Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

Este trabajo presenta un protocolo para establecer un cultivo de suspensión celular derivado del té (Camellia sinensis L.) hojas que se pueden utilizar para estudiar el metabolismo de los compuestos externos que pueden ser tomados por toda la planta, como insecticidas.

Abstract

Se desarrolló una plataforma para estudiar el metabolismo de insecticidas utilizando tejidos in vitro de la planta de té. Las hojas de las plantas de té estéril fueron inducidas a formar callos sueltos en murashige y Skoog (MS) medios basales con las hormonas vegetales 2,4-ácido diclorofenoxacetico (2,4-D, 1,0 mg L-1) y kinetina (KT, 0,1 mg L-1). Callus se formó después de 3 o 4 rondas de subcultura, cada una con una duración de 28 días. El callo suelto (alrededor de 3 g) se inoculó en medios líquidos B5 que contenían las mismas hormonas vegetales y se cultivaba en una incubadora de temblores (120 rpm) en la oscuridad a 25 oC. Después de 3 x 4 subcultivos, se estableció una suspensión celular derivada de la hoja de té en una relación subcultal que oscila entre 1:1 y 1:2 (líquido madre de suspensión: medio fresco). Usando esta plataforma, se añadieron seis insecticidas (5 g de ml-1 cada tiametoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimetoato y omethoato) al cultivo de suspensión celular derivado de la hoja de té. El metabolismo de los insecticidas fue rastreado mediante cromatografía líquida y cromatografía de gases. Para validar la utilidad del cultivo de suspensión de células de té, los metabolitos de tiametoxano y dimetoato presentes en cultivos celulares tratados y plantas intactas se compararon utilizando espectrometría de masas. En los cultivos de células de té tratadas, se encontraron siete metabolitos de tiametoxano y dos metabolitos de dimetoato, mientras que en las plantas intactas tratadas, sólo se encontraron dos metabolitos de tiametoxam y uno de dimetoato. El uso de una suspensión celular simplificó el análisis metabólico en comparación con el uso de plantas de té intactas, especialmente para una matriz difícil como el té.

Introduction

El té es una de las bebidas no alcohólicas más consumidas en el mundo1,2. El té se produce a partir de las hojas y cogollos de la perley perenne Camellia sinensis L.Las plantas de té se cultivan en vastas plantaciones y son susceptibles a numerosas plagas de insectos 3,4. Los insecticidas organofosforados y neonicotinoides se utilizan a menudo como insecticidas sistémicos5 para proteger las plantas de té de plagas como las moscas blancas, las tolvas de hojas y algunas especies de lepidópteros6,7. Después de la aplicación, estos insecticidas son absorbidos o translocados en la planta. Dentro de la planta, estos insecticidas sistémicos pueden transformarse a través de hidrólisis, oxidación o reacciones de reducción por enzimas vegetales. Estos productos de transformación pueden ser más polares y menos tóxicos que los compuestos principales. Sin embargo, para algunos organofosfatos, las bioactividades de algunos productos son más altas. Por ejemplo, el acefato se metaboliza en el metamidofos más tóxico8,9, y el dimetoato en el omethoato10,11. Por lo tanto, los estudios metabólicos de las plantas son importantes para determinar el destino de un pesticida dentro de una planta12.

Se ha demostrado que los cultivos de tejidos vegetales son una plataforma útil para investigar el metabolismo de los plaguicidas, con los metabolitos identificados similares a los que se encuentran en las plantas intactas13,14,15. El uso de cultivos tisulares, particularmente cultivos de suspensión celular, tiene varias ventajas. En primer lugar, los experimentos pueden llevarse a cabo sin microorganismos, evitando así la interferencia de la transformación o degradación de plaguicidas por microbios. En segundo lugar, el cultivo de tejidos proporciona materiales consistentes para su uso en cualquier momento. En tercer lugar, los metabolitos son más fáciles de extraer de cultivos de tejidos que de plantas intactas, y los cultivos de tejidos a menudo tienen menos compuestos intercaladores y menor complejidad de los compuestos. Por último, los cultivos de tejidos se pueden utilizar más fácilmente para comparar una serie de metabolismo de pesticidas en un solo experimento16.

En este estudio, se estableció con éxito una suspensión celular derivada de las hojas de la planta de té cultivada estérilmente. El cultivo de suspensión de células de té se utilizó entonces para comparar los comportamientos de disipación de seis insecticidas sistémicos.

Este protocolo detallado está destinado a proporcionar alguna orientación para que los investigadores puedan establecer una plataforma de cultivo de tejido vegetal útil para estudiar el destino metabólico de los xenobióticos en el té.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultura callo del té

NOTA: Las hojas estériles se derivaron de líneas de plantlet cultivadas in vitro desarrolladas por primera vez en el grupo de investigación17. Todos los procedimientos hasta la sección 5 se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar estéril, excepto por el tiempo de cultivo en una incubadora.

  1. Ajustar el pH de los dos medios (Murashige y Skoog [MS] medio basal y medio líquido B5 de Gamborg) a 5.8 antes de autoclave (121 oC, 20 min).
  2. Cortar a lo largo de la vena media de una hoja estéril usando tijeras, y luego subdividir cada mitad en pequeños trozos de aproximadamente 0,3 cm x 0,3 cm en una placa de petri.
  3. Coloque los explantes estériles (las piezas de hoja pequeña) en los medios basales de EM que contengan las hormonas vegetales 2,4-D (1,0 mg L-1) y KT (0,1 mg L-1). Se pueden colocar seis explantas en un matraz de 300 ml que contiene 100 ml de medios basales de LaM.
  4. Cultivo de la hoja anterior explantes a una temperatura constante de 25 oC en la oscuridad. Después de 28 días, seleccione la primera generación de callo inducido y transfiera al matraz fresco (una subcultura). Adquiere el callo suelto y friable después de 3x4 subculturas.

2. Cultivo de suspensión de células de té

  1. Corte los callos vigorosos, friables y sueltos del medio sólido en trozos pequeños (rango aquí 0,5 x 2 mm) utilizando una cuchilla quirúrgica estéril en condiciones estériles.
  2. Pesar alrededor de 3 g de los pequeños trozos de callo. Colocar el callo en un matraz de 150 ml que contenga 20 ml de medios líquidos B5 complementados con 2,4-D (1,0 mg L-1) y KT (0,1 mg L-1).
  3. Cultivar la suspensión de la célula líquida a una temperatura constante (25 o1 oC) en una incubadora de agitación a 120 rpm en la oscuridad.
  4. Después de 7 a 10 días de cultivo, retire los frascos de cultivo y déjelos reposar durante unos minutos.
  5. Tome todo el sobrenadante como material de semilla para el subcultivo al medio fresco (relación de subcultivo de líquido madre de suspensión a medio fresco oscilado entre 1:1 y 1:2). Retire los callos precipitados y grandes.
  6. Obtenga el cultivo final de suspensión celular bien crecido después de 3 x 4 ciclos de subcultivo de 28 días cada uno.

3. Ensayo de cloruro de trifenilo tetrazolium de viabilidad celular

  1. Matar una muestra de células vivas a 100 oC durante 10 minutos como célula de control antes de la mancha de viabilidad.
  2. Centrifugar todo el cultivo de suspensión celular durante 8 min a 6000 x g. Retire el sobrenadante antes de suspender las células en 2,5 ml de tampón de solución salina con fosfato (PBS) (pH 7.3), y agítelo durante 1 min a mano.
  3. Añadir 2,5 ml de la solución de cloruro de tetrazolium de trifenilo (TTC) al 0,4%, y agitar a mano de nuevo.
  4. Incubar la mezcla durante 1 h en una incubadora de pie (30oC).

4. Tratamiento y muestreo de cultivos de suspensión de células de té con insecticidas

  1. Añadir una alícuota de 400 ml de solución de stock esterilizada por filtro (500 g de ml-1) de cuatro neonicotinoides (tiametoxam, acetamiprid, imidacloprid e imidaclothiz) o dos organofosfatos (dimetoato y omethoato) en los cultivos de suspensión celular, Respectivamente.
    NOTA: Si el objetivo es comparar los comportamientos xenobióticos, utilice el mismo lote madre de suspensiones celulares para probar los diferentes compuestos.
  2. Cultivo de las muestras de las suspensiones celulares con insecticidas a temperatura constante (25 o1 oC) y velocidad de incubadora de agitación (120 rpm). Tome las muestras (ver paso 4.3 o 4.4) en 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 y 75 días.
  3. Para probar una muestra que contenga un neonicotinoide, retire una alícuota de 1 ml del cultivo celular homogéneo, colóquela en un tubo centrífugo de plástico de 1,5 ml y centrífuga a 4000 x g durante 2 min.
    1. Pase los sobrenatantes a través de una membrana de filtro de tamaño poro de 0,22 m antes del análisis por cromatografía líquida-ultravioleta de alto rendimiento (HPLC-UV) y cromatografía líquida de ultra alto rendimiento,cuadrúpo de tiempo de vuelo (UPLC-QTOF) de masa espectrometría (Tablade materiales).
  4. Para analizar una muestra que contenga un organofosfato, retire una alícuota de 500 l del cultivo celular y colóquela en un tubo centrífugo de 35 ml o en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml (prepare la última muestra como la de neonicotinoide).
    1. Añadir 0,1 g de cloruro sódico y 5 ml de acetona/acetato de etilo (3:7, v/v) en el tubo centrífugo de 35 ml de las muestras de 500 ml.
    2. Vortex las mezclas durante 1 min, y luego dejar que descansen durante 10 min.
    3. Tomar 2,5 ml del sobrenadante en un tubo de vidrio de 10 ml y evaporar hasta casi secarlo utilizando un evaporador de nitrógeno a 40 oC.
    4. Disolver el residuo con 1 ml de acetona, vórtice durante 1 min, pasarlo a través de una membrana de filtro de 0,22 m antes de su análisis por cromatografía de gases-detector fotométrico de llama (GC-FPD).

5. Preparación de muestras de planta de té intacta con insecticidas

NOTA: El ensayo intacto de la planta de té se llevó a cabo en un sistema hidropónico utilizando plántulas de té cultivadas en 50 ml de una solución nutritiva (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B 3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, y 10 Al3+, en mg L-1)18. Un invernadero experimental estaba bajo un ciclo de luz-oscuridad (12 h de luz y 12 h de oscuridad) a 20oC en la Universidad Agrícola de Anhui.

  1. Poner cinco plantas en una olla de plástico de 4 L durante 15 días.
  2. Añadir 0 ppm (control) o 100 ppm de tiametoxam o dimetoato en macetas de plástico, respectivamente.
  3. Preparar la muestra de planta intacta de acuerdo con el método anterior, excepto para el presoaking19,y luego analizar con espectrometría de masas para un espectro de masas preciso.

6. Análisis de instrumentos

  1. Análisis de HPLC del comportamiento metabólico de los neonicotinoides
    1. Utilice un HPLC-UV (Tablade Materiales)para detectar el contenido y los productos metabólicos de tiametoxam y acetamiprid a una longitud de onda de 254 nm, y de imidacloprid e imidaclothiz a 270 nm en muestras de la sección 4.3.
      NOTA: La condición HPLC-UV fue la misma que la del estudio anterior19.
  2. Análisis GC del comportamiento metabólico de los organofosfatos
    1. Detectar el contenido de dimetoato y omethoato en muestras de la sección 4.4 por un GC-FPD utilizando una columna quiral (Tabla de Materiales).
    2. Utilice nitrógeno como gas portador y ajuste el caudalen 1,0 ml mín.1 .
    3. Ajuste la temperatura inicial a 120 oC, y sosténla durante 5 min. Aumente la temperatura a 150 oC a 30 oC mín.-1 y sosténladla durante 3 min. Por último, aumente a 210 oC a 30 oC min-1 y luego sostenga durante 5 min.
    4. Ajuste la temperatura de la inyección a 200 oC en modo sin divisiones; Ajuste la temperatura del detector a 250 oC.
    5. Ajuste el volumen de la inyección a 1 l.
  3. Análisis UPLC-QTOF de los metabolitos insecticidas en el cultivo celular
    1. Detectar los metabolitos de los insecticidas en el cultivo celular (muestras de la sección 4.3) utilizando UPLC-QTOF con una columna C18 (Tablade materiales).
    2. Establezca el caudal en 0,2 ml mín.:mín.1. Ajuste el volumen de la inyección a 10 s.
    3. Para las muestras tratadas con neonicotinoides, establezca la fase móvil inicial en 85% A (5 mM de agua formatea de amonio) y 15% B (acetonitrilo). Más de 10 min, aumentar la fase móvil B a 38% y volver a 15% sobre 1 min, mantener durante 9 min.
    4. Para las muestras tratadas con organofosfato, establezca la fase móvil inicial en 55% A (0,1% agua de ácido fórmico) y 45% B (acetonitrilo). Más de 5 min, aumentar la fase móvil B a 70%, luego volver al 45% de B sobre 0,5 min, mantener durante 2,5 min.
    5. Establezca los parámetros de funcionamiento QTOF de la siguiente manera: temperatura del gas, 325 oC; gas de secado (nitrógeno), 10 L min-1; temperatura del gas de la vaina, 350 oC; flujo de gas de vaina, 11 L min-1; tensión capilar, 4000 V; tensión de la boquilla, 1000 V; voltaje fragmentador, 100 V para insecticidas neonicotinoides o 110 V para insecticidas organofosforados; voltaje de skimmer, 65 V; en modo iónico positivo.
    6. Ajuste el instrumento al espectro de escaneado completo y al modo MS/MS objetivo.
    7. Procesar los datos utilizando herramientas de masa precisas; Inferir los metabolitos sin productos estándar de la anotación MS/MS, así como la literatura12,15,20,21,22.
  4. Análisis UPLC-Orbitrap de los metabolitos insecticidas en extracto de planta intacto
    1. Detectar los metabolitos de los insecticidas en el extracto de planta intacto utilizando espectrometría de masas UPLC-Orbitrap (Tabla de Materiales).
    2. Establezca los parámetros de funcionamiento de la espectrometría de masas (Tablade materiales)de la siguiente manera: presión de gas de vaina, 35 arb; temperatura del gas, 300 oC; tensión de la boquilla, 3.5 KV; temperatura capilar, 350oC.
    3. Establezca los programas de elución como los anteriores (pasos 6.3.3 y 6.3.4) para el análisis UPLC-QTOF del cultivo celular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La inducción de callos a partir de hojas cosechadas a partir de árboles de té cultivados en el campo y de hojas extirpadas de plantas de té cultivadas in vitro en un ambiente estéril se comparó midiendo la contaminación, el pardeamiento y la inducción después de 28 días de cultivo en medios de aseo ( Figura 1A). El crecimiento del callo se registró en 20, 37, 62 y 90 días de cultivo (Figura1B). El callo derivado de las hojas cultivadas in vitro mostró un crecimiento más vigoroso que el callo derivado de las hojas cultivadas en el campo durante los 90 días de cultivo. El callo de las hojas estériles era de color amarillo brillante, mientras que el callo de las hojas cultivadas en el campo era marrón (Figura1B).

A una concentración de 1,0 mg L-1 de 2,4-D23,se optimizó la concentración de KT. A 0.05 mg L-1 KT, la tasa de crecimiento callo era lenta, la textura era un poco compacta, y el callo era de color blanco (Figura2C); a 0,1 mg de concentración de L-1 KT, la tasa de crecimiento del callo fue la más alta, hasta 61,5% (Figura2A),la textura era suelta, y el color era amarillento (Figura2C); cuando el KT se incrementó a 0,5 mg L-1, el callo era compacto e irregular y marrón en el centro (Figura2C). Después de seleccionar la concentración de KT, se estudió más la concentración de 2,4-D. En una combinación de 1 mg L-1 2,4-D y 0,1 mg L-1 KT, la tasa de crecimiento de callos fue la más alta, alcanzando 46,9%, y la aparición del callo fue la mejor (Figura2B,D).

Después de la 2a subcultura en medios sólidos, más de la mitad de la superficie de cada hoja extirpada fue cubierta por calnos en crecimiento (Figura3A). Después de la subcultura 4, las secciones de las hojas estaban completamente cubiertas por el callo. Después de la 5a subcultura, la textura del callo comenzó a ser compacta con algunas manchas blancas y marrones en la parte inferior.

Cuando el ciclo de subcultivo duraba 21 días (Figura3B),el callo era vigoroso, pero no se había alcanzado la mayor cantidad de crecimiento, lo que indicaque que la subcultura frecuente resultaría en menos cantidad de callos. Cuando el ciclo de subcultura duraba 28 días, el callo había crecido vigorosamente, el color era de color amarillento y la textura era suelta. Después de 35 días, el callo comenzó a dorarse desde el centro. El callo estaba en el peor estado, con un color marrón profundo y ya no creciendo, a los 42 días.

Se compararon dos tipos de medios líquidos por sus efectos en el crecimiento del callo y el color de la suspensión celular (Figura4). Se probaron tres proporciones diferentes de líquido madre a volumen total de líquido de cultivo. Durante los 75 días de cultivo, la densidad celular aumentó gradualmente en cultivos iniciados en las tres proporciones. La proporción de células de 15 g en medios frescos de 40 ml (v/v) produjo un valor de densidad óptica (OD) significativamente superior al de 4 g en 40 ml (v/v) y 6 g en 40 ml (v/v) (figura5A). Después de 4 ciclos de subcultivo de 28 días cada uno, se estableció con éxito un sistema de suspensión de células de té a partir de caldo de té estéril en medios líquidos B5 (Figura6).

Figure 1
Figura 1 : Comparación de la inducción de callos a partir de hojas recogidas y hojas estériles de plantlet. (A) Comparación de la inducción del callo a partir de hojas cosechadas de plantas de té cultivadas en plantaciones y de hojas exhaladas de plantas estériles cultivadas a nivel especial. Se observaron explantas para la contaminación, el pardeamiento y la inducción del caldo. (B) Comparación del crecimiento de callos de hojas derivadas de plantas de té cultivadas en plantaciones (conjunto 1) y plantas estériles de cultivo in vitro (conjunto 2): Las fotografías fueron en días diferentes: 20 (paneles a); 37b ); 62(c); y 90 (d). Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : La tasa de crecimiento y el estado de crecimiento del callo derivado de la hoja de té bajo diferentes concentraciones de hormona vegetal. La tasa de crecimiento (A) y el estado de crecimiento (C) de callo derivado de la hoja de té bajo diferentes concentraciones de KT y 1 mg L-1 2,4-D; La tasa de crecimiento (B) y el estado de crecimiento (D) de callo bajo diferentes concentraciones de 2,4-D y 0,5 mg L-1 KT. Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Estado del callo después de diferentes números de ciclos de subcultivo (A) y diferentes longitudes de ciclos de subcultivo (B). Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Influencia de diferentes tipos de medios en el crecimiento del callo en el sistema de cultivo de suspensión líquida. (A) Medio B5. (B) Medio MS. Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Los valores de densidad óptica y la tinción TTC. (A) El valor OD680 de la suspensión celular comenzó en diferentes proporciones de 0 a 75 días; (B) La tinción TTC de células vivas y de control. Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : El proceso de establecimiento de un cultivo de suspensión de células de té a temperatura constante (25 o1 oC) en una incubadora oscura. Cultivo estéril de las plantas de té como fuente de explantación de hojas (a); Hoja de té inoculada en el medio de EM con 2,4-D (1,0 mg L-1) y KT (0,1 mg L-1) (b); Callus cultivado inicial después de 28 días (c); Callus adecuado para suspensión celular después de 4 ciclos de subcultivo de 28 días cada uno (d); Los pasos restantes fueron a la misma temperatura pero a una velocidad constante de 120 rpm en una incubadora de agitación: Callus inoculado en medio B5 durante 7 a 10 días (e); Suspensión de celda sembrada después de retirar el callo precipitado y grande (f); El subcultivo de la suspensión celular después de 1 ciclo de 28 días (g); Suspensión celular madura después de 3-4 ciclos de subcultivo de 28 días cada uno (h). Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura Suplementaria 1: El metabolismo de 5 g/ml de 6 insecticidas en el cultivo de suspensión de células de té y en medios (CK) incubados a temperatura constante (25 o1 oC) y velocidad de incubadora de agitación (120 rpm) durante 75 días. Tiametoxán (A), imidacloprid (B), acetamiprid (C), imidaclothiz (D), dimetoato (E1) y omethoato (F); (E2) Producción a lo largo del tiempo del metabolito del dimetoato (omethoato) producido en el cultivo celular y los medios tratados con dimetoato. Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 2: Cromatografías iónicas totales (TIC) de los extractos del cultivo celular de control no tratado, cultivo celular tratado con tiametoxam, medios tratados con tiametoxam (sin células) después de 75 días. Los picos 1-5, 7 y 8 fueron metabolitos de tiametoxam y el pico 6 fue tiametoxam (A); TICs de los extractos del cultivo celular tratado con dimetoato, medios tratados con dimetoato (sin células), y células de control no tratadas después de 60 días. Los picos 1 y 2 fueron metabolitos de dimetoato yel pico 3 fue dimetoato (B); TICs de los extractos de plantas tratadas con tiametoxam (superior) y no tratadas (inferior) intactas (C); TICs de los extractos de plantas tratadas con dimetoato (superior) y no tratadas (inferiores) intactas (D); El metabolito del dimetoato a 1,86 min en plantas intactas (D1); No se detectan compuestos a 1,86 min en plantas no tratadas (D2). Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 3: La espectrometría de masas secundaria utilizando UPLC-QTOF de picos derivados de cultivos tratados con (A) tiametoxam y (B) dimetoato. Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 4: La espectrometría de masas secundaria utilizando Q-Exactive de picos derivados de plantas intactas tratadas con tiametoxam (A1, A2 y A3) y dimetoato (B1 y B2). Esta cifra ha sido modificada de Jiao et al.24. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este artículo presenta el proceso detallado de establecer un modelo de metabolismo de pesticidas en el tejido vegetal del té, incluyendo la selección de explantas, la determinación de la viabilidad celular y el establecimiento de un cultivo de suspensión de células de té con alto nivel metabólico Actividad. Cualquier parte de un tejido vegetal podría utilizarse para iniciar el callo en un ambiente esterilizado25. Las hojas de té fueron elegidas para la iniciación del callo en este estudio, no sólo porque las hojas tienden a estar menos contaminadas que las partes bajo tierra, sino también porque son la parte comestible del cultivo y el objetivo principal de la aplicación de pesticidas.

En este estudio, se comparó la tasa de inducción y el estado de crecimiento del callo a partir de hojas recogidas del campo y de hojas extirpadas de un plantlet estéril cultivado in vitro. Las hojas estériles tenían tasas mucho más bajas de pardeamiento y contaminación y una mayor tasa de inducción en comparación con las hojas cultivadas en el campo. Esto fue probable porque las hojas de plantas cultivadas en el campo no sólo se sometieron a esterilización superficial utilizando etanol y mercurio, sino también un cambio en el ambiente de crecimiento, mientras que las hojas estériles se cultivaban en un ambiente estéril y podían ser utilizadas directamente sin esterilización adicional. Además, el caldo derivado de las plantas estériles y cultivadas in vitro mostró un crecimiento más vigoroso que las hojas cultivadas en el campo durante los 90 días de cultivo. Las hojas de las plantas estériles eran más adecuadas para la inducción del callo de té, no sólo por su alta inducción de callos y bajas tasas de contaminación, sino también por el menor tiempo de pretratamiento y la independencia de factores estacionales.

Para cultivar callos sueltos y friables, los parámetros cruciales, principalmente los niveles reguladores de crecimiento de las plantas y la duración y el número de ciclos de subcultivo, deben optimizarse25. 2,4-D puede promover eficazmente la inducción y el crecimiento del callo y es la hormona más utilizada en la cultura del callo26. Los tiempos de subcultura y la duración del ciclo de subcultura también son importantes para la cultura del callo25. Después de 2 a 4 subculturas de 28 días de cada ciclo, el callo tenía una textura suelta con un color amarillento y sin color marrón. Los experimentos de optimización determinaron que el mejor protocolo de inducción callus era colocar explantes de hojas de plantitas estériles en medios basales de EM que contienen 1 mg L-1 2,4-D y 0,1 mg L-1 KT y transferir el explantón/callus cada 28 días para un total de 4 ciclos de subcultivo. Este protocolo inició callos sueltos y friables que eran adecuados para el inicio de una suspensión celular.

En el cultivo de tejido vegetal, el medio sólido utilizado para el crecimiento del callo a menudo se puede utilizar para el cultivo de suspensión celular en forma líquida23. Mientras que, el té entra en ser grandes cantidades de polifenoles en el medio basal de la MUS que contienen una alta concentración de sales inorgánicas, lo que resulta en el caldo dorado27,28. En este estudio, ambos medios B5 líquidos y medios de SM fueron probados. Las tasas medias de crecimiento no se encontraron ninguna diferencia significativa entre los dos cultivos (16,66% en medios basales B5 y 15,77% en medios basales de EM; Figura 4). Sin embargo, los callos eran marrones en los medios basales de la MUS. Por lo tanto, los medios basales B5 fueron seleccionados en el método propuesto.

El oxígeno es importante para el crecimiento y el metabolismo de las células vegetales. En el cultivo líquido, un volumen excesivo de líquido disminuirá la concentración de oxígeno e inhibirá el crecimiento celular, mientras que demasiado poco líquido también inhibe el crecimiento celular25. Se probaron varias proporciones de líquido a volumen de matraz (líquido ml: matraz de ml). Basado en el peso seco del crecimiento celular después de 21 d, las proporciones de matraz líquido: se clasificaron de la siguiente manera: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. En este estudio, se seleccionaron 40 ml de líquido de cultivo en un matraz de 150 ml (40 ml: 150 ml) de acuerdo con el aspecto de la suspensión celular observada a simple vista.

Las células vegetales no pueden crecer bien cuando la densidad celular es demasiado alta o demasiado baja. Por lo tanto, la proporción del cultivo de suspensión de células madre a medio fresco en el momento de la subcultura afecta el potencial de crecimiento de las células29. Este estudio utilizó el valor De OD del cultivo homogéneo de suspensión celular para representar la cantidad de crecimiento celular. La inoculación con 15 g de líquido madre en 40 ml del volumen total de líquido de cultivo (v/v) fue adecuada para el crecimiento celular. La relación de subcultivo sequivalizó entre 1:1 y 1:2 (líquido madre de suspensión: medio fresco).

La viabilidad celular dentro del cultivo de suspensión de células de té fue probada por tinción TTC. El compuesto TTC incoloro se puede convertir en el formazán de color rojo por deshidrogenasas en las mitocondrias de las células vivas, pero el color no se puede cambiar de células muertas (Figura5B). Este método verificó el estado de crecimiento de las células en el cultivo líquido.

El establecimiento de un cultivo de suspensión de células de té proporciona una plataforma de investigación in vitro fácil para el estudio del metabolismo y metabolitos de diferentes pesticidas. Independientemente de la temporada y el clima, los cultivos de suspensión celular pueden tratarse con diferentes pesticidas, diferentes concentraciones de ingrediente activo y para diferentes períodos de tiempo. Los metabolitos producidos en los cultivos de suspensión de células de té fueron similares a los extraídos de plantas intactas (FiguraSuplementaria 1 y Figura Suplementaria 2). Curiosamente, se detectaron siete metabolitos de tiametoxam y dos metabolitos de dimetoato en el cultivo de suspensión de células de té, pero sólo dos metabolitos de tiametoxam y uno para el dimetoato en plantas tratadas intactas (FiguraSuplementaria 1, Figura suplementaria 2, y Figura suplementaria 3). Esto puede deberse a la extracción más fácil de células sin cutícula cerosa, menos compuestos del té que interfieren con los resultados de la espectrometría de masas (el efecto de matriz), o el perfil de metabolito más simple de las células de té en comparación con toda la planta.

Los resultados mostraron que el tiametoxam fue metabolizado más fácilmente por la célula del té en comparación con los otros tres neonicotinoides (FiguraSuplementaria 4). Ambos organofosfatos (dimetoato y omethoato) se metabolizaron más rápido que los neonicotinoides. Estos resultados muestran la diversidad de las vías metabólicas y de la regulación metabólica en la célula del té, que necesitan ser estudiados más.

El uso de plantas intactas para estudiar el metabolismo de los insecticidas e identificar metabolitos insecticidas presenta numerosas dificultades, incluyendo barreras a la absorción y transporte a larga distancia de compuestos iniciales y de degradación dentro de la planta30. Los cultivos de suspensión celular no sólo pudieron resolver este problema, sino también reducir la interferencia de la matriz en el análisis de muestras en comparación con el extracto de hojas frescas24. Esta investigación demostró que los cultivos de suspensión de células de té son una plataforma eficaz para estudiar el metabolismo de los compuestos xenobióticos en la planta de té. Se puede servir como un modo para estudiar el metabolismo de los xenobióticos en otras plantas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave (2016YFD0200900) de China, la Fundación Científica Natural Nacional de China (No 31772076 y No 31270728), China Postdoctoral Foundation (2018M630700) y Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Laboratorio Clave Estatal de Biología y Utilización de Plantas de Té (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
  2. Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
  3. Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
  4. Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
  5. Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
  6. Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
  7. Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
  8. Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
  9. Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
  10. Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
  11. Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
  12. Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
  13. Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
  14. Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
  15. Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
  16. Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
  17. Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
  18. Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
  19. Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
  20. Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
  21. Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
  22. Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
  23. Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
  24. Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
  25. Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
  26. Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
  27. Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
  28. Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
  29. Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
  30. Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).

Tags

Bioquímica Número 148 suspensión de células de té planta de té intacta insecticida metabolismo de plantas metabolismo espectrometría de masas
Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (<em>Camellia Sinensis </em>L.) Hojas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J.,… More

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter