Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles

Summary

Ce travail présente un protocole pour établir une culture de suspension cellulaire dérivée de feuilles de thé(Camellia sinensis L.) qui peut être utilisée pour étudier le métabolisme des composés externes qui peuvent être pris par l'ensemble de la plante, tels que les insecticides.

Abstract

Une plate-forme pour étudier le métabolisme des insecticides à l'aide de tissus in vitro de la plante de thé a été développée. Les feuilles des plantulettes stériles de thé ont été induites pour former le callus lâche sur le média basal de Murashige et de Skoog (MS) avec les hormones végétales 2,4-dichlorophenoxyacetic acide (2,4-D, 1.0 mg L^-1) et kinetin (KT, 0.1 mg L^-1). Callus s'est formé après 3 ou 4 tours de sublituring, chacun d'une durée de 28 jours. Le callus lâche (environ 3 g) a ensuite été inoculé dans le support liquide B5 contenant les mêmes hormones végétales et a été cultivé dans un incubateur secouant (120 tr/min) dans l'obscurité à 25 à 1 oC. Après 3-4 sous-cultures, une suspension cellulaire dérivée de la feuille de thé a été établie à un rapport de sous-culture allant de 1:1 à 1:2 (suspension mère liquide: milieu frais). À l'aide de cette plate-forme, six insecticides (5 g mL^-1 chaque thiaméthoxam, imidaclopride, acétamipride, imidaclothiz, diméthoate et omethoate) ont été ajoutés dans la culture de suspension cellulaire dérivée des feuilles de thé. Le métabolisme des insecticides a été suivi à l'aide de chromatographie liquide et de chromatographie gazeuse. Pour valider l'utilité de la culture de suspension de cellules de thé, les métabolites du thiaméthoxan et du diméthoate présents dans les cultures cellulaires traitées et les plantes intactes ont été comparés utilisant la spectrométrie de masse. Dans les cultures traitées de cellules de thé, sept métabolites du thiaméthoxan et deux métabolites du diméthoate ont été trouvés, tandis que dans les usines intactes traitées, seulement deux métabolites du thiamethoxam et un de dimethoate ont été trouvés. L'utilisation d'une suspension cellulaire a simplifié l'analyse métabolique par rapport à l'utilisation de plantes de thé intactes, en particulier pour une matrice difficile comme le thé.

Introduction

Le thé est l'une des boissons non alcoolisées les plus consommées dans le monde^1,2. Le thé est produit à partir des feuilles et des bourgeons de la forêt use use vivace Camellia sinensis L. Les plantes à thé sont cultivées dans de vastes plantations et sont sensibles à de nombreux insectes nuisibles^3,4. Les insecticides organophosphorés et néonicotinoïdes sont souvent utilisés comme insecticides systémiques⁵ pour protéger les plants de thé contre les ravageurs tels que les mouches blanches, les larves de feuilles et cer....

Protocol

1. Culture de callus de thé

REMARQUE : Les feuilles stériles ont été dérivées de lignées végétales cultivées in vitro développées pour la première fois dans le groupe de recherche¹⁷. Toutes les procédures jusqu'à la section 5 ont été effectuées dans une hotte d'écoulement laminaire stérile, à l'exception du temps de culture dans un incubateur.

1. Ajuster le pH des deux supports (le milieu basal de Murashige et Skoog [MS] et le milieu liquide B5 de Gamborg) à 5,8 avant l'autoclatage (121 oC, 20 min).
2. Couper le long de la veine moyenne d'une feuille stérile à l'aide de ciseaux, puis subdiviser chaque m....

Results

L'induction du calus à partir de feuilles récoltées dans des arbres à thé cultivés en campagne et à partir de feuilles extraites de plantlettes de thé cultivées in vitro dans un environnement stérile a été comparée en mesurant la contamination, le brunissement et l'induction après 28 jours de culture sur les milieux de La SP ( Figure 1A). La croissance de Callus a été enregistrée à 20, 37, 62 et 90 jours de culture (figure 1B). L.......

Discussion

Cet article présente le processus détaillé d'établir un modèle du métabolisme de pesticide dans le tissu de plante de thé, y compris la sélection des explants, la détermination de la viabilité de cellules, et l'établissement d'une culture de suspension de cellules de thé avec le métabolisme élevé activité. Toutes les parties d'un tissu végétal pourraient être utilisées pour initier le callus dans un environnement stérilisé²⁵. Les feuilles de thé ont été choisies pour l'initiation du calus dans cet.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acétamipride (99,8 %)	Dr. Ehrenstorfer	46717	N° CAS : 135410-20-7
Acétonitrile (CAN, 99,9 %)	Tedia	AS1122-801	N° CAS : 75-05-8
Agar	Solarbio Science & Technologie	A8190	N° CAS : 9002-18-0
Clothianidine (99,8 %)	Dr. Ehrenstorfer	525	N° CAS : 210880-92-5
Diméthoate (98,5 %)	Dr. Ehrenstorfer	109217	N° CAS : 60-51-5
Imidaclopride (99,8 %)	Dr. Ehrenstorfer	91029	N° CAS : 138261-41-3
Imidaclothiz (99,5 %)	Toronto Research Chemical	I275000	N° CAS : 105843-36-5
Kinétine (KT, >98,0 %)	Solarbio Science & Technologie	K8010	N° CAS : 525-79-1
Ométhoate (98,5 %)	Dr. Ehrenstorfer	105491	N° CAS : 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)	Solarbio Science & Technologie	P8070	N° CAS : 25249-54-1
Saccharose	Tocris Bioscience	5511	N° CAS : 57-50-1
Thiaméthoxame (99,8 %)	Dr. Ehrenstorfer	20625	N° CAS : 153719-23-4
Chlorure de triphényltétrazolium (TTC, 98,0 %)	Solarbio Science & Technologie	T8170	N° CAS : 298-96-4
Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D, >98,0 %)	Guangzhou Saiguo Biotech	D8100	N° CAS : 94-75-7
colonne chirale	Agilent CYCLOSIL-B	112-6632	Colonne de chromatographie (30 m × ; 0,25 mm & times ; 0,25 &mu ; m)
Chromatographie en phase gazeuse (GC)	Shimadu	2010-Plus	couplé à un détecteur photométrique de flamme (FPD)  ;   ;
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)	Agilent	1260	Couplé à un détecteur d’ultraviolets (UV)
Colonne HSS T3 C18	Waters	186003539	Colonne de chromatographie (100 mm × ; 2.1 mm & times ; 1.8 &mu ; m)
Chromatographie liquide à ultra-hautes performances (UPLC)	Spectromètre		masse à temps de vol quadripolaire en tandem (QTOF)
Chromatographie liquide à ultra-hautes performances (UPLC)	Thermo Scientific	Ultimate 3000-Q Exactive Focus	connecté à un spectromètre de masse Orbitrap