्यान दें । द्रव-जेट सुई खोजने के लिए ऊपर ध्यान दें । x-और y-अक्षों में micromanipulator के साथ द्रव-जेट सुई ले जाएं जब तक यह मछली के पृष्ठीय पक्ष के समानांतर स्थिति में है ।
    2. लार्वा पर वापस ध्यान दें । z-अक्ष में सुई नीचे लाओ । मछली के पृष्ठीय पक्ष के साथ सुई की स्थिति और ~ 1 मिमी शरीर से दूर (चित्रा 3A1).
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि द्रव-जेट सुई लार्वा (चित्रा 3A1) के एक-P midline के साथ संरेखित है (यदि आवश्यक हो) परिपत्र चैंबर एडेप्टर को सावधानी से ले जाएँ ।
    4. मोटर चालित चरण को देखने के क्षेत्र के केंद्र में ब्याज की neuromast जगह ले जाएँ. मछली के पृष्ठीय पक्ष के साथ तरल पदार्थ-जेट सुई टिप रखें । लार्वा या चैंबर की सतह के लिए तरल पदार्थ-जेट सुई की नोक को छूने मत करो ।
  4. 60x पानी उद्देश्य के लिए स्विच । सुनिश्चित करें कि उद्देश्य नायब समाधान में डूबे हुए हैं । एक neuromast का उपयोग करने के लिए ठीक फोकस का उपयोग करें संचारित प्रकाश और उद्योग प्रकाशिकी ।
    नोट: इस सेटअप प्राथमिक पीछे पार्श्व रेखा के साथ neuromasts को उत्तेजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इन neuromasts के भीतर बाल कोशिकाओं या तो पूर्वकाल या पीछे द्रव प्रवाह निर्देशित करने के लिए प्रतिक्रिया । पार्श्व लाइन प्रणाली के भीतर neuromast द्रव संवेदनशीलता का एक सटीक नक्शा के लिए चाऊ एट अल.31 देखें ।
    1. micromanipulator के साथ द्रव-जेट सुई की स्थिति है कि यह neuromast के बाहरी छोर से १०० µm है (चित्रा 3A2) ।
      नोट: neuromasts चुनें जो पक्ष-angled दृश्यों (चित्र 1c1-c2) के बजाय स्पष्ट टॉप-डाउन दृश्य (आंकड़े 1B1'-B2 ' और आरेख 3A3) ऑफ़र करते हैं । एक स्पष्ट ऊपर से नीचे देखने के लिए एक एकल ऑप्टिकल विमान या कम ऑप्टिकल विमानों (चित्रा 3A3) में synaptic क्षेत्रों की इमेजिंग में सभी शिखर बाल बंडलों के एक साथ इमेजिंग के लिए अनुमति देता है ।
    2. शिखर हेयर-बंडल्स (kinocilia) (figure 1A, आंकड़े 3A2 और 3A3) के सुझावों तक फोकस करें । द्रव के नीचे-जेट सुई इस विमान में ध्यान में होना चाहिए ।
  5. इमेजिंग सॉफ्टवेयर से इनपुट प्राप्त करने के लिए बाहरी मोड के लिए मैनुअल से उच्च गति दबाव दबाना सेट करें ।
    1. शूंय "शूंय" बटन दबाकर उच्च गति दबाव दबाना । आराम दबाव थोड़ा सकारात्मक सेट करने के लिए सेट बिंदु घुंडी का प्रयोग करें (~ 2 mmHg). सिर मंच उत्पादन से जुड़ी एक साई manometer का उपयोग कर उच्च गति दबाव दबाना के आराम उत्पादन की पुष्टि करें ।
      नोट: समय के साथ तरल पदार्थ जेट सुई में तरल पदार्थ के क्रमिक रूप से बचने के लिए आराम से थोड़ा सकारात्मक दबाव सेट करें । यदि द्रव द्रव-जेट से जुड़े टयूबिंग में प्रवेश करती है और सिर मंच तक पहुंचता है, यह उपकरणों को नुकसान पहुंचा सकता है ।
    2. बालों के बंडलों को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक दबाव का निर्धारण । 200 के लिए एक ०.१२५ और ०.२५ V इनपुट (६.२५ और १२.५ mmHg) का प्रयोग करें-500 ms एक परीक्षण उत्तेजना लागू करने के लिए (चित्रा 3a3-a3 ' ') ।
      नोट: उच्च गति दबाव दबाना एक वोल्टेज इनपुट धर्मांतरित (सॉफ्टवेयर या अंय उपकरणों है कि उच्च गति दबाव दबाना कमान बंदरगाह पर BNC बंदरगाह से कनेक्ट) दबाव में है कि सिर मंच से छुट्टी दे दी है, और अंत में, द्रव-जेट सुई (१.० V = ५० mmHg, जबकि-१.० V =-५० mmHg) । इस विंयास में (७.२ कदम देखें) सकारात्मक दबाव (धक्का) पूर्वकाल की ओर बाल बंडलों को विक्षेपित करना, और नकारात्मक दबाव (पुल) पीछे की ओर बाल बंडलों को विक्षेपित ।
    3. एक पैमाने पर पट्टी के साथ-साथ संचारित प्रकाश और उद्योग प्रकाशिकी का प्रयोग, ६.२५ और बाल बंडलों के सुझावों की १२.५ mmHg उत्तेजनाओं से विक्षेपन की दूरी को मापने, kinocilia (चित्रा 1ए और आंकड़े 3A3-3 ' ') । एक दबाव है कि बंडलों चालें चुनें (1 एकजुट इकाई के रूप में) लगभग 5 µm की दूरी (चित्रा 3A3 ' ') । सुनिश्चित करें कि kinocilia के सुझावों को ध्यान में पूरे समय रहते हैं ।
    4. kinocilia 5 µm के सुझावों को ध्यान हटाने वाली दूरी और दबाव को खोजने के लिए लार्वा की एक-पी अक्ष के साथ द्रव-जेट ± 25 µm ले जाएँ ।
      नोट: लार्वा में GCaMP6s का प्रयोग 3 – 7 dpf, एक 5 µm विक्षेपन संतृप्त GCaMP6s कैल्शियम संकेतों के पास प्राप्त करना चाहिए और शिखर बाल-बंडल संरचनाओं (चित्रा 3A3 ' ') को नुकसान नहीं होना चाहिए. छोटे विस्थापन दूरी गैर संतृप्त उत्तेजनाओं (चित्रा 3A3 ') देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विस्थापन दूरी > 10 µm ( चित्रा 3A3 '') का अनुमान लगाना कठिन है और समय के साथ हानिकारक हो सकता है । संकेत संतृप्ति neuromast (और kinocilial ऊंचाई) के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल किया संकेतक की उम्र पर निर्भर है । प्रत्येक दिशा (दबाव/पुश और वैक्यूम/इमेजिंग के दौरान) समय पर तरल पदार्थ की प्रत्यक्षता-जेट सुई की जांच करें । द्रव-जेट सुइयों आसानी से रोकना और वैक्यूम प्रत्यक्षता खो देते हैं, लेकिन वे अवशिष्ट दबाव प्रत्यक्षता बनाए रखने । हर दिशा में एक लघु परीक्षण उत्तेजना और तरल पदार्थ के लिए जांच करने के लिए-जेट प्रत्यक्षता का उपयोग करें ।
    5. ब्याज के विमान में नमूना फोकस (उदाहरण के लिए, शिखर बाल बंडलों के आधार या synaptic विमान में बाल कोशिका के आधार; चित्रा 1 B1-B2 ') ।

8. इमेजिंग अधिग्रहण प्रक्रिया विकल्प 1: एकल विमान अधिग्रहण

नोट: इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी इमेजिंग RT पर किया जाता है ।

  1. सेट इमेजिंग सॉफ्टवेयर एक पर कब्जा के साथ एक स्ट्रीमिंग या सतत ८०-फ्रेम अधिग्रहण प्राप्त करने के लिए हर १०० ms 10 हर्ट्ज के एक फ्रेम दर को प्राप्त करने के लिए.
  2. सेट लाभ, एपर्चर, और लेजर शक्ति संकेत का पता लगाने का अनुकूलन करने के लिए, लेकिन संतृप्ति, photobleaching, और शोर से बचें. एक Opterra/SFC के लिए उदाहरण सेटिंग्स निंनानुसार हैं: ४८८ एनएम लेजर पावर: ५० (बाल बंडल मिले विमान), ७५ (synaptic विमान); ३५ µm भट्ठा; लाभ = २.७; EM लाभ = ३९०० ।
    नोट: यदि सिग्नल बहुत कमज़ोर या शोर मचाते है या अत्यधिक photobleaching हैं, तो 2 X बिन्नी लागू करें । 2 एक्स बिन्नी स्थानिक संकल्प की कीमत पर संकेत का पता लगाने में वृद्धि होगी ।
  3. एक उत्तेजना का चयन करने के लिए ८० फ्रेम के दौरान उद्धार (8 एस) 30 फ्रेम के बाद अधिग्रहण, 3 एस में ।
    नोट: कुछ उदाहरण उत्तेजनाओं के रूप में इस प्रकार हैं: २०० ms (+ या-०.२५ वी) अप करने के लिए 2 s (+ या-०.२५ v) पूर्वकाल या पीछे दिशा में कदम प्रत्येक बाल कोशिका के दिशात्मक संवेदनशीलता की पहचान करने के लिए; 2 एस, 5 हर्ट्ज वर्ग तरंग (०.२५ वी के लिए २०० ms,-०.२५ वी के लिए २०० ms, दोहराया 5 बार) सभी बालों की कोशिकाओं को एक साथ उत्तेजित करने के लिए. एक सकारात्मक दबाव (पूर्वकाल उत्तेजना) बाल कोशिकाओं के आधे सक्रिय हो जाएगा । एक नकारात्मक दबाव (पीछे उत्तेजना) बाल कोशिकाओं के दूसरे आधे सक्रिय हो जाएगा । सुनिश्चित करें कि उत्तेजना सॉफ्टवेयर या डिवाइस दबाव दबाना वापस 0 के बाद V उत्तेजना समाप्त हो गया है ।
  4. कैल्शियम प्रतिक्रियाओं mechanosensitive उपाय । शिखर हेयर बंडलों (आंकड़े 1a और 1B1-B1 ') के आधार पर ध्यान केंद्रित करें और छवि प्राप्ति शुरू कर दें ।
    नोट: यदि neuromast ऊपर नीचे (चित्रा 1b1-b1 ') से स्पष्ट रूप से देखा जाता है, सभी शिखर बालों के बंडल एक ही विमान में एक साथ imaged किया जा सकता है ।
  5. कैल्शियम प्रतिक्रियाओं presynaptic उपाय । बालों की कोशिकाओं (आंकड़े 1a और 1B2-B2) के आधार पर ध्यान केंद्रित करने और छवि अधिग्रहण शुरू करते हैं ।
    नोट: यदि neuromast ऊपर नीचे (चित्रा 1b2-b2) से स्पष्ट रूप से देखा जाता है, सभी बाल कोशिकाओं के presynaptic इमेजिंग विमानों 2 में प्राप्त किया जा सकता है-3 विमानों सेट 2 µm अलग है । टीजी [myo6b: ribeye-mcherry] ट्रांसजेनिक मछली की पहचान और presynaptic रिबन और कैल्शियम प्रविष्टि29की साइटों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

9. इमेजिंग अधिग्रहण प्रक्रिया विकल्प 2: बहु विमान अधिग्रहण

  1. पीजो-Z तेजी से अधिग्रहण के लिए 60x उद्देश्य से जुड़ी धुन (12-18 ms) । सुनिश्चित करें कि अधिकतम गति सेटिंग्स चयनित हैं ।
  2. पीजो-z का उपयोग करके एक z-स्टैक प्राप्ति बनाएं । प्राप्त बाल-बंडल ०.५ µm के कदम आकार के साथ 5 विमानों में गतिविधि मिले । 1 µm के चरण आकार के साथ 5 विमानों में presynaptic संकेतों का अधिग्रहण ।
  3. फ़्रेम दर को 10 हर्ट्ज पर सेट करें. प्रत्येक फ्रेम हर 20 एमएस और प्रत्येक Z-ढेर हर १०० ms पर कब्जा कर लिया जाएगा
  4. एक 8 एस स्ट्रीमिंग अधिग्रहण के लिए ४०० फ्रेम या ८० Z-स्टैक्स 10 हर्ट्ज पर के लिए अधिग्रहण सेट करें ।
  5. लेजर शक्ति, एपर्चर सेट करें, और लाभ के लिए संकेत का पता लगाने का अनुकूलन, लेकिन संतृप्ति, photobleaching, और शोर से बचें । एक Opterra/SFC सिस्टम के लिए उदाहरण सेटिंग्स निंनानुसार हैं: ४८८ एनएम लेजर पावर: ७५ (बाल बंडल मिले विमान), १२५ (synaptic विमान); ३५ µm भट्ठा; लाभ = २.७; EM लाभ = ३९०० ।
    नोट: 2 एक्स बिन्नी लागू करें यदि सिग्नल बहुत कमजोर हैं,शोर, या अत्यधिक photobleaching है । 2 एक्स बिन्नी स्थानिक संकल्प की कीमत पर संकेत का पता लगाने में वृद्धि होगी ।
  6. एक उत्तेजना का चयन करने के लिए १५० फ्रेम पर शुरू अधिग्रहण के दौरान उद्धार, 3 एस के बाद ।
  7. एकल विमान अधिग्रहण के लिए ऊपर वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल जारी है, लेकिन जेड शिखर या बेसल विमानों में ढेर केंद्र (कदम ८.४ और ८.५) ।

10. नियंत्रण: सभी पैदा कैल्शियम संकेतों के औषधीय ब्लॉक

नोट: BAPTA (1, 2-बीआईएस (o-aminophenoxy) एतान-n, n, n ′, N′-tetraacetic एसिड) उपचार एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है जब पहली बार इस प्रोटोकॉल की स्थापना ।

  1. 8 या 9 चरणों को पूरा करने के बाद, nb के साथ 1 एमएल एनबी की जगह 5 मिमी BAPTA युक्त टिप लिंक फाटक शिखर बाल बंडलों में स्थित चैनलों से मुलाकात करने के लिए आवश्यक सट करने के लिए ।
  2. 10 के लिए मशीन-आरटी में 20 मिनट ।
  3. BAPTA को 1 एमएल के साथ 3 बार धोएं ।
  4. चरण 8 या 9 दोहराएं । BAPTA उपचार के बाद, या तो शिखर बालों के बंडलों या synaptic विमान में द्रव-जेट उत्तेजना के जवाब में GCaMP6s प्रतिदीप्ति में कोई परिवर्तन नहीं होना चाहिए । यदि GCaMP6s प्रतिदीप्ति में परिवर्तन जारी रहती है, ये सच है कैल्शियम संकेत नहीं कर रहे है और गति कलाकृतियों हो सकता है ।

11. नियंत्रण: Presynaptic कैल्शियम संकेतों के औषधीय ब्लॉक (वैकल्पिक)

  1. 8 या 9 चरणों को पूरा करने के बाद, एनबी के साथ 10 µ एम isradipine युक्त के साथ बदलें ०.१% dimethyl sulfoxide (DMSO) के साथ एल प्रकार कैल्शियम चैनलों को ब्लॉक करने के लिए हेयर-सेल presynapse ।
  2. आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  3. कोई वॉश निष्पादित किए बिना, चरण 8 या 9 दोहराएँ । उपचार के बाद अभी भी शिखर बाल-बंडलों में नहीं बल्कि synaptic विमान द्रव-जेट उत्तेजना के जवाब में GCaMP6s प्रतिदीप्ति परिवर्तन किया जाना चाहिए । यदि GCaMP6s प्रतिदीप्ति में परिवर्तन synaptic विमान में जारी रहती है, ये सच है कैल्शियम संकेत नहीं कर रहे है और गति कलाकृतियों हो सकता है ।

12. छवि प्रसंस्करण और डेटा की चित्रमय प्रतिनिधित्व

नोट: फिजी का उपयोग करें (चरण 12.1 – 12.1.5) और ग्राफ़िंग प्रोग्राम (चरण 12.2 – 12.2.3) चरण 12 के लिए । StackReg, TurboReg (चरण 12.1.3), समय श्रृंखला विश्लेषक V3 (कदम 12.1.4-12.1.6), और फिजी plugins भी आवश्यक हैं ( सामग्री की तालिकादेखें).

  1. फिजी में एक छवि अनुक्रम, या तो एक एकल विमान समय श्रृंखला (८०-फ़्रेम एकल विमान) या Z-स्टैक समय श्रृंखला (४००-फ़्रेम बहु विमान) खोलें । पर क्लिक करें "फ़ाइल," चुनें ड्रॉप डाउन मेनू से "आयात", और पर क्लिक करें "छवि अनुक्रम."
    1. एक जेड के लिए ढेर बार श्रृंखला, z-परियोजना हर बार बिंदु (timepoint प्रति 5 विमानों) एक ८० फ्रेम छवि अनुक्रम बनाने के लिए । पर क्लिक करें "छवि," का चयन करें "स्टैक" ड्रॉप-डाउन मेनू से, ड्रॉप-डाउन मेनू से "उपकरण" का चयन करें, और "समूहीकृत Z-प्रोजेक्ट." प्रक्षेपण विधि के रूप में "औसत तीव्रता" का चयन करें, और "समूह आकार" के लिए "5" दर्ज करें ।
      नोट: Z-स्टैक के भीतर प्रत्येक विमान अतिरिक्त स्थानिक जानकारी के लिए अलग से विश्लेषण किया जा सकता है ।
    2. छवि अधिग्रहण के 8 एस (८० फ्रेम) से पहले 1 एस (10 फ्रेम) को हटा दें । पर क्लिक करें "छवि," का चयन करें "ढेर" ड्रॉप-डाउन मेनू से, ड्रॉप-डाउन मेनू से "उपकरण" चुनें, और "बनाओ उपस्टैक" पर क्लिक करें । "स्लाइस" के लिए "11-80" दर्ज करें ।
      नोट: इस उपस्टैक को stk1के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    3. StackReg प्लगइन३२का उपयोग कर छवि अनुक्रम (stk1) रजिस्टर । पर क्लिक करें "Plugins," का चयन करें "StackReg", और का चयन करें "अनुवाद" ७० के लिए पंजीकरण की विधि के रूप में फ्रेम समय श्रृंखला ।
      नोट: इस पंजीकृत उपस्टैक को stk2के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    4. GCaMP6 तीव्रता (एफ) माप निकालने के लिए टाइंस श्रृंखला विश्लेषक V3 प्लगइन का उपयोग करें । stk2में शिखर हेयर बंडल या presynaptic साइट्स पर ब्याज का क्षेत्र (ROI) रखें. ImageJ वेबसाइट को देखें (लिंक के लिए सामग्री की तालिका देखें) कैसे समय श्रृंखला विश्लेषक V3 का उपयोग करने पर निर्देशों के लिए ।
      नोट: शिखर बाल बंडलों के लिए एक परिपत्र 1-2 µm रॉय और synaptic विमान के लिए एक परिपत्र 3-5 µm रॉय का प्रयोग करें (आंकड़े 4A1 और 4A2) ।
    5. माप पैरामीटर्स का चयन करें । पर क्लिक करें "विश्लेषण," का चयन करें "माप सेट," और यह सुनिश्चित करना है कि केवल "धूसर मान का अर्थ" चयनित है ।
    6. roi प्रबंधक में, सभी ROIs का चयन करें और समय श्रृंखला में प्रत्येक ROI के लिए (F) तीव्रता मान जेनरेट करने के लिए बहु-माप फ़ंक्शन का उपयोग करें. रॉय प्रबंधक में, "अधिक > >," क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "बहु माप" चुनें ।
  2. प्लॉट (F) मान । मान (F) को "मल्टी माप" परिणामों से एक ग्राफ़िंग प्रोग्राम में एक X-Y ग्राफ़ (आंकड़े 4A1 ' और 4A2 ') बनाने के लिए चिपकाएं ।
    नोट: (X) मान मैंयुअल रूप से बनाएं या मेटाडेटा से समय स्टांप का उपयोग करें ।
    1. आधारभूत (एफओ) प्रत्येक रॉय के लिए पूर्व से ग्राफिंग कार्यक्रम में (एफ) मूल्यों औसत द्वारा-उत्तेजना फ्रेम्स 1-20 ।
    2. प्रत्येक रॉय के लिए, (f)(f) मान से (f) ΔF बनाने के लिए प्रत्येक timepoint पर मूल्यों को घटाना। पुनर्प्लॉट, यदि वांछित ।
    3. गणना और भूखंड ΔF/ प्रत्येक ROI के लिए, ΔF माप को (Fo) और पुनर्प्लॉट (आंकड़े 4A1 ' ' और 4A2 ' ') से विभाजित करें ।

13. छवि प्रसंस्करण और हीट Spatio-लौकिक कैल्शियम संकेतों का नक्शा प्रतिनिधित्व

नोट: पिछले काम के लिए स्थानिक गर्मी नक्शा बनाने के लिए zebrafish पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतों का प्रतिनिधित्व कस्टम सॉफ्टवेयर में Matlab5,28में लिखा इस्तेमाल किया है । इस विश्लेषण के लिए खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी३३के लिए अनुकूलित किया गया है । नीचे उल्लिखित सभी चरणों के लिए फिजी का उपयोग करें. StackReg और TurboReg फिजी plugins भी आवश्यक है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

  1. प्रदर्शन चरण 12.1 – प्रत्येक Z-स्टैक या एकल विमान समय श्रृंखला पंजीकृत उपस्टैक stk2के रूप में संदर्भित करने के लिए बनाने के लिए 12.1.3 ।
  2. आधारभूत छवि बनाने के लिए stk2 का उपयोग करें । पर क्लिक करें "छवि," का चयन करें "ढेर" ड्रॉप डाउन मेनू से, और चुनें "जेड परियोजना" । "प्रक्षेपण प्रकार" के लिए "औसत तीव्रता" का चयन करें, और "1" के लिए "प्रारंभ स्लाइस" और "स्लाइस रोकें" के लिए "20" दर्ज करें ।
    नोट: इस Z-प्रोजेक्शन को baselineIMGके रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    1. अस्थाई बिन ७०-फ़्रेम (F) छवि अनुक्रम (stk2) में 14 ०.५-s डिब्बे । पर क्लिक करें "छवि," का चयन करें "ढेर" ड्रॉप-डाउन मेनू से, ड्रॉप-डाउन मेनू से "उपकरण" का चयन करें, और "समूहीकृत जेड प्रोजेक्ट" पर क्लिक करते हैं । "प्रोजेक्शन पद्धति" के रूप में "औसत तीव्रता" का चयन करें और "समूह आकार." के लिए 5 दर्ज करें ।
      नोट: यह समूहीकृत Z-प्रोजेक्शन को चित्रा 5में stk2bin और F के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    2. एक ΔF छवि अनुक्रम बनाने के लिए बिन्नी (F) छवि अनुक्रम (stk2bin) से आधार रेखा (baselineIMG) का पिक्सेल मान घटाना । "प्रक्रिया" पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "छवि कैलकुलेटर" चुनें. "Image1" के रूप में stk2bin का चयन करें और "Image2" के रूप में baselineIMG । "कार्रवाई" के लिए "घटाना" चुनें.
      नोट: इस आधार रेखा-घटाई Z-प्रोजेक्शन stk2binBL और F-बीएल = ΔF चित्रा 5में के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
  3. ΔF छवि अनुक्रम (stk2binBL) प्रदर्शित करने के लिए पसंद का एक लुकअप तालिका (LUT) चुनें । पर क्लिक करें "छवि," का चयन करें "लुकअप तालिकाओं" ड्रॉप-डाउन मेनू से, और पसंद की एक LUT पर क्लिक करें ।
    नोट: "रेड हॉट" चित्रा 5में इस्तेमाल किया LUT है. LUT के साथ यह आधारभूत-घटाया Z-प्रोजेक्शन stk2binBL-LUT और ΔF LUT चित्रा 5में के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
    1. न्यूनतम (ंयूनतम) और अधिकतम (अधिकतम) stk2binBL-LUTके लिए चमक मान सेट करें । पर क्लिक करें "छवि," चुनें "समायोजित करें," और पर क्लिक करें "चमक/ stk2binBL-LUTसे पृष्ठभूमि शोर को निकालने के लिए न्यूनतम मान सेट करें. अधिकतम मान सेट करने के लिए ब्याज के संकेतों को बनाए रखने पर संकेत संतृप्ति से बचने के [उदाहरण के लिए, २०० से १६०० (12-बिट छवि तीव्रता सीमा = 0 ४०९५ करने के लिए)].
      नोट: दृश्य तुलना या अभ्यावेदन बनाते समय समान न्यूनतम और अधिकतम मानों का उपयोग करें. एक ΔF अंशांकन LUT बार प्रत्येक LUT छवि अनुक्रम (जैसे, stk2binBL-LUT) के लिए फिजी में उत्पन्न किया जा सकता है । पर क्लिक करें "विश्लेषण," का चयन करें "उपकरण," और पर क्लिक करें "अंशांकन पट्टी". संदर्भ के लिए LUT अंशांकन पट्टी के साथ एक अलग, व्यक्तिगत छवि उत्पन्न करने के लिए "ओवरले" को अनक्लिक करें ।
    2. दोनों ΔF (stk2binBL-LUT) को वांछित LUTand के साथ रूपांतरित करें (F) बिन्नी की छवि (stk2bin) दृश्यों को RGB करने के लिए । पर क्लिक करें "छवि," का चयन करें "प्रकार," और पर क्लिक करें "आरजीबी रंग."
      नोट: आरजीबी-रूपांतरित Z-अनुमानों को क्रमशः stk2binBL-LUT-rgb और stk2bin-rgbके रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
  4. ΔF LUT छवियाँ (stk2binBL-LUT-rgb) पर बिन्नी (F) छवियों (stk2bin-rgb) ओवरले । "प्रक्रिया" और फिर "छवि कैलकुलेटर" पर क्लिक करें । का चयन करें stk2bin-आरजीबी के रूप में Image1 और stk2binBL-LUT-आरजीबी Image2 के रूप में । "कार्रवाई" के लिए "पारदर्शी-शूंय" का चयन करें ।
    नोट: यदि ΔF LUT ओवरले में बहुत अधिक शोर या पृष्ठभूमि है, तो न्यूनतम मान बढ़ाने के लिए १३.३ चरण दोहराएँ. यदि संतृप्ति है, तो चरण १३.३ दोहराएँ और अधिकतम मान बढ़ाएँ ।

14. छवि प्रसंस्करण और Spatio-लौकिक हीट मानचित्र प्रतिनिधित्व एक फिजी स्थूल का उपयोग

नोट: निंनलिखित अनुभाग एक फिजी के लिए 13 कदम है कि स्वचालित रूप से GCaMP6s संकेतों के स्थानिक गर्मी नक्शा प्रतिनिधित्व बनाएगा पर आधारित LUToverlay बुलाया स्थूल को संदर्भित करता है । इस विश्लेषण के लिए खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी३३ और StackReg और TurboReg फिजी plugins की आवश्यकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

  1. इस प्रोटोकॉल के साथ फिजी LUT ओवरले मैक्रो (LUToverlay. ijm) डाउनलोड करें ( पूरक कोडिंग फ़ाइलदेखें) ।
  2. या तो एक बहु विमान समय श्रृंखला या एकल विमान समय श्रृंखला (१२.१ कदम देखें) खोलो ।
  3. पर क्लिक करें "Plugins," का चयन करें "मैक्रोज़" पर क्लिक करें "भागो," और LUToverlay मैक्रो का चयन करें । पाठ के साथ एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा, "मुझे अपनी छवि प्राप्ति के बारे में बताएँ".
    नोट: संवाद बॉक्स के लिए, उपस्थित संख्याओं का सुझाव दिया गया मान है और प्रयोगकर्ता द्वारा उपयोग किए गए सेटअप के अनुसार बदला जा सकता है । बॉक्स में सूचीबद्ध मूल्यों और नीचे ४०० छवियों और timepoint प्रति 5 विमानों (चरण 9) के साथ एक बहु विमान समय श्रृंखला के लिए सेट कर रहे हैं ।
  4. "timepoint प्रति विमानों की संख्या" के बाद, timepoint प्रति विमानों की संख्या दर्ज करें (जैसे, चरण 12.1.1 के लिए timepoint प्रति 5 विमानों के साथ एक बहु विमान ४०० समय श्रृंखला का उपयोग कर, "5" दर्ज करें । एक एकल विमान अधिग्रहण के लिए (जैसे, चरण 8) "1" दर्ज करें ।
    नोट: शेष संवाद बक्सों में, एक बहु-विमान समय श्रृंखला के लिए, "Timepoints" में अनुमानित Z-स्टैक संख्या छवियों को संदर्भित करता है (जैसे, चरण 12.1.1 के लिए यह है ८० Timepoints) ।
    1. छवि अनुक्रम के पहले 1 s (जैसे, चरण 12.1.2 का चयन करें "11-80" को निकालने के लिए पहले 10 फ़्रेम और पहले 1 s) को निकालने के लिए "विश्लेषण करने के लिए श्रेणी निर्धारित करें" विकल्प का उपयोग ।
    2. के बाद "आधार रेखा में timepoints परिभाषित", छवियों की संख्या दर्ज करने के लिए आधारभूत छवि बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा [उदाहरण के लिए, १३.२ कदम के लिए, "20" पूर्व उत्तेजना छवियों (11-30) का उपयोग करने के लिए दर्ज करें] ।
    3. "लौकिक बिन प्रति Timepoints" के बाद ओवरले के लिए बिन के लिए छवियों की संख्या दर्ज करें । (उदा., चरण 13.2.2 के लिए. 14 ०.५-s डिब्बे बनाने के लिए "5" का चयन करें ।
    4. "ंयूनतम तीव्रता" और "अधिकतम तीव्रता" के बाद ंयूनतम और अधिकतम चमक मूल्यों है कि पृष्ठभूमि शोर (ंयूनतम) को दूर करेगा और ब्याज के संकेतों को बनाए रखने में प्रवेश करते हुए संतृप्ति (अधिकतम) से परहेज ।
    5. "एक लुकअप तालिका चुनें" के बाद, ओवरले के लिए इच्छित LUT का चयन करें. "ठीक" क्लिक करें ।
      नोट: मैक्रो चरण 13 में प्रस्तुत निर्देशों के अनुसार छवियों का विश्लेषण करना समाप्त कर देगा । मैक्रो द्वारा जनरेट किया गया चित्र भी चरण 13 में दिए गए निर्देशों के अनुसार नाम दिया जाएगा ।
  5. कोई नई छवि अनुक्रम संसाधित करने से पहले सभी विश्लेषण विंडो बंद करें ।

Representative Results

myo6b के बाद: GCaMP6s-caax ट्रांसजेनिक मछली ठीक से स्थिर और तरल पदार्थ-जेट उत्तेजना पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं को दिया जाता है, मजबूत कैल्शियम संकेतों visualized और मापा जा सकता है (4 और 5आंकड़े, 2 एक्स बिन्नी पर लिया) । द्रव के दौरान-जेट उत्तेजना, कैल्शियम संकेतों या तो शिखर बाल बंडलों, में मापा जा सकता है जहां मिले चैनलों उत्तेजनाओं के जवाब में खुला, या बाल कोशिकाओं के आधार पर, जहां presynaptic Cav१.३ कैल्शियम चैनल neurotransmission ट्रिगर । एक व्यक्तिगत neuromast के साथ इन क्षेत्रों में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4A1-A2 ' 'में दिखाया गया है । इस उदाहरण में, एक 2-s 5 हर्ट्ज द्रव-जेट उत्तेजना प्रतिनिधि neuromast के भीतर सभी बाल कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए दिया गया था. उत्तेजना के दौरान, मजबूत कैल्शियम संकेतों बालों के बंडलों में पता लगाया जा सकता है (चित्रा 4a1-a1 ' ', 8 बाल बंडलों से प्रतिक्रियाओं को दिखाया जाता है). इस प्रणाली में, लगभग सभी परिपक्व बाल कोशिकाओं कैल्शियम की इस शिखर आमद5प्रदर्शन । इसके विपरीत, एक ही neuromast के भीतर, केवल एक सबसेट में बेसल, synaptic विमान में detectable कैल्शियम संकेतों (~ बालों की कोशिकाओं का 30%) (चित्रा 4a2-a2 ' ', presynaptic प्रतिक्रियाओं के साथ 4 कोशिकाओं को दिखाया जाता है)5। 4 ग्रीन ROIs कोई महत्वपूर्ण presynaptic कैल्शियम संकेतों के साथ कोशिकाओं को दिखाने (चित्रा 4a2-a2 ' ') मजबूत शिखर कैल्शियम संकेतों के बावजूद (चित्रा 4a1-a1 ' '). इस प्रतिनिधि उदाहरण में (चित्रा 4a1-A2 '), रंगीन ROIs शिखर मिले विमान (चित्रा 4a1) बेसल synaptic विमान (चित्रा 4A2) में उनके सेल निकायों के साथ में बाल बंडलों मैच । इस उदाहरण पर प्रकाश डाला गया कैसे दोनों के आश्रित मिले-और presynaptic-कैल्शियम संकेत व्यक्तिगत बाल कोशिकाओं के भीतर और बालों की कोशिकाओं की आबादी के बीच मापा जा सकता है ।

दोनों बालों के बंडलों और presynapse में कैल्शियम संकेतों के रूप में या तो रॉ (F) GCaMP6s तीव्रता या ΔF/fo GCaMP6s तीव्रता (देखें चरण 12, आंकड़े 4A1'-A1 ' ' और 4A2'-A2 ' ') के रूप में रची जा सकती है । (च) GaMP6s रेखांकन हाइलाइट करता है कि प्रत्येक कोशिका के लिए आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता अलग कर सकते हैं (आंकड़े 4A1 ' और 4A2 '). ΔF/Fo GCaMP6s रेखांकन में, प्रत्येक कक्ष अपनी आधारभूत मान के लिए सामान्यीकृत है और आधार रेखा से सापेक्ष तीव्रता परिवर्तन प्लॉट किए गए है (आंकड़े 4A1 ' ' और 4A2 ' ') । दोनों में (f) और ΔF/fo GCaMP6s भूखंडों, दोनों शिखर बाल बंडल और बेसल presynaptic विमान उत्तेजना (ग्रे बॉक्स) की शुरुआत के साथ शुरू में कैल्शियम का संकेत है और तेजी से गिरावट के बाद उत्तेजना समाप्त होता है । उत्तेजना के दौरान, बालों के बंडलों में कैल्शियम संकेतों तेजी से वृद्धि और संतृप्ति अगर झुकाव की शक्ति में परिवर्तन नहीं करता है (चित्रा 4a1-a1 ' ') । इसके विपरीत, synaptic विमान में detectable कैल्शियम संकेतों के साथ बालों की कोशिकाओं के सबसेट के भीतर, कैल्शियम संकेतों को और अधिक धीरे से वृद्धि हुई है और कम संतृप्ति के लिए प्रवण (चित्रा 4a2-a2 ' ') । presynaptic के बिना बालों की कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नल (green ROIs), कैल्शियम सिग्नल बेसलाइन के पास रहते हैं.

इन चित्रमय अभ्यावेदन (चित्रा 4) के अलावा, कैल्शियम संकेतों विशेष रूप से रिकॉर्डिंग के समय पाठ्यक्रम के दौरान पूरे neuromast के भीतर visualized किया जा सकता है । एक spatiotemporal प्रतिनिधित्व का एक उदाहरण के एक neuromast के बेसल विमान में presynaptic GCaMP6s संकेतों के लिए चित्रा 5 में दिखाया गया है । चित्रा 5में, एक विशेष दृश्य के लिए एक छवि अनुक्रम को संसाधित करने के लिए मुख्य चरण चरण 13 में वर्णित के रूप में उल्लिखित हैं । सबसे पहले, कच्चे (च) GCaMP6s छवियों अस्थाई बिन्नी है [चित्रा 5: पंक्ति 1 (14 डिब्बे के 5 दिखाया जाता है); चरण 13.2.1] । फिर, आधारभूत छवि, पूर्व उत्तेजना फ्रेम (चरण १३.२) से गणना, (F) GCaMP6s प्रतिदीप्ति संकेतों से ΔF छवियों को प्राप्त करने के लिए घटाया (चित्रा 5: पंक्ति 2; चरण 13.2.2) । अगला, ΔF ग्रेस्केल छवियाँ करने के लिए एक रंग LUT (चित्रा 5: पंक्ति 3, लाल गर्म LUT; चरण १३.३) में कनवर्ट किए जाते हैं । अंत में, LUT रूपांतरण के साथ ΔF छवियों अस्थाई बिन्नी (एफ) छवियों (चित्रा 5, पहली पंक्ति) पर मढ़ा है उत्तेजना के दौरान neuromast के भीतर spatiotemporal संकेतों को प्रकट (5 चित्रा: पंक्ति 4; १३.४ कदम) । ΔF GCaMP6s संकेतों की गर्मी नक्शे दोनों मूल्यवान स्थानिक और लौकिक जानकारी है कि एक ROIs से बाहर पार्स करने के लिए आसान नहीं है और चित्र 4में प्रयुक्त रेखांकन प्रदान करते हैं । हीट मैप्स प्रत्येक बाल कोशिका के भीतर कैल्शियम संकेतों की शुरुआत और अवधि के साथ ही पूरे के भीतर बाल कोशिकाओं के बीच समय और तीव्रता मतभेदों के बारे में उपसेलुलर जानकारी सहित महत्वपूर्ण spatiotemporal जानकारी कल्पना, मदद कर सकते हैं neuromast ।

यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि रेखांकन और स्थानिक गर्मी नक्शे सच कैल्शियम संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं और प्रमोशन के कारण कलाकृतियों नहीं हैं. इस प्रोटोकॉल में, गति कलाकृतियों अत्यधिक बहाव या लार्वा या द्रव-जेट उत्तेजना के कारण गति के आंदोलन का परिणाम हो सकता है । ये सभी कलाकृतियां वीवो तैयारी में इस में पूरी तरह से खत्म करने के लिए चुनौती दे रही हैं । जबकि छवि दृश्यों का पंजीकरण (step 12.1.3) x-और y-अक्षों में आंदोलन के बहुमत के लिए सही कर सकते हैं, z-अक्ष में अत्यधिक आंदोलन के साथ छवि दृश्यों की पहचान की जानी चाहिए और विश्लेषणों से हटाया जाना चाहिए । गति कलाकृतियों कैल्शियम संकेतों ग्राफिंग द्वारा पहचान करने के लिए सबसे आसान कर रहे हैं । GCaMP6s तीव्रता परिवर्तन है कि कलाकृतियों के उदाहरण है और सच नहीं है GCaMP6s संकेत शीर्ष (चित्रा 4B1'-B1 '') और बाल कोशिकाओं के आधार (चित्रा 4C1'-c1 ' ') पर मनाया जा सकता है ।

शिखर बाल बंडलों में, गति कलाकृतियों आम है जब द्रव-जेट उत्तेजना भी मजबूत है (चित्रा 3A3 '' ') । इन जरूरत से ज्यादा मजबूत उत्तेजनाओं के दौरान, शिखर बाल बंडल विमान द्रव के दौरान ध्यान से बाहर ले जा सकते है जेट उत्तेजना तो मूल फोकल विमान में लौटने के बाद उत्तेजना समाप्त (चित्रा 4B1'-बी ' ') । यह मुश्किल सही शिखर मिले निर्भर कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए बनाता है । हेयर-बंडल मोशन कलाकृतियों का एक उदाहरण चित्रा 4B1'-B1 ' 'में देखा जा सकता है । यहां, रेखांकन उत्तेजना (ग्रे बॉक्स) के दौरान GCaMP6s संकेतों में कमी दिखा जब बाल बंडलों के बाहर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । बाद उत्तेजना समाप्त होता है, GCaMP6s संकेत तेजी से बाल बंडलों के रूप में अपने मूल स्थिति में लौटने के लिए और ध्यान में वापस आ वृद्धि हुई है । चित्रा 4A1' में उदाहरण के साथ यह विरोधाभासों-A1 ' ' जिसमें शिखर कैल्शियम का संकेत उत्तेजना की शुरुआत में वृद्धि और कमी जब उत्तेजना समाप्त होता है ।

जबकि अत्यधिक तरल पदार्थ के कारण आंदोलन-जेट उत्तेजनाओं भी ध्यान से बाहर synaptic विमान ले जा सकते हैं, गति विरूपण साक्ष्य के इस प्रकार इस विमान में कम आम है । इसके बजाय, आंदोलन या लार्वा के बहाव के कारण Z-अक्ष में ध्यान में परिवर्तन गति कलाकृतियों का सबसे आम कारण हैं । लार्वा गति या बहाव दोनों शीर्ष और बालों की कोशिकाओं के आधार पर GCaMP6s माप को प्रभावित कर सकते हैं । लार्वा गति का एक उदाहरण है कि बेसल में GCaMP6s बढ़ जाती है, उत्तेजना के दौरान synaptic विमान चित्रा 4C'-C ' 'में दिखाया गया है । मोशन कलाकृतियों (चित्रा 4C1'-c1 ' ') GCaMP6s संकेतों के समय पाठ्यक्रम का परीक्षण करके सच्चे presynaptic संकेतों (चित्रा 4A2'-A2 ' ') से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. बजाय बढ़ाने और उत्तेजना (चित्रा 4A2'-A2 ' ') के साथ तेजी से घटते, GCaMP6s संकेत में गति प्रेरित बढ़ता है एक चौकोर आकार और वृद्धि और शुरुआत और उत्तेजना की भरपाई के साथ अचानक गिर जाते हैं, क्रमशः ( चित्र 4 C1'-C1 ' ') ।

GCaMP6s संकेतों के समय पाठ्यक्रम के सावधान परीक्षा के अलावा, नियंत्रण औषध का उपयोग कर प्रयोगों गति कलाकृतियों से सच GCaMP6s संकेतों अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, BAPTA (चरण 10) के लिए टिप-लिंक है कि बालों के बंडलों में मुलाकात चैनल समारोह के लिए आवश्यक है सट लागू किया जा सकता है । BAPTA दोनों द्रव-जेट पैदा शिखर को समाप्त करना चाहिए-चैनल पर निर्भर कैल्शियम आमद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद बेसल, presynaptic कैल्शियम आमद के माध्यम से Cav१.३ चैनल । के प्रतिनिधि उदाहरण में सच उत्तेजना पैदा कैल्शियम संकेतों (चित्रा 4A1-A2 ' ') द्रव-जेट उत्तेजना के दौरान, शिखर और बेसल दोनों विमानों में GCaMP6s प्रतिदीप्ति में सभी परिवर्तन BAPTA उपचार के बाद समाप्त हो जाएगा । इसके विपरीत, GCaMP6s प्रतिदीप्ति में ऐसे आंकड़े 4B1'-B1 ' ' और 4C1'-c1 ' ' में दिखाए गए लोगों के रूप में गति के कारण परिवर्तन BAPTA उपचार द्वारा समाप्त नहीं किया जाएगा ।

BAPTA का उपयोग करने के लिए सभी उत्तेजना-GCaMP6s संकेतों को खत्म करने के अलावा, isradipine लागू किया जा सकता है (11 कदम) विशेष रूप से ब्लॉक Cav१.३-बेसल synaptic विमान में निर्भर कैल्शियम का तांता जबकि शिखर मिले चैनल पर निर्भर कैल्शियम आमद बरकरार5. isradipine के आवेदन के बाद, कोई प्रस्ताव कलाकृतियों के साथ एक व्यक्ति neuromast में, शिखर बालों के बंडलों में GCaMP6s प्रतिदीप्ति में परिवर्तन (चित्रा 4A1'-A1 ' ') द्रव के दौरान-जेट उत्तेजना अनछुए होगा, जबकि सभी synaptic GCaMP6s आधार पर प्रतिदीप्ति परिवर्तन (चित्रा 4A2'-A2 ' ') को समाप्त किया जाएगा । isradipine आवेदन के बाद synaptic विमान में GCaMP6s संकेत में कोई परिवर्तन (जैसे,चित्रा 4c1-c1 ' ') सबसे अधिक संभावना गति कलाकृतियों के अनुरूप होगा.

Figure 1
चित्रा 1 : एक पार्श्व लाइन neuromast और कार्यात्मक इमेजिंग विमानों का अवलोकन । (a) बाईं ओर के आरेख में चार बाल-कोशिका निकायों (black) से संपर्क करने वाले postsynaptic afferent न्यूरॉन्स (blue) के साथ एक neuromast का पक्ष-दृश्य दर्शाया गया है. प्रत्येक कोशिका के भीतर presynaptic सक्रिय साइटों पर रिबन (हरा) तार बुलबुले. प्रत्येक कोशिका शरीर के लिए शिखर stereocilia (1 µm) के एक बंडल है कि मुलाकात चैनल होते हैं । प्रत्येक बाल बंडल बाल बंडल के आधार करने के लिए पानी की गति के यांत्रिक बल स्थानांतरण कि एक kinocilium है. दाईं ओर का आरेख ऊपर-नीचे दृश्य में एक ही मॉडल को दर्शाया गया है. इस शीर्ष-डाउन दृश्य में, बाईं ओर आरेख में दर्शाए गए चार कक्षों को इंगित करने के लिए काला उपयोग किया जाता है, और neuromast में अन्य कक्षों को इंगित करने के लिए धूसर का उपयोग किया जाता है. इस मॉडल और इन 2 विचारों के भीतर, तीन महत्वपूर्ण विमानों पर प्रकाश डाला जाता है: (1) बाल बंडलों के सुझावों (kinocilia) बाल बंडल विक्षेपन की भयावहता को यों तो इस्तेमाल किया, (2) शिखर के आधार पर विमान से मुलाकात की बालों के बंडलों जहां कैल्शियम सेल में प्रवेश करती है उत्तेजना के दौरान, और (3) कोशिका के आधार पर synaptic विमान जहां कैल्शियम synaptic रिबन के पास में प्रवेश करती है । (b1-b1 ') बाल बंडलों, जहां mechanosensation-निर्भर कैल्शियम संकेतों को रिकॉर्ड किया जा सकता है के आधार पर मिले विमान के ऊपर-नीचे छवियां और GCaMP6s । (b2-b2 ') उद्योग और GCaMP6s ऊपर-नीचे छवियां b1-b1 ' के रूप में एक ही neuromast से, लेकिन synaptic विमान में neuromast के आधार पर, जहां presynaptic कैल्शियम संकेतों का पता लगाया जा सकता है । (C1-C2) एक neuromast व्यक्त GCaMP6s जहां लार्वा अनुचित तरीके से बढ़ रहा है की छवियां । इस उदाहरण में, शिखर मिले विमान (C1) और synaptic विमान (C2) कक्ष के आधार पर एक इष्टतम कोण पर स्थित हैं । यह स्थिति सभी बाल बंडलों के लिए अनुमति नहीं देता है एक एकल विमान में छवि हो, और कई और अधिक इमेजिंग विमानों के लिए इस neuromast के भीतर सभी synapses पर गतिविधि पर कब्जा करने की जरूरत है B1-B2 ' की तुलना में । चित्र 5 dpf में लार्वा के हैं । c2 में स्केल बार B1-C2 में सभी छवियों से संबंधित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : इमेजिंग चैंबर, zebrafish बढ़ते और दिल इंजेक्शन प्रक्रियाओं, और सुई । (एक) दिखाया एक लार्वा के साथ एक इमेजिंग चैंबर है (एक धराशाई आयत द्वारा उल्लिखित) सिलिकॉन encapsulant के ऊपर केंद्र पर टिकी हुई है । (B1) दिखाया गया है एक 5 dpf लार्वा दो पिन द्वारा मैटीरियल । एक बड़े सिर पिन शरीर को सीधा रखा है बस आंख के पीछे । दो आँखें पूरी तरह से आरोपित हैं तो नीचे की आँख पूरी तरह ऊपरी आँख से छिप जाती है. एक छोटी पूंछ पिन पूंछ में notochord संप्रदाय । लार्वा सपाट है और मुड़ा नहीं है । (B2) लार्वा को पंगु बना, एक दिल इंजेक्शन सुई शरीर के लिए सीधा उन्मुख है और दिल से सटे लाया । दिल इंजेक्शन सुई दिल के सामने वर्णक कोशिका से संपर्क करना चाहिए । (B2 ') त्वचा में सुई के अवसाद दिल के सामने वर्णक कोशिका के इंडेंट का कारण बनता है । (ग) बाईं ओर से सही करने के क्रम में सुई: लगभग 3 µm के एक खोलने के साथ एक दिल इंजेक्शन सुई का उदाहरण; एक अच्छा तरल पदार्थ के उदाहरण-लगभग ५० µm के एक खोलने के साथ जेट सुई; एक खराब टूटी द्रव-जेट सुई है कि बड़े और दांतेदार है और संभावना अत्यधिक और अनियमित उत्तेजनाओं का उत्पादन होगा का उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : द्रव-जेट संरेखण, स्थिति, और उत्तेजना अंशांकन । (A1) दिखाया एक लार्वा बाईं और पूंछ के लिए दाईं ओर का सामना करना पड़ सिर के साथ उंमुख है, और एक द्रव-जेट सुई zebrafish शरीर के एक-पी धुरी के समानांतर उंमुख । इस द्रव-जेट सुई neuromasts कि पूर्वकाल को उत्तेजित करने के लिए गठबंधन किया है (पुश/दबाव) और पीछे (पुल/ (A2) दिखाया गया है एक neuromast (डैश्ड व्हाइट लाइन द्वारा रेखांकित) और शिखर बाल बंडलों (kinocilia) के सुझावों पर बाईं ओर पैनल और द्रव-जेट सुई पैनल के दाईं ओर पर. द्रव-जेट neuromast के किनारे से लगभग १०० µm तैनात है । (a3-a3 ' ' ') शिखर बाल बंडलों (kinocilia) के सुझावों को अलग द्रव-जेट उत्तेजना दबावों से भिंन दूरी को मोड़ा जाता है । एक एकल kinocilial टिप के पथ १.५ µm (a3 ') और 5 µm (a3 ') के लिए विक्षेपन दूरी दिखाया गया है । ब्लैक सर्कल kinocilium के आराम की स्थिति को इंगित करता है । यह महत्वपूर्ण है कि kinocilia बहुत दूर नहीं है, अंयथा उत्तेजना तीव्रता मज़बूती से quantified नहीं किया जा सकता है और हानिकारक (A3 ' ' ') हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : शिखर से मुलाकात की और बेसल presynaptic GCaMP6s संकेतों के दौरान पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं में द्रव जेट उत्तेजना । (A1-A2 ' ') एक प्रतिनिधि neuromast भीतर द्रव-जेट उत्तेजना के दौरान GCaMP6s तीव्रता परिवर्तन । बाईं ओर छवियों शिखर मिले विमान (A1) और बेसल synaptic विमान (A2) एक ही neuromast के भीतर दिखा । A1 और A2 में कोडेड ROIs रंग प्रत्येक छवि के दाईं ओर (f) और ΔF/f GCaMP6s तीव्रता रेखांकन के समय पाठ्यक्रम प्लॉट करने के लिए उपयोग किए गए थे । (b1-b1 ' ') एक शिखर द्रव-जेट उत्तेजना के दौरान अतिरिक्त आंदोलन के साथ छवि अनुक्रम से मुलाकात की उदाहरण । बाईं (B1) पर छवि से पता चलता है ROIs (एफ) और ΔF/f GCaMP6s तीव्रता रेखांकन सही करने के लिए साजिश करने के लिए इस्तेमाल किया । (c1-c1 ' ') बेसल synaptic विमान में एक छवि अनुक्रम का उदाहरण है कि आंदोलन कलाकृतियों और GCaMP6s संकेत परिवर्तन है कि सच कैल्शियम संकेतों नहीं है से पता चलता है । बाईं (C1) पर छवि (f) और ΔF/f GCaMP6s तीव्रता रेखांकन सही करने के लिए प्लॉट करने के लिए उपयोग किया गया ROIs दिखाता है । प्रत्येक ग्राफ में ग्रे बॉक्स प्रत्येक छवि अनुक्रम के दौरान तरल पदार्थ जेट उत्तेजना की अवधि का प्रतिनिधित्व करता है. A 2-s 5 Hz द्रव-जेट उत्तेजना A1-A2 ' ' और b1-b1 ' ' में उदाहरण के लिए उपयोग किया गया था । c1-c1 ' ', एक 2 एस पूर्वकाल कदम उत्तेजना इस्तेमाल किया गया था. (च) GCaMP6s रेखांकन के लिए Y अक्ष मनमाना इकाइयों (A.U.) फिजी छवि तीव्रता माप से प्राप्त दर्शाया गया है । सभी उदाहरण 4-5 dpf पर लार्वा से हैं । स्केल बार = 5 सभी छवियों के लिए µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : द्रव-जेट उत्तेजना के दौरान presynaptic GCaMP6s संकेतों के Spatiotemporal दृश्य । उत्तेजना के दौरान एक neuromast के भीतर GCaMP6s तीव्रता में spatiotemporal परिवर्तन कल्पना करने के लिए कदम रेखांकित कर रहे हैं । समय के लिए बाएं से सही समय स्टांप के अनुसार प्रतिनिधित्व किया है छवियों के शीर्ष पर । शीर्ष पंक्ति एक ७०-फ़्रेम GCaMP6s (F) छवि अनुक्रम (चरण 13.2.1) से 14 लौकिक डिब्बे के 5 से पता चलता है । दूसरी पंक्ति में, आधारभूत (चरण १३.२) से प्रत्येक (F) GCaMP6s बिन्नी इमेज को ΔF इमेज (step 13.2.2) बनाने के लिए निकाला गया है । तीसरी पंक्ति में, ΔF छवियों को ग्रेस्केल (दूसरी पंक्ति) से लाल गरम LUT (चरण १३.३) में रूपांतरित किया गया है । इन LUT छवियों के मिन और मैक्स को सही (step 13.3.1) पर सापेक्ष ΔF तीव्रता (A.U.) के लाल गर्म LUT हीट मैप के अनुसार सेट किया जाता है । निचली पंक्ति में, तीसरी पंक्ति (चरण १३.४) शीर्ष पंक्ति में (F) छवियों पर मढ़ा गया है । चित्रा के शीर्ष पर ग्रे बार 2-s 5 हर्ट्ज द्रव-जेट उत्तेजना के समय को इंगित करता है. इसका उदाहरण 5 dpf लार्वा से है । रिश्तेदार ΔF तीव्रता (A.U.) के लाल गर्म LUT गर्मी नक्शे की एक किंवदंती सही करने के लिए दिखाया गया है । स्केल बार = 5 सभी छवियों के लिए µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

बरकरार जानवरों में vivo इमेजिंग में स्वाभाविक चुनौतीपूर्ण है । इस विधि में कई कदम पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं से vivo कैल्शियम माप में विश्वसनीय प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, यह लार्वा इमेजिंग के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए इमेजिंग से पहले पिन किए गए और ठीक से रुक गया है कि बहुत महत्वपूर्ण है । इमेजिंग के दौरान अतिरिक्त आंदोलन GCaMP6s प्रतिदीप्ति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि सही संकेत नहीं हैं और कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन के अनुरूप नहीं है (जैसे, आंकड़े 4B1'-B1 ' ' और 4C1'-c1 ' '). पूंछ पिन अधिक पूर्वकाल में रखा जा सकता है मदद करने के लिए आंदोलन को कम करने, हालांकि यह अधिक पीछे neuromasts दुर्गम प्रदान कर सकते हैं । इसके अलावा, दिल इंजेक्शन के बाद, सिर पिन इतना घुमाया जा सकता है कि पिन के क्षैतिज हिस्से की जर्दी में निहित है । पिन की स्थिति को बदलने के अलावा, यह भी एक मस्तिष्क टुकड़ा वीणा का उपयोग करने के लिए पिन के बजाय लार्वा स्थिर करने के लिए संभव है३४. जब लार्वा को ठीक से रखा जाता है, तो एक वीणा लार्वा को स्थिर करने का एक अतिरिक्त, संभावित रूप से कम इनवेसिव तरीका है । हालांकि महत्वपूर्ण आंदोलन अपर्याप्त लगाए से परिणाम कर सकते हैं, ठीक से दिल इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए α-bungarotoxin और पंगु बना लार्वा अपूर्ण पक्षाघात, आंदोलन में परिणाम कर सकते हैं, और अंत में गति कलाकृतियों प्रदान करने के लिए विफलता । हालांकि आमतौर पर इस्तेमाल किया निश्चेतक को zebrafish बाल कोशिकाओं की उत्तेजितता को प्रभावित दिखाया गया है, हाल ही में काम पता चला है कि संवेदनाहारी benzocaine बाल सेल गतिविधि के कई पहलुओं के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । इसी तरह, अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया संवेदनाहारी MS-२२२ केवल बाल सेल गतिविधि के कुछ पहलुओं के साथ हस्तक्षेप15। इसलिए, α-bungarotoxin इंजेक्शन के चुनौतीपूर्ण प्रकृति के कारण, benzocaine या एमएस-२२२ आवेदन कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग के दौरान लार्वा में आंदोलन को रोकने के लिए पक्षाघात की एक उपयोगी वैकल्पिक पद्धति साबित हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में शामिल तकनीकी चुनौतियों के अलावा, यहां तक कि एक पूरी तरह से घुड़सवार नमूना बेकार है अगर लार्वा और बाल कोशिकाओं से पहले और प्रत्येक इमेजिंग प्रयोग के दौरान स्वस्थ नहीं हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि लार्वा और बाल कोशिकाएं स्वस्थ हैं, यह महत्वपूर्ण है कि लार्वा E3 बफ़र में बनाए रखे जाते हैं जो इस तरह की चोरियों (अंडे के गोले), अपशिष्ट और सूक्ष्मजीवों जैसे मलबे से मुक्त होते हैं । हालांकि पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के सतही स्थान इमेजिंग के लिए लाभप्रद है, यह स्थान बनाता है उंहें और अधिक असुरक्षित सेलुलर नुकसान के लिए जब E3 बफर है बेईमान । एक स्वच्छ, जलीय वातावरण युवा लार्वा (2-4 dpf) या म्यूटेंट है कि एक ईमानदार तैराकी की स्थिति बनाए रखने और मुख्य रूप से पेट्री पकवान के तल पर झूठ नहीं कर सकते के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इन स्थितियों में, पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं और सुरक्षात्मक बाल बंडलों आसपास cupula आसानी से समझौता हो सकता है । यहां तक कि जब स्वस्थ लार्वा और बाल कोशिकाओं के साथ शुरू, प्रत्येक प्रयोग के दौरान, यह यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि लार्वा दिल की धड़कन और तेजी से रक्त का प्रवाह है । यदि रक्त का प्रवाह धीमा या बंद हो जाता है तो बाल कोशिकाओं के स्वास्थ्य में समझौता बन सकता है. अस्वास्थ्यकर लार्वा या रक्त प्रवाह की हानि शामिल समझौता तैयारियों में, मरने बाल कोशिकाओं कई मायनों में पहचान की जा सकती है: पहले, karyopyknosis या परमाणु संघनित्र, जो सेल के भीतर एक बुलबुला के रूप में प्रकट होता है की उपस्थिति से के तहत उद्योग प्रकाशिकी; दूसरा, कोशिका संकोचन और कोशिका द्रव्य के भीतर तेजी से चलती कणों की उपस्थिति के द्वारा; और तीसरा, जब kinocilia युक्तियां अलग३५दिशाओं में बाहर splay । जब बाल बंडलों को बाधित कर रहे हैं, splayed kinocilia उत्तेजना के दौरान एक साथ cohesively कदम नहीं है ।

यह तैयारी कई छोटी सीमाएं हैं, एक जा रहा है कि तैयारी केवल 1-3 घंटे के लिए मजबूत है के बाद यह स्थापित है । लार्वा को स्थिर करने और छिड़काव सिस्टम जोड़ने के लिए छोटे पिन या ब्रेन-स्लाइस वीणा का उपयोग करने जैसे संशोधन vivo तैयारी में इस के जीवनकाल का विस्तार कर सकते हैं । एक और सीमा है कि photobleaching और phototoxicity दोहराया इमेजिंग परीक्षणों के बाद हो सकता है । एक रोमांचक तरीका इस चुनौती को दूर करने के लिए प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन है । लाइट शीट माइक्रोस्कोपी फोकस प्रकाश से कम करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, कम photobleaching और phototoxicity३६करने के लिए अग्रणी. एक साथ, gentler स्थिरीकरण और कम फोटो प्रदर्शन प्रत्येक इमेजिंग सत्र को लम्बा करने में मदद कर सकते हैं । अब इमेजिंग सत्र के लिए कार्यात्मक विकास के साथ परिवर्तन की पूरी अवधि की जांच और बाल-कोशिका निकासी और चोट के बाद पुनर्जनन अंतर्निहित प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । यह बात करने के लिए महत्वपूर्ण है कि, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के अलावा, इस प्रोटोकॉल अंय प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है फोकल सिस्टम (बिंदु स्कैनिंग, 2-फोटॉन, और डिस्क कताई) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सरल widefield सिस्टम28,३४ . कुल मिलाकर, अपनी बहुमुखी प्रतिभा इस प्रोटोकॉल एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि अनुकूलित किया जा सकता है और कई इमेजिंग प्रणालियों के साथ प्रयोग करता है ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल और अनुकूलित किया जा सकता है कई इमेजिंग प्रणालियों के साथ प्रयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को भी अनुकूलित किया जा सकता है और (1) GCaMP6s के अलावा अंय संकेतकों और (2) के साथ अंय संवेदी कोशिकाओं और ंयूरॉंस में छवि गतिविधि के लिए लार्वा zebrafish के भीतर । उदाहरण के लिए, पिछले एक अध्ययन में, हम cytosolic कैल्शियम (RGECO1), पुटिका फ्यूजन (SypHy), झिल्ली वोल्टेज (Bongwoori), और झिल्ली का पता लगाने के लिए पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के भीतर कई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संकेतकों का उपयोग कर छवि गतिविधि के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया कैल्शियम (jRCaMP1a-caax और GCaMP6s-caax), और पार्श्व के भीतर लाइन afferent झिल्ली कैल्शियम का पता लगाने के लिए प्रक्रियाओं (GCaMP6s-caax)5. इन संकेतकों का उपयोग कर हमारे अनुभव के आधार पर, ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (myo6b: GCaMP6s-caax) इस प्रोटोकॉल में वर्णित पार्श्व लाइन neuromasts में इमेजिंग गतिविधि के लिए एक उत्कृष्ट शुरू प्रदान करता है । ऊपर सूचीबद्ध सभी संकेतकों में से हमने पाया है कि GCaMP6s सबसे संवेदनशील और photostable है । इन सुविधाओं के अलावा, हम टीजी (myo6b: GCaMP6s-caax) ट्रांसजेनिक लाइन पर प्रकाश डाला क्योंकि यह दो अलग माप बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: एक एकल mechanosensation लाइन के भीतर बाल कोशिका presynaptic और ट्रांसजेनिक कैल्शियम.

इस आलेख में उल्लिखित तकनीक प्रदर्शित करता है कि कैसे zebrafish पार्श्व पंक्ति में कैल्शियम इमेजिंग एक शक्तिशाली विधि कैसे अपने पैतृक वातावरण में बाल कोशिकाओं समारोह का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण स्तनधारियों के अध्ययन के पूरक है जिसमें हेयर-सेल का कार्य वर्तमान में पूर्व वीवो explants में अध्ययन किया जा रहा है । इसके अलावा, zebrafish मॉडल के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संकेतक है कि फिर स्तनधारी बाल कोशिकाओं में गतिविधि की जांच लागू किया जा सकता है की प्रभावकारिता का परीक्षण ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को NIH/NIDCD अंदर रिसर्च फंड्स 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) ने सपोर्ट किया था । हम फिजी स्थूल लेखन में उसकी सहायता के लिए कैंडी वोंग स्वीकार करना चाहते हैं । हम भी अपने प्रोटोकॉल के साथ उपयोगी सुझावों के लिए डोरिस वू और कैंडी वोंग शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

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References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४१ Zebrafish कैल्शियम इमेजिंग फोकल इमेजिंग vivo इमेजिंग में बाल कोशिकाओं संवेदी तंत्रिका विज्ञान पार्श्व रेखा आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संकेतक GCaMP
Vivo में लार्वा Zebrafish में पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग
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Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo… More

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

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