Summary
هذا العمل يقدم بروتوكولا لإنشاء ثقافة تعليق الخلية المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) الأوراق التي يمكن استخدامها لدراسة عملية التمثيل الغذائي للمركبات الخارجية التي يمكن تناولها من قبل النبات كله، مثل المبيدات الحشرية.
Abstract
تم تطوير منصة لدراسة الأيض المبيدات الحشرية باستخدام الأنسجة في المختبر من مصنع الشاي. وقد تم حث أوراق من النباتات الشاي المعقم لتشكيل كالوس فضفاضة على Murashige وSkoog (MS) وسائل الإعلام القاعدية مع الهرمونات النباتية 2،4-ثنائي كلوروفينوكسي حمض (2،4-D، 1.0 ملغ L-1)والكينتين (KT، 0.1 ملغ L-1). شكلت كلوس بعد 3 أو 4 جولات من subculturing، كل 28 يوما. ثم تم تلقيح الكلوس الفضفاض (حوالي 3 غرام) في وسائل الإعلام السائلة B5 التي تحتوي على نفس الهرمونات النباتية وكان مثقفا في حاضنة تهز (120 دورة في الدقيقة) في الظلام في 25 ± 1 درجة مئوية. بعد 3-4 الثقافات الفرعية، تم تأسيس تعليق الخلية المستمدة من ورقة الشاي في نسبة ثقافة فرعية تتراوح بين 1:1 و 1:2 (تعليق السائل الأم: المتوسطة الطازجة). باستخدام هذه المنصة، تم إضافة ستة مبيدات حشرية (5 ميكروغرام مل-1 كل ثياميثوكسام، إيميداكلوبريد، أسيتامبريد، إيميداكلوتيز، ديميثات، وأوميثوت) إلى ثقافة تعليق الخلايا المشتقة من أوراق الشاي. وقد تم تتبع عملية التمثيل الغذائي للمبيدات الحشرية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة وكروماتوغرافيا الغاز. للتحقق من فائدة ثقافة تعليق خلية الشاي، تمت مقارنة المستقلبات من الثياميثوكسان وdimethoate الموجودة في الثقافات الخلايا المعالجة والنباتات سليمة باستخدام الطيف الكتلي. في الثقافات خلية الشاي المعالجة, تم العثور على سبعة المستقلبات من الثياميثوكسان واثنين من الأيض من dimethoate, بينما في النباتات السليمة المعالجة, تم العثور على اثنين فقط من الأيض من الثياميثوكسام واحد من dimethoate. استخدام تعليق الخلية تبسيط التحليل الأيضي مقارنة مع استخدام نباتات الشاي سليمة، وخاصة بالنسبة لمصفوفة صعبة مثل الشاي.
Introduction
الشاي هو واحد من المشروبات غير الكحولية الأكثر استهلاكا على نطاق واسع في العالم1،2. يتم إنتاج الشاي من أوراق وبراعم الكاميليا الخشبية المعمرة سينينسيس L. تزرع نباتات الشاي في مزارع واسعة وهي عرضة للعديد من الآفات الحشرية3،4. وغالبا ما تستخدم المبيدات الحشرية العضوية وneonicotinoid كمبيد حشري نظامي5 لحماية نباتات الشاي من الآفات مثل الذباب الأبيض، النطاط ورقة، وبعض أنواع lepidopteran6،7. بعد الاستخدام، يتم امتصاص هذه المبيدات الحشرية أو نقلها إلى النبات. داخل النبات، يمكن أن تتحول هذه المبيدات الحشرية النظامية من خلال التحلل المائي، والأكسدة أو التفاعلات الحد من قبل الإنزيمات النباتية. هذه المنتجات التحول يمكن أن تكون أكثر القطبية وأقل سمية من المركبات الأم. ومع ذلك، بالنسبة لبعض الفوسفات العضوي، والأنشطة الحيوية لبعض المنتجات أعلى. على سبيل المثال، يتم استقلاب الاسباهياتفي الميثاميدوفوس الأكثر سمية 8،9،وdimethoate في omethoate10،11. دراسات الأيض النباتية هي بالتالي مهمة لتحديد مصير مبيد الآفات داخل مصنع12.
وقد ثبت أن نباتات الأنسجة النباتية منصة مفيدة للتحقيق في عملية التمثيل الغذائي لمبيدات الآفات، مع الأيض المحددة مماثلة لتلك الموجودة في النباتات سليمة13،14،15. استخدام الأنسجة الثقافات، ولا سيما الخلايا مع لتعليق الثقافات، له العديد من المزايا. أولا، يمكن إجراء التجارب خالية من الكائنات الحية الدقيقة، وبالتالي تجنب تدخل تحويل مبيدات الآفات أو تدهورها من قبل الميكروبات. ثانيا، توفر زراعة الأنسجة مواد متسقة للاستخدام في أي وقت. ثالثا، الأيض هي أسهل لاستخراج من ثقافات الأنسجة من النباتات سليمة، وثقافات الأنسجة غالبا ما يكون أقل المركبات المتشابكة وتعقيد أقل من المركبات. وأخيرا، يمكن استخدام ثقافات الأنسجة بسهولة أكبر لمقارنة سلسلة من الأيض مبيدات الآفات في تجربة واحدة16.
في هذه الدراسة، تم بنجاح إنشاء تعليق الخلية المستمدة من أوراق نبات الشاي المعقم. ثم استخدمت ثقافة تعليق خلية الشاي لمقارنة سلوكيات تبديد ستة مبيدات حشرية نظامية.
ويهدف هذا البروتوكول المفصل لتوفير بعض الإرشادات بحيث يمكن للباحثين إنشاء منصة زراعة الأنسجة النباتية مفيدة لدراسة مصير الأيض من xenobiotics في الشاي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الشاي ثقافة كالوس
ملاحظة: تم اشتقاق الأوراق المعقمة من خطوط نباتية مزروعة في المختبر تم تطويرها لأول مرة في مجموعة البحث17. وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات حتى القسم 5 في غطاء محرك السيارة تدفق الصفيحة المعقمة، باستثناء وقت الثقافة في حاضنة.
- ضبط درجة الألف درجة الألف من وسائل الإعلام اثنين (Murashige وSkoog [MS] المتوسطة القاعدية ومتوسط السائل B5 Gamborg) إلى 5.8 قبل الأوتوكلاف (121 درجة مئوية، 20 دقيقة).
- يُقطّع على طول الوريد الأوسط لورقة معقمة باستخدام مقص، ثم يُقسم كل نصف إلى قطع صغيرة تبلغ حوالي 0.3 سم x 0.3 سم في طبق بتري.
- ضع الإفرازات المعقمة (قطع أوراق صغيرة) على وسائط MS القاعدية التي تحتوي على الهرمونات النباتية 2،4-D (1.0 ملغ L-1)وKT (0.1 ملغ L-1). يمكن وضع ستة نباتات في قارورة 300 مل تحتوي على 100 مل من وسائل الإعلام القاعدية MS.
- ثقافة ال [إإكسبلوس] أعلاه أوراق في درجة حرارة ثابتة من 25 [ك] في الظلام. بعد 28 يوما، حدد الجيل الأول من الكالوس المستحث ونقل إلى قارورة جديدة (ثقافة فرعية). الحصول على الكانوس الفضفاض ة بعد الثقافات الفرعية 3-4.
2. الشاي خلية تعليق الثقافة
- اقطع الأقنعة القوية والقابلة للتفتيت والفضفاضة من الوسط الصلب إلى قطع صغيرة (تتراوح بين 0.5 و2 مم) باستخدام شفرة جراحية معقمة في ظروف معقمة.
- تزن حوالي 3 غرام من قطع صغيرة من كالوس. ضع الكالوس في قارورة 150 مل تحتوي على 20 مل من وسائل الإعلام السائلة B5 مع 2,4-D (1.0 ملغ L-1)وKT (0.1 ملغ L-1).
- ثقافة تعليق الخلية السائلة في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) في حاضنة تهز في 120 دورة في الدقيقة في الظلام.
- بعد 7 إلى 10 أيام من زراعة، وإزالة قوارير الثقافة والسماح لهم الوقوف لبضع دقائق.
- تأخذ كل supernatant كمادة البذور للزراعة الفرعية إلى المتوسطة الطازجة (نسبة الزراعة الفرعية من السائل الأم تعليق إلى المتوسطة الطازجة تراوحت بين 1:1 و 1:2). إزالة المعجل، calluses كبيرة.
- الحصول على ثقافة تعليق الخلية النهائية نمت بشكل جيد بعد 3-4 دورات الثقافة الفرعية من 28 يوما لكل منهما.
3. ثلاثي الفينيل رباعي الزيوم كلوريد تقييم مدى بقاء الخلية
- قتل عينة من الخلايا الحية في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة كخلية التحكم قبل تلطيخ الحياة.
- جهاز طرد مركزي جميع ثقافة تعليق الخلية لمدة 8 دقيقة في 6000 × ز. إزالة supernatant قبل تعليق الخلايا في 2.5 مل من الفوسفات المخزنة في العازلة المالحة (PBS) العازلة (pH 7.3)، ويهز لمدة دقيقة واحدة باليد.
- إضافة 2.5 مل من 0.4٪ ثلاثي الفينيل رباعي الزيوم (TTC) محلول ويهز باليد مرة أخرى.
- احتضان الخليط لمدة ساعة في حاضنة دائمة (30 درجة مئوية).
4- معالجة وأخذ عينات من ثقافات تعليق خلايا الشاي بالمبيدات الحشرية
- إضافة a aliquot من 400 ميكرولتر من محلول المخزون المعقم بالفلتر (500 ميكروغرام مل-1)من أربعة نيونيكوتينويدس (ثياميثوكسام، أسيتاميبريد، إيميداكلوبريد، وإيميداكلوتيز) أو اثنين من الفوسفات العضوي (الديميثوتي وomethoate) في ثقافات تعليق الخلية، التوالي.
ملاحظة: إذا كان الهدف هو مقارنة السلوكيات xenobiotic، استخدم نفس دفعة الأم من تعليق الخلية لاختبار المركبات المختلفة. - زرع عينات من تعليق الخلية مع المبيدات الحشرية في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) وتهتز سرعة الحاضنة (120 دورة في الدقيقة). خذ العينات (انظر الخطوة 4.3 أو 4.4) على 0، 3، 5 10، 15، 20، 25، 30، 35، 40، 45، 50، 55، 60، 65، 70 و 75 يوما.
- لاختبار عينة تحتوي على neonicotinoid، إزالة 1 مل من aliquot من ثقافة الخلية متجانسة، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي البلاستيك 1.5 مل، والطرد المركزي في 4000 x ز لمدة 2 دقيقة.
- تمرير الفوق من خلال 0.22 ميكروم المسام الحجم غشاء التصفية قبل التحليل عن طريق ارتفاع أداء السائل الكروماتوغرافيا والأشعة فوق البنفسجية (HPLC-UV) وفائقة الأداء السائل الكروماتوغرافيا رباعي ة وقت الرحلة (UPLC-QTOF) كتلة قياس الطيف (جدولالمواد).
- لاختبار عينة تحتوي على الفوسفات العضوي، قم بإزالة نسبة الأليكوت 500 μL من ثقافة الخلية ووضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 35 مل أو أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 1.5 مل (إعداد العينة الأخيرة مثل تلك التي نيونيكوتينويد).
- إضافة 0.1 غرام من كلوريد الصوديوم و 5 مل من أسيتات الأسيتات الأسيتون/إيثيل (3:7، v/v) في أنبوب الطرد المركزي 35 مل من عينات 500 ميكرولتر.
- دوامة الخلائط لمدة 1 دقيقة، ثم السماح لهم للراحة لمدة 10 دقيقة.
- خذ 2.5 مل من supernatant في أنبوب زجاجي 10 مل وتتبخر إلى شبه جفاف باستخدام مبخر النيتروجين في 40 درجة مئوية.
- حل بقايا مع 1 مل الأسيتون، دوامة لمدة 1 دقيقة، وتمريرها من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكروم قبل تحليلها من قبل الغاز الكروماتوغرافيا اللهب كاشف القياس الضوئي (GC-FPD).
5. إعداد عينة من مصنع الشاي سليمة مع المبيدات الحشرية
ملاحظة: أجريت تجربة مصنع الشاي سليمة في نظام الزراعة المائية باستخدام شتلات الشاي نمت في 50 مل من محلول المغذيات (30 NH4+، 10 NO3-، 3.1 PO4-، 40 ك+، 20 Ca2 +، 25 ملغ2 +، 0.35 Fe 2+، 0.1 B 3+، 1.0 Mn2+، 0.1 zn2+، 0.025 Cu2+، 0.05 مو+، و 10 آل3 +، في ملغ L-1)18. وكان الدفيئة التجريبية تحت دورة الضوء المظلم (12 ساعة من الضوء و 12 ح من الظلام) في 20 درجة مئوية في جامعة انهوي الزراعية.
- وضع خمسة نباتات في وعاء من البلاستيك 4 لتر لمدة 15 يوما.
- إضافة 0 جزء في المليون (التحكم) أو 100 جزء في المليون من الثياميثوكسام أو dimethoate في الأواني البلاستيكية، على التوالي.
- إعداد عينة النبات سليمة وفقا للطريقة السابقة، باستثناء presoaking19،ثم تحليل مع الطيف الكتلي للطيف كتلة دقيقة.
6- تحليل الآلات
-
تحليل HPLC للسلوك الأيضي للنيونيكوتينويدات
- استخدام HPLC-UV(جدولالمواد) للكشف عن محتوى ومنتجات التمثيل الغذائي من الثياميثوكسام وأسيتاميد في طول الموجة من 254 نانومتر، وimidacloprid وimidaclothiz في 270 نانومتر في عينات من القسم 4.3.
ملاحظة: كانت حالة HPLC-UV هي نفسها التي كانت الدراسة السابقة19.
- استخدام HPLC-UV(جدولالمواد) للكشف عن محتوى ومنتجات التمثيل الغذائي من الثياميثوكسام وأسيتاميد في طول الموجة من 254 نانومتر، وimidacloprid وimidaclothiz في 270 نانومتر في عينات من القسم 4.3.
-
تحليل GC للسلوك الأيضي للفوسفات العضوي
- كشف محتوى dimethoate وomethoate في عينات من القسم 4.4 من قبل GC-FPD باستخدام عمود chiral (جدولالمواد).
- استخدام النيتروجين كغاز الناقل وتعيين معدل التدفق في 1.0 مل دقيقة-1.
- تعيين درجة الحرارة الأولية إلى 120 درجة مئوية، وعقد لمدة 5 دقيقة. وأخيرا زيادة إلى 210 درجة مئوية في 30 درجة مئوية دقيقة-1 ثم عقد لمدة 5 دقائق.
- تعيين درجة حرارة الحقن إلى 200 درجة مئوية في وضع الانقسام. تعيين درجة حرارة كاشف إلى 250 درجة مئوية.
- قم بتعيين حجم الحقن إلى 1 ميكرولتر.
-
تحليل UPLC-QTOF للأيض المبيدات الحشرية في ثقافة الخلايا
- كشف الأيض من المبيدات الحشرية في ثقافة الخلية (عينات من القسم 4.3) باستخدام UPLC-QTOF مع عمود C18 (جدولالمواد).
- تعيين معدل التدفق إلى 0.2 مل دقيقة-1. قم بتعيين حجم الحقن إلى 10 ميكرولتر.
- بالنسبة للعينات المعالجة بالنيونيكوتينويد، قم بتعيين المرحلة المتنقلة الأولية إلى 85% A (5 mM ماء الأمونيوم فورمات) و15% B (أسيتونتريل). أكثر من 10 دقيقة، وزيادة المرحلة المتنقلة B إلى 38٪ والعودة إلى 15٪ على 1 دقيقة، عقد لمدة 9 دقائق.
- بالنسبة للعينات التي تعالجها الفوسفات العضوي، قم بتعيين المرحلة المتنقلة الأولية إلى 55% A (0.1% من مياه حمض الفورميك) و45% B (الأكيتوني). أكثر من 5 دقائق، وزيادة المرحلة المتنقلة B إلى 70٪، ثم العودة إلى 45٪ من B على 0.5 دقيقة، وعقد لمدة 2.5 دقيقة.
- تعيين المعلمات عملية كيو تي أو ف على النحو التالي: درجة حرارة الغاز، 325 درجة مئوية؛ تجفيف الغاز (النيتروجين)، 10 لتر دقيقة-1؛ درجة حرارة غاز غمد، 350 درجة مئوية؛ تدفق الغاز غمد، 11 L دقيقة-1؛ الجهد الشعري، 4000 V. فوهة الجهد، 1000 V؛ جهد الشظية، 100 فولت للمبيدات الحشرية neonicotinoid أو 110 V للمبيدات الحشرية الفوسفورية العضوية؛ مكشطة الجهد، 65 V؛ تعمل في وضع الليونات الإيجابية.
- تعيين الصك إلى الطيف المسح الكامل والهدف MS / MS الوضع.
- معالجة البيانات باستخدام أدوات كتلة دقيقة؛ يستنتج الأيض مع ما من منتجات معياريّة من ال [مس/مس] تعليق توضيحيّ فضلا عن الأدب12,15,20,21,22.
-
تحليل UPLC-Orbitrap للمستقلبات المبيدات الحشرية في استخراج النبات سليمة
- الكشف عن الأيض من المبيدات الحشرية في استخراج النبات سليمة باستخدام UPLC-Orbitrap قياس الطيف الكتلي (جدولالمواد).
- تعيين قياس الطيف الكتلي(جدول المواد) المعلمات العملية على النحو التالي: ضغط الغاز غمد، 35 arb؛ درجة حرارة الغاز، 300 درجة مئوية؛ فوهة الجهد، 3.5 KV؛ درجة حرارة الشعرية، 350 درجة مئوية.
- تعيين برامج الأوتيون كما أعلاه (الخطوتين 6.3.3 و 6.3.4) لتحليل UPLC-QTOF من ثقافة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم مقارنة الحث من الكالوس من أوراق حصادها من أشجار الشاي المزروعة في الميدان ومن أوراق مستخرجة من نباتات الشاي المزروعة في المختبر في بيئة معقمة عن طريق قياس التلوث، والبني، والحث بعد 28 يوما من الزراعة على وسائل الإعلام MS ( الشكل 1 ألف). وقد سجل نمو كلوس في 20، 37، 62 و 90 يوما من الثقافة (الشكل 1B). وأظهرت الكالوس المستمدة من الأوراق المزروعة في المختبر نموا أكثر قوة مما فعل كالوس المستمدة من الأوراق المزروعة في الميدان خلال كامل 90 يوما من الزراعة. كان الكالوس من الأوراق المعقمة أصفر ساطع، في حين كان الكالوس من الأوراق المزروعة في الميدان بني (الشكل1B).
في تركيز 1.0 ملغ L-1 من 2,4-D23, تم تحسين تركيز KT. في 0.05 ملغ L-1 KT، وكان معدل النمو كالوس بطيئة، وكان الملمس قليلا المدمجة، وكان الكالوس الأبيض في اللون (الشكل2C). في 0.1 ملغ L-1 KT التركيز، وكان معدل نمو كلوس أعلى، تصل إلى 61.5٪ (الشكل2A)،وكان الملمس فضفاضة، وكان اللون مصفر (الشكل2C)؛ عندما تم زيادة KT إلى 0.5 ملغ L-1، كان كالوس المدمجة وغير النظامية والبني في المركز (الشكل2C). وبعد أن تم اختيار تركيز الـ KT، تمت دراسة تركيز 2,4-D. في مزيج من 1 ملغ L-1 2,4-D و 0.1 ملغ L-1 KT, وكان معدل نمو كالوس أعلى, تصل إلى 46.9%, وكان مظهر كالوس أفضل (الشكل2B,D).
بعد الثقافة الفرعية2 ND على وسائل الاعلام الصلبة، تم تغطية أكثر من نصف سطح كل ورقة مستخرجة من قبل callus المتزايد (الشكل 3A). بعد ال 4 [سوبكلتثر], غطّيت الورقة أقسام كان تماما ب ال [كلّوس]. بعد 5th الثقافة الفرعية، بدأ الملمس كالوس لتصبح مدمجة مع بعض البقع البيضاء والبني على الجزء السفلي.
عندما كان دورة الثقافة الفرعية 21 يوما (الشكل3B),كان callus قوية, ولكن لم يتم التوصل إلى أكبر قدر من النمو, مما يدل على أن الثقافة الفرعية المتكررة من شأنه أن يؤدي إلى أقل كمية كالوس. عندما كانت دورة الثقافة الفرعية 28 يوما طويلة، وكان الكالوس نمت بقوة، وكان اللون مصفر اللون والملمس كان فضفاضا. بعد 35 يوما، بدأ الكالوس إلى اللون البني من المركز. كان ال [كلّوس] في الحالة مريضة, مع لون عميقة سمراء و [نو لونجر] ينمو, في 42 أيام.
تمت مقارنة نوعين من وسائل الإعلام السائلة لتأثيراتها على نمو الكلوس ولون تعليق الخلية (الشكل 4). تم اختبار ثلاث نسب مختلفة من السائل الأم إلى الحجم الإجمالي للسائل الثقافة. خلال 75 يوما من الزراعة، زادت كثافة الخلية تدريجيا في الثقافات التي بدأت في جميع النسب الثلاث. وأسفرت نسبة 15 غرام من الخلايا في وسائط جديدة 40 مل (v/v) عن قيمة كثافة بصرية أعلى بكثير من القيمة التي بلغت 4 ز في 40 مل (v/v) و 6 ز في 40 مل (v/v) (الشكل5A). بعد 4 دورات الثقافة الفرعية من 28 يوما لكل منهما، تم تأسيس نظام تعليق خلية الشاي بنجاح من كالوس الشاي المعقم في وسائل الإعلام السائلة B5 (الشكل 6).
الشكل 1 مقارنة بين الحث الكالوس من أوراق منتقى وأوراق نباتية معقمة. (أ) مقارنة الحث الكالوس من أوراق حصادها من نباتات الشاي المزروعة في المزارع ومن أوراق مستخرجة من النباتات المعقمة في المختبر. ولوحظت النباتات الأولية للتلوث والبني والحث على الكالوس. (ب) مقارنة نمو كلوس من الأوراق المستمدة من نباتات الشاي المزروعة في المزارع (مجموعة 1) والعقيمة في النباتات المزروعة في المختبر (مجموعة 2): الصور كانت في أيام مختلفة: 20 (لوحات أ)؛ 37(ب)؛ 62(ج); و 90( د). وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 معدل النمو وحالة نمو الشاي ورقة مشتقة كالوس تحت تركيزات هرمون النبات المختلفة. معدل النمو( A) وحالة النمو (C)من أوراق الشاي المشتقة كنوس تحت تركيزات KT مختلفة و 1 ملغ L-1 2,4-D; معدل النمو( ب) وحالة النمو (D) من كنوس تحت تركيزات مختلفة 2,4-D و 0.5 ملغ L-1 KT. وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 حالة الكلوس بعد أرقام مختلفة من دورات الثقافة الفرعية (A) وأطوال مختلفة من دورات الثقافة الفرعية (B). وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تأثير أنواع الوسائط المختلفة على نمو الكلوس في نظام ثقافة التعليق السائل. (A) B5 متوسطة. (B) MS المتوسطة. وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 قيم الكثافة البصرية وتلطيخ TTC. (أ) بدأت قيمة OD680 لتعليق الخلية بنسب مختلفة من صفر إلى 75 يوماً؛ (ب) تلطيخ TTC من خلايا المعيشة والسيطرة. وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 عملية إنشاء ثقافة تعليق خلية الشاي في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) في حاضنة مظلمة. ثقافة معقمة من الشاي النباتات كمصدر للنبات النبتة (أ) ؛ ورقة الشاي تلقيح على المتوسطة MS مع 2،4-D (1.0 ملغ L-1)وKT (0.1 ملغ L-1)(ب)؛ الكلوس المعتَكَم الأولي بعد 28 يومًا (ج) ؛ Callus مناسبة لتعليق الخلية بعد 4 دورات فرعيةمن 28 يوما كل ( د) ؛ وكانت الخطوات المتبقية في نفس درجة الحرارة ولكن بسرعة ثابتة من 120 دورة في الدقيقة في حاضنة الهز: الكلوس تلقيح في المتوسطة B5 لمدة 7 إلى 10 أيام (ه)؛ البذرة تعليق الخلية بعد إزالة callus عجل وكبيرة (و) ؛ الثقافة الفرعية لتعليق الخلية بعد 1 دورة من 28 يوما (ز) ؛ ناضجة تعليق الخلية بعد 3-4 دورات الثقافةالفرعية من 28 يوما لكل (ح). وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التمثيل الغذائي من 5 ميكروغرام / مل من 6 المبيدات الحشرية في ثقافة تعليق خلية الشاي وفي وسائل الإعلام (CK) حاضنة في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) وتهتز سرعة حاضنة (120 دورة في الدقيقة) على مدى 75 يوما. ثياميثوكسين(أ), إيميداكلوبريد (ب), أستياميبريد (ج), إيميداكلوتيز (د), ديميثوoate(E1), وomethoate(F); (E2) إنتاج مع مرور الوقت من المستقلب من dimethoate (omethoate) المنتجة في ثقافة الخلايا معاملتهم dimethoate وسائل الإعلام. وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: مجموع كروماتوغرام الأيون (TICs) من مقتطفات من ثقافة الخلايا السيطرة غير المعالجة، ثقافة الخلايا المعالجة بالثياميثوكسام، وسائل الإعلام المعالجة بالثياميثوكسام (خالية من الخلايا) بعد 75 يوما. وكانت قمم 1-5, 7 و 8 الأيض من الثياميثوكسام وذروة 6 كان الثياميثوكسام (A); TICs من مقتطفات من ثقافة الخلايا التي تعامل مع dimethoate، وسائل الإعلام التي تعامل dimethoate (خالية من الخلايا)، وخلايا التحكم غير المعالجة بعد 60 يوما. وكانت قمم 1 و 2 الأيض من dimethoate والذروة3 كان dimethoate ( B); TICs من مقتطفات من ثياميثوكسام المعالجة (العلوي) وغير المعالجة (أقل)النباتات سليمة ( C); TICs من مقتطفات من dimethoate المعالجة (العلوي) وغير المعالجة (أقل)النباتات سليمة ( D); المستقلب من dimethoate في tR 1.86 دقيقة في النباتات سليمة (D1); لا توجد مركبات تم اكتشافها في 1.86 دقيقة في النباتات غير المعالجة (D2). وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: قياس الطيف الكتلي الثانوي باستخدام UPLC-QTOF من القمم المشتقة من الثقافات المعالجة بالثياميثوكسام (A) و(B) dimethoate. وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 4: قياس الطيف الكتلي الثانوي باستخدام Q-Exactive من القمم المستمدة من النباتات السليمة المعالجة بالثياميثوكسام (A1 و A2 و A3) و dimethoate (B1 و B2). وقد تم تعديل هذا الرقم من جياو وآخرون24. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعرض هذا المقال عملية مفصلة لإنشاء نموذج من الأيض المبيدات في الأنسجة النباتية الشاي، بما في ذلك اختيار explants، وتحديد بقاء الخلية، وإنشاء ثقافة تعليق خلية الشاي مع ارتفاع التمثيل الغذائي النشاط. ويمكن استخدام أي أجزاء من الأنسجة النباتية لبدء كالوس في بيئة معقمة25. وقد تم اختيار أوراق الشاي لبدء الكالوس في هذه الدراسة، ليس فقط لأن الأوراق تميل إلى أن تكون أقل تلوثا من الأجزاء تحت الأرض، ولكن أيضا لأنها هي جزء صالح للأكل من المحصول والهدف الرئيسي لتطبيق مبيدات الآفات.
في هذه الدراسة، تمت مقارنة معدل الحث وحالة نمو كالوس من الأوراق المنتقى من الحقل ومن الأوراق المستخرجة من نبات معقم يزرع في المختبر. وكانت معدلات البنى والتلوث أقل بكثير من الأوراق العقيمة، كما أن معدل الاستقراء أعلى مقارنة بالأوراق المزروعة في الميدان. وكان ذلك على الأرجح لأن الأوراق من النباتات المزروعة في الميدان لم تخضع للتعقيم السطحي باستخدام الإيثانول والزئبق فحسب، بل أيضاً إلى تغير في بيئة النمو، في حين أن الأوراق المعقمة تزرع في بيئة معقمة ويمكن استخدامها مباشرة دون تعقيم إضافي. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الكالوس المستمدة من النباتات المعقمة المزروعة في المختبر نموا ًياً أكثر قوة من الأوراق المزروعة في الميدان خلال 90 يوما من الزراعة. وكانت الأوراق من النباتات المعقمة أكثر ملاءمة لتحريض كنوس الشاي، ليس فقط بسبب الحث كنوس عالية ومعدلات التلوث المنخفض، ولكن أيضا بسبب أقصر وقت ما قبل المعالجة والاستقلال عن العوامل الموسمية.
للثقافة الكلوس فضفاضة وقابل للتفتيت، يجب أن تكون المعلمات الحاسمة، في المقام الأول مستويات منظم نمو النبات وطول وعدد دورات الثقافة الفرعية، الأمثل25. 2,4-D يمكن أن تعزز بشكل فعال الحث كلوس والنمو وهو الهرمون الأكثر استخداما في ثقافة كالوس26. أوقات الثقافة الفرعية وطول دورة الثقافة الفرعية هي أيضا مهمة لثقافة كالوس25. بعد 2 إلى 4 الثقافات الفرعية من 28 يوما من كل دورة، وكان كالوس نسيج فضفاضة مع لون مصفر وليس البني. حددت تجارب التحسين أن أفضل بروتوكول التعريفي كلوس كان لوضع النباتات ورقة من النباتات المعقمة على وسائل MS القاعدية التي تحتوي على 1 ملغ L-1 2,4-D و 0.1 ملغ L-1 KT ونقل explant/ كلوس كل 28 يوما لa ما مجموعه 4 دورات فرعية للزراعة. هذا البروتوكول بدأ فضفاضة وقابل للتفتيت الكنوس التي كانت مناسبة لبدء تعليق الخلية.
في زراعة الأنسجة النباتية، يمكن استخدام المتوسط الصلبة المستخدمة لنمو كلوس في كثير من الأحيان لثقافة تعليق الخلية في شكل سائل23. حيث أن الشاي يأتي إلى حيز الوجود كميات كبيرة من البوليفينول في المتوسطة القاعدية MS تحتوي على تركيز عال من الأملاح غير العضوية، مما أدى إلى براونينغ كالوس27،28. في هذه الدراسة، تم اختبار وسائل الإعلام السائلة B5 ووسائل الإعلام MS على حد سواء. ولم يعثر على متوسط معدلات النمو أي فرق كبير بين الثقافتين (16.66 في المائة في وسائل الإعلام القاعدية B5 و 15.77 في المائة في وسائط MS القاعدية؛ الشكل 4). ومع ذلك، كانت الكالوس البني في وسائل الإعلام القاعدية MS. لذلك، تم اختيار B5 وسائل الإعلام القاعدية في الأسلوب المقترح.
الأكسجين مهم لنمو الخلايا النباتية والتمثيل الغذائي. في الثقافة السائلة، فإن حجم مفرط من السائل يقلل من تركيز الأكسجين وتمنع نمو الخلايا، في حين أن القليل جدا من السائل يمنع أيضا نمو الخلايا25. تم اختبار عدة نسب من السائل إلى حجم قارورة (مل السائل: قارورة مل). استنادا ً إلى الوزن الجاف لنمو الخلية بعد 21 د، السائل: نسب قارورة مرتبة على النحو التالي: 30:150 > 40:150 > 20:150، 50:150، 60:150 (مل: مل)23. في هذه الدراسة، تم وضع 40 مل من السائل الثقافة في قارورة 150 مل (40 مل: 150 مل) تم اختيارها وفقا لكيفية تعليق الخلية بدا كما لوحظ من قبل العين المجردة.
الخلايا النباتية لا يمكن أن تنمو بشكل جيد عندما تكون كثافة الخلايا عالية جدا أو منخفضة جدا. وهكذا، فإن نسبة ثقافة تعليق الخلية الأم إلى المتوسطة الطازجة في وقت الثقافة الفرعية يؤثر على إمكانات النمو للخلايا29. استخدمت هذه الدراسة قيمة OD من ثقافة تعليق الخلية متجانسة لتمثيل كمية نمو الخلية. التلقيح مع 15 غرام من السائل الأم إلى 40 مل من الحجم الإجمالي للسائل (v/v) كان مناسبا لنمو الخلية. وكانت نسبة الثقافة الفرعية مساوية للنسبة بين 1:1 و 1:2 (تعليق السائل الأم: المتوسطة الطازجة).
تم اختبار قابلية الخلايا داخل ثقافة تعليق خلية الشاي من قبل TTC تلطيخ. يمكن تحويل مركب TTC عديم اللون إلى formazan الحمراء الملونة من قبل dehydrogenases في الميتوكوندريا من الخلايا الحية، ولكن لا يمكن تغيير اللون من الخلايا الميتة (الشكل 5B). هذا الأسلوب التحقق من حالة نمو الخلايا في الثقافة السائلة.
إنشاء ثقافة تعليق خلية الشاي يوفر منصة بحثية سهلة في المختبر لدراسة الأيض والأيض من المبيدات الحشرية المختلفة. مستقلة عن الموسم والطقس، يمكن التعامل مع الثقافات تعليق الخلية مع المبيدات الحشرية المختلفة، وتركيزات مختلفة من العنصر النشط، ولأطوال مختلفة من الزمن. وكانت الأيض المنتجة في الثقافات تعليق خلية الشاي مماثلة لتلك المستخرجة من النباتات سليمة (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن سبعة المستقلبات من الثياميثوكسام واثنين من الأيض من dimethoate في ثقافة تعليق خلية الشاي، ولكن اثنين فقط من الأيض من الثياميثوكسام وواحد لdimethoate في النباتات السليمة المعالجة (الشكل التكميلي 1، الشكل التكميلي 2، والشكل التكميلي 3). قد يكون هذا بسبب استخراج أسهل من الخلايا دون بشرة شمعية, مركبات أقل من الشاي تتداخل مع نتائج قياس الطيف الشامل (تأثير المصفوفة), أو أبسط لمحة المستقلب من خلايا الشاي مقارنة مع النبات كله.
وأظهرت النتائج أن الثياميثوكسام كان أكثر سهولة استقلاب من قبل خلية الشاي مقارنة مع neonicotinoids الثلاثة الأخرى (الشكلالتكميلي 4). تم استقلاب كل من الفوسفات العضوي (الديميثودات وomethoate) أسرع من neonicotinoids. وتظهر هذه النتائج تنوع المسارات الأيضية والتنظيم الأيضي في خلية الشاي، والتي تحتاج إلى مزيد من الدراسة.
إن استخدام النباتات السليمة لدراسة عملية التمثيل الغذائي للمبيدات الحشرية ولتحديد الأيض المبيد اتِّجِب صعوبات عديدة، بما في ذلك الحواجز التي تحول دون امتصاص المركبات الأولية والمركبة المنفَزة في المصنع30،ونقلها لمسافات طويلة. يمكن لثقافات تعليق الخلية ليس فقط حل هذه المشكلة، ولكن أيضا تقليل التداخل مصفوفة في تحليل العينة مقارنة مع استخراج من الأوراق الطازجة24. أثبت هذا البحث أن ثقافة تعليق خلية الشاي هي منصة فعالة لدراسة عملية التمثيل الغذائي لمركبات xenobiotic في مصنع الشاي. ويمكن أن يكون بمثابة وسيلة لدراسة التمثيل الغذائي للxenobiotics في النباتات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحوث والتطوير الرئيسي (2016YFD02009000) للصين، والمؤسسة العلمية الطبيعية الوطنية في الصين (رقم 31772076 ورقم 31270728)، والمؤسسة الصينية للعلوم ما بعد الدكتوراه (2018M630700)، والصندوق المفتوح للعلوم مختبر الدولة الرئيسية لبيولوجيا مصنع الشاي واستخدامها (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W.
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
