Summary
이 연구는 살충제 와 같은 전체 식물에 의해 채택될 수 있는 외부 화합물의 대사를 연구하는데 사용될 수 있는 차(동백나무)에서 유래된 세포 현탁액 배양을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
차 공장의 체외 조직을 사용하여 살충제 대사를 연구하기위한 플랫폼이 개발되었습니다. 멸균차 식물로부터의 잎은 식물 호르몬 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D, 1.0 mg L-1)과 키네틴(KT, 0.1mg L-1)을 가진 무라시게및 스쿠그(MS) 기저 매에 느슨한 굳은살을 형성하도록 유도하였다. 캘러스는 각각 28 일 동안 지속되는 3 또는 4 라운드의 후 형성되었습니다. 느슨한 캘러스(약 3 g)를 동일한 식물 호르몬을 함유하는 B5 액상 배지로 접종한 후 25±1°C에서 어둠 속에서 흔들리는 인큐베이터(120 rpm)에서 배양하였다. 3-4 서브컬쳐 후, 차잎에서 유래된 세포 현탁액을 1:1 및 1:2(현탁액 어머니 액체: 신선한 배지) 사이의 하위 배양 비율로 확립하였다. 이 플랫폼을 사용하여, 6개의 살충제(5 μg mL-1 각 티아메톡삼, 이미다클로프리드, 아세트타미프리드, 이미다클로시즈, 디메토에이트 및 오메토아테)를 차 잎 유래 세포 현탁액 배양에 첨가하였다. 살충제의 대사를 액체 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 사용하여 추적했습니다. 차 세포 현탁액 배양의 유용성을 검증하기 위해, 처리된 세포 배양 및 손상되지 않은 식물에 존재하는 티아메톡산 및 디메토이트의 대사산물을 질량분광법을 사용하여 비교하였다. 처리된 차 세포 배양에서, 티아메톡산의 7개의 대사산물 및 디메토아테의 2개의 대사산물이 발견되었으며, 처리된 그대로 식물에서는 티아메톡삼의 대사산물 2개와 디메토에이트 중 하나만 발견되었다. 세포 현탁액의 사용은 특히 차와 같은 어려운 매트릭스에 대해 그대로 차 식물의 사용에 비해 대사 분석을 단순화했다.
Introduction
차는 세계에서 가장 널리 소비되는 무알코올 음료중 하나입니다 1,2. 차는 우디다년 동백꽃의 잎과 싹에서 생산되며 L. 차 식물은 광대한 농장에서 재배되며 수많은 곤충 해충3,4에취약하다. 유기인산및네오니코티노이드 살충제는 백색파리, 잎호퍼 및 일부 레피도프테란 종6,7과 같은 해충으로부터 차 식물을 보호하기 위해 전신 살충제5로 자주 사용된다. 적용 후, 이러한 살충제는 흡수되거나 식물로 전이됩니다. 식물 내에서, 이러한 전신 살충제는 식물 효소에 의해 가수 분해, 산화 또는 환원 반응을 통해 형질전환될 수 있다. 이러한 변형 제품은 모 화합물보다 더 극성 및 덜 독성이 있을 수 있습니다. 그러나 일부 유기 인산염의 경우 일부 제품의 생체 활동이 더 높습니다. 예를 들어, 아세트산은 보다 독성이 강한 메타미도포스8, 9, 및 이메토에이트 내로 대사되어10,11. 식물 대사 연구는 따라서 식물 내의 농약의 운명을 결정하는 데 중요하다12.
식물 조직 배양은 농약 대사를 조사하기 위한 유용한 플랫폼으로 입증되었으며, 확인된 대사산물은 그대로식물13,14,15에서발견되는 것과 유사하다. 조직 배양, 특히 세포 현탁액 배양의 사용은 몇 가지 장점을 갖는다. 첫째, 실험은 미생물이 없는 실험을 수행하여 미생물에 의한 농약 변형 또는 분해의 간섭을 피할 수 있습니다. 둘째, 조직 배양은 언제든지 사용하기 위한 일관된 물질을 제공한다. 셋째, 대사 산물은 손상되지 않은 식물보다 조직 배양에서 추출하기가 더 쉬울 수 있으며, 조직 배양은 종종 인터링 화합물이 적고 화합물의 복잡성이 낮습니다. 마지막으로, 조직 배양은 단일 실험16에서일련의 농약 대사를 비교하는데 보다 용이하게 사용될 수 있다.
본 연구에서는 멸균 재배 차 식물의 잎에서 파생 된 세포 현탁액이 성공적으로 확립되었습니다. 차 세포 현탁액 배양은 6개의 전신 살충제의 발산 거동을 비교하기 위해 사용되었다.
이 상세한 프로토콜은 연구원이 차에 있는 xenobiotics의 신진 대사 운명을 공부하기 위하여 유용한 식물 조직 문화 플랫폼을 설치할 수 있도록 몇몇 지도를 제공하기 위한 것입니다.
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Protocol
1. 차 캘러스 문화
참고: 멸균 잎은 연구그룹17에서처음 개발된 시험관내 재배 식물군 라인에서 유래되었다. 섹션 5까지의 모든 절차는 인큐베이터에서 배양 시간을 제외하고 멸균 층류 흐름 후드에서 수행되었다.
- 오토클레이브(121°C, 20분)에 앞서 두 배지(무라시게 및 스쿠그[MS] 기저 배지 및 감보그의 B5 액상 배지)의 pH를 5.8로 조정한다.
- 가위를 사용하여 멸균 잎의 중간 정맥을 따라 자른 다음 페트리 접시에 약 0.3 cm x 0.3 cm의 작은 조각으로 각 반을 세분화합니다.
- 멸균 이식(작은 잎 조각)을 식물 호르몬을 함유하는 MS 기저 매상에 2,4-D(1.0 mg L-1) 및 KT(0.1 mg L-1)에 놓는다. 6개의 이식체는 MS 기저 매질의 100 mL를 포함하는 300 mL 플라스크에 배치될 수 있다.
- 위의 잎을 25°C의 일정한 온도에서 배양하여 어둠 속에서 배양한다. 28일 후, 유도된 캘러스의 1세대를 선택하고 신선한 플라스크(subculture)로 옮김을 옮김한다. 3−4 서브컬쳐 후 느슨하고 부서지기 쉬운 캘러스를 획득합니다.
2. 차 세포 현탁액 배양
- 멸균 조건하에서 멸균 수술용 블레이드를 사용하여 고체 매체에서 부터 0.5−2mm 범위의 소인으로 격렬하고 부서지기 쉬운 느슨한 굳은살을 자릅니다.
- 작은 굳은 면 약 3g의 무게를 달수 있습니다. 캘러스를 2,4-D(1.0 mgL-1)및 KT(0.1 mg L-1)로 보충한 B5 액상 매체 20 mL을 함유한 150 mL 플라스크에 넣습니다.
- 액체 세포 현탁액을 120 rpm에서 흔들림 인큐베이터에서 일정한 온도(25±1°C)에서 배양하였다.
- 배양 후 7~10일 후에 배양 플라스크를 제거하고 몇 분 간 방치하십시오.
- 서브 컬쳐를 위한 종자 재료로 모든 상판을 신선한 매체로 가져 가라 (서스펜션 어머니 액체의 하위 배양 비율은 1 : 1과 1 : 2 사이의 범위 신선한 매체). 침전된 큰 굳은 살을 제거하십시오.
- 각각 28일의 3-4 하위 배양 주기 후에 최종 잘 자란 세포 현탁액 배양을 얻는다.
3. 세포 생존의 트리페닐 테트라 졸륨 염화물 분석
- 생존 력 염색 전에 대조군 세포로 100 °C에서 살아있는 세포의 샘플을 10 분 동안 죽입니다.
- 원심분리기 6000 x g에서 8 분 동안 모든 세포 현탁액 배양. 인산완식염수(PBS) 완충액(pH 7.3)의 2.5 mL에서 세포를 일시 중단하기 전에 상판액을 제거하고 손으로 1분 간 흔들어 줍니다.
- 0.4% 트리페닐 테트라졸륨 염화물(TTC) 용액의 2.5 mL를 추가하고 다시 손으로 흔들어 주세요.
- 서 있는 인큐베이터(30°C)에서 1시간 동안 혼합물을 배양한다.
4. 살충제를 가진 차 세포 현탁액 배양의 처리 그리고 샘플링
- 400 μL의 aliquot를 추가하여 4개의 네오니코티노이드(티아메톡삼, 아세트타미프리드, 이미다클로프리드, 이미다클로시즈) 또는 2개의 유기인산염(디메토아테 및 오메토아테)의 4개의 네오니코티노이드(500 μg mL-1)를 세포 현탁액 배양에 추가합니다. 각각.
참고: xenobiotic 행동을 비교하는 것이 목표인 경우에, 다른 화합물을 시험하기 위하여 세포 현탁액의 동일 어머니 배치를 이용하십시오. - 일정한 온도(25±1°C)에서 살충제를 사용하여 세포 현탁액의 샘플을 배양하고 인큐베이터 속도(120 rpm)를 흔들었다. 샘플을 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 및 75일에 샘플(4.3 단계 참조)을 수행합니다.
- 네오니코티노이드를 함유한 샘플을 시험하려면, 균질한 세포 배양물의 1 mL aliquot를 제거하고, 1.5 mL 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣고, 원심분리기를 4000 x g에서 2분 동안.
- 고성능 액체 크로마토그래피 자외선(HPLC-UV) 및 초고성능 액체 크로마토그래피-사중극기(UPLC-QTOF) 질량으로 분석하기 전에 0.22-μm 모공 크기의 필터 멤브레인을 통해 초나토이를 통과합니다. 분광법(재료표).
- 유기 인산염을 포함하는 샘플을 테스트하려면 세포 배양500 μL aliquot를 제거하고 35 mL 원심 분리튜브 또는 1.5 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 넣습니다 (네오니코티노이드와 같은 후자의 샘플을 준비하십시오).
- 염화나트륨 0.1 g과 아세톤/에틸 아세테이트 5mL(3:7, v/v)를 500 μL 샘플의 35mL 원심분리튜브에 넣습니다.
- 혼합물을 1 분 동안 소용돌이로 한 다음 10 분 동안 휴식을 취합니다.
- 상급제의 2.5 mL을 10 mL 유리 튜브에 넣고 40 °C에서 질소 증발기를 사용하여 거의 건조로 증발합니다.
- 잔류물을 1 mL 아세톤, 와류 1 분 동안 용해하고 가스 크로마토 그래피 - 화염 광 측정 검출기 (GC-FPD)에 의해 분석하기 전에 0.22-μm 필터 멤브레인을 통과하십시오.
5. 살충제를 가진 손상되지 않은 차 식물의 견본 준비
참고 : 그대로 차 식물 시험은 영양 용액의 50 mL에서 성장 차 묘목을 사용하여 수경 시스템에서 실시되었다 (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2 +, 25 Mg2 +, 0.35 Fe 2+, 0.1 B 3+, 1.0 Mn2+ ,0.1 Zn2+ ,0.025 Cu2+, 0.05 Mo+및 10 Al3++ , mg L-1)18. 실험 온실은 안후이 농업 대학에서 20 °C에서 밝은 어두운 주기 (빛의 12 시간 및 어둠의 12 시간)에서했다.
- 15 일 동안 4 L 플라스틱 냄비에 5 개의 식물을 넣습니다.
- 0 ppm (제어) 또는 티아메톡삼 100 ppm또는 디메토이트를 플라스틱 냄비에 각각 넣습니다.
- 19를미리 담그는 것을 제외하고 이전 방법에 따라 손상되지 않은 식물 샘플을 준비한 다음 질량 분석법으로 분석하여 정확한 질량 스펙트럼을 얻습니다.
6. 계측기 분석
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네오니코티노이드의 대사 행동의 HPLC 분석
- HPLC-UV(재료표)를 사용하여 254 nm의 파장에서 티아메톡삼과 아세타미프리드의 함량및 대사 산물을 검출하고, 4.3절의 시료에서 270 nm의 이미다클로스트리와 이미다클로시즈를 검출한다.
참고: HPLC-UV 상태는 이전 연구19와동일했습니다.
- HPLC-UV(재료표)를 사용하여 254 nm의 파장에서 티아메톡삼과 아세타미프리드의 함량및 대사 산물을 검출하고, 4.3절의 시료에서 270 nm의 이미다클로스트리와 이미다클로시즈를 검출한다.
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유기 인산염의 대사 행동의 GC 분석
- 키랄 컬럼(재료 표)을 사용하여 GC-FPD에 의해 섹션 4.4에서 샘플에서 디메토에이트 및 오메토에이트함량을검출합니다.
- 질소를 캐리어 가스로 사용하고 유량을 1.0 mL min-1로설정합니다.
- 초기 온도를 120°C로 설정하고, 5분 간 유지한다. 온도를 30°C에서 150°C로 올리고 3분 간 유지한다. 10°C에서 170°C로 올리고 7분 동안 유지한다. 마지막으로 30°C 에서 210°C로 증가시키고-1분 간 유지합니다.
- 스플릿리스 모드에서 사출 온도를 200°C로 설정; 검출기 온도를 250°C로 설정합니다.
- 사출 량을 1 μL로 설정합니다.
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세포 배양에서 살충제 대사산물의 UPLC-QTOF 분석
- C18 컬럼(물자 표)을 사용하여 UPLC-QTOF를 사용하여 세포 배양물(섹션 4.3의샘플)에서 살충제의 대사산물을 검출한다.
- 유량을 0.2 mL min-1로설정합니다. 사출 량을 10 μL로 설정합니다.
- 네오니코티노이드 처리 된 샘플의 경우 초기 이동 상을 85 % A (5 mM 암모늄 포메이트 물) 및 15 % B (아세토니트릴)로 설정합니다. 10분 이상, 이동단계 B를 38%로 늘리고 1분 동안 15%로 되돌리고 9분 동안 유지합니다.
- 유기 인산염 처리 된 샘플의 경우 초기 이동 상을 55 % A (0.1 % 포믹 산 물) 및 45 % B (아세트 니트릴)로 설정합니다. 5분 이상, 이동단계 B를 70%로 올리고, 0.5분 이상 B의 45%로 되돌리고, 2.5분 동안 유지합니다.
- QTOF 작동 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 가스 온도, 325°C; 건조 가스 (질소), 10 L 분-1; 시스 가스 온도, 350 °C; 시스 가스 흐름, 11 L 분-1; 모세관 전압, 4000 V; 노즐 전압, 1000 V; 단편성 전압, 네오니코티노이드 살충제에 대한 100 V 또는 유기 인성 살충제에 대한 110V; 스키머 전압, 65 V; 양이온 모드에서 작동합니다.
- 계측기를 전체 스캔 스펙트럼으로 설정하고 MS/MS 모드를 대상으로 합니다.
- 정확한 질량 도구를 사용하여 데이터를 처리합니다. MS/MS 항문뿐만 아니라 문헌12,15,20,21,22에서표준 제품이 없는 대사 산물을 추론한다.
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온전한 식물 추출물에서 살충제 대사산물의 UPLC-Orbitrap 분석
- UPLC-Orbitrap 질량 분광법 (재료 표)을 사용하여 그대로 식물 추출물에서살충제의 대사 산물을 검출합니다.
- 질량 분석법(표재료)작동 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 시스 가스 압력, 35 arb; 가스 온도, 300 ° C; 노즐 전압, 3.5 KV; 모세관 온도, 350 °C.
- 세포 배양의 UPLC-QTOF 분석을 위해 용출 프로그램을 위(단계 6.3.3 및 6.3.4 단계)로 설정합니다.
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Representative Results
현장에서 자란 차 나무와 멸균 환경에서 시험관 내에서 자란 차 식물에서 절제된 잎에서 수확한 잎에서 칼의 유도는 MS 매체에 재배 한 후 오염, 브라우닝 및 유도를 측정하여 비교했습니다. 그림1A)를 참조하십시오. 캘러스 성장은 20, 37, 62 및 90일의 배양(도1B)에서기록되었다. 시험관내에서 자란 잎에서 유래한 캘러스는 재배 90일 동안 밭에서 자란 잎에서 유래한 캘러스보다 더 활발한 성장을 보였다. 멸균 된 잎에서 나온 캘러스는 밝은 노란색이었고, 밭에서 자란잎의 캘러스는 갈색이었습니다 (그림 1B).
2,4-D23의1.0 mgL-1의 농도에서, KT의 농도는 최적화되었다. 0.05 mgL-1 KT에서 캘러스 성장률이 느렸고, 질감이 약간 작아졌으며, 캘러스는 흰색(도2C); 0.1 mgL-1 KT 농도에서, 캘러스 성장률이 가장 높았고, 최대 61.5%(도2A),질감이 느슨하고, 색이 황색(도2C); KT가 0.5 mgL-1로증가했을 때, 캘러스는 중앙에서 작고 불규칙하고 갈색이었다(도2C). KT 농도를 선택한 후, 2,4-D의 농도를 더 연구했다. 1 mgL-1 2,4-D 및 0.1 mgL-1 KT의 조합에서 캘러스 성장률이 46.9%에 도달하여 가장 높았으며 캘러스의 외관이 가장 높았습니다(도2B,D).
고체 배지상에서 2차 서브컬쳐 후, 각 절제된 잎의 표면의 절반 이상이 성장하는 캘러스에 의해 덮여 있었다(도3A). 4회 서브컬쳐 후, 잎 부분은 캘러스로 완전히 덮여 있었다. 5회 서브컬쳐 가해진 후, 캘러스 텍스처가 바닥에 흰색과 갈색 반점으로 컴팩트해지기 시작했습니다.
하위 배양 주기가 21일(그림3B)이었을때 캘러스는 활발했지만 가장 큰 성장량에 도달하지 못하여 빈번한 하위 배양이 캘러스 양을 줄이게 됩니다. 하위 배양 주기가 28 일 동안, 캘러스는 활발하게 성장했고, 색상은 황색이었고 질감은 느슨했습니다. 35 일 후, 캘러스는 중심에서 갈색으로 변하기 시작했습니다. 캘러스는 42일 만에 짙은 갈색으로 더 이상 자라지 않는 최악의 상태에 있었다.
두 종류의 액체 매개체는 캘러스의 성장과 세포 현탁액의 색에미치는 영향에 대해 비교하였다(도 4). 배양 액의 총 부피에 대한 어머니 액체의 세 가지 다른 비율을 시험하였다. 75일 의 재배 동안, 배양물에서 세포 밀도가 점차 증가하여 세 가지 비율 모두에서 시작되었다. 40 mL 프레시 매질(v/v)에서 15g 셀의 비율은 광학 밀도(OD) 값이 40 mL(v/v)에서 4g(v/v)에서 4g보다 훨씬 높았으며, 40 mL(v/v)에서 6g(그림5A)을산출하였다. 각각 28일간 4회 서브컬쳐 사이클을 거친 후, B5 액상 배지에 멸균차 캘러스로부터 차 세포 현탁시스템을 성공적으로 확립하였다(그림 6).
그림 1 : 수확한 잎과 멸균 된 식물잎에서 캘러스 유도의 비교. (A) 농장에서 재배한 차 식물과 멸균된 체외 재배 식물에서 절제된 잎에서 수확한 잎에서 나온 캘러스 유도의 비교. 이식은 캘러스의 오염, 갈색 및 유도에 대해 관찰되었다. (B) 플랜테이션 재배 차 식물(1세트)과 시험관내 멸균 재배 식물(세트 2)에서 유래한 잎의 캘러스 생장 비교: 사진은 상이한 날에 있었다: 20(패널 a); 37(b); 62(c); 및 90(d). 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 차잎 유래 캘러스의 성장률과 성장 상태는 식물 호르몬 농도가 다르다. 상이한KT 농도하에서 차잎 유래 캘러스의 성장속도(A) 및 성장상태(C)와 1 mgL-1 2,4-D; 다른 2,4-D 농도 및 0.5 mgL-1 KT 하에서 캘러스의 성장속도(B) 및 성장 상태(D). 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 하위 배양 주기 (A)와 하위 배양 주기 (B)의 다른 길이의 다른 수 후 캘러스상태. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 액체 현탁액 문화 시스템의 캘러스 성장에 대한 다양한 미디어 유형의 영향. (A) B5 매체. (B) MS 매체. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 광학 밀도 값 과 TTC 염색. (a) 세포 현탁액의 OD680 값은 0 일에서 75 일까지 다른 비율로 시작; (B) 살아있는 대조군 세포의 TTC 염색. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 어두운 인큐베이터에서 일정한 온도(25±1°C)에서 차 세포 현탁액 배양을 확립하는 과정. 잎 이식의 근원으로서 차 식물의 멸균 배양 (a); 2,4-D (1.0 mg L-1)와 KT (0.1 mg L-1)로 MS 배지에 접종된 차잎(b); 28 일 후 초기 배양 캘러스 (c); 캘러스는 각각 28일의 4개의 하위 배양주기 후에 세포 현탁액에 적합합니다(d); 나머지 단계는 동일한 온도에서 했지만 흔들림 인큐베이터에서 120 rpm의 일정한 속도로: 캘러스를 B5 배지에 7~10일 동안 접종하였다(e); 침전 및 큰 캘러스(f)를 제거한후 시드 된 세포 현탁액; 세포 현탁액의 하위 배양 후28 일의 1 주기 (g); 성숙한 세포 현탁액은 각각 28일의 3-4 하위 배양 주기 후에 (h). 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 차 세포 현탁액 배양 및 배지 (CK)에서 6 살충제의 5 μg / mL의 대사가 일정한 온도 (25 ± 1 °C)에서 배양하고 75 일 동안 인큐베이터 속도 (120 rpm)를 흔들었다. 티아메톡산 (A), 이미다클로프리드(B), 아세타미프리드(C), 이미다클로시즈(D), 디메토에이트(E1), 및오메토아테(F); (E2) 디메토에이트(omethoate)의 대사산물의 시간이 지남에 따라 생산은 디메토이트 처리된 세포 배양 및 배지에서 생산된다. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 처리되지 않은 대조군 세포 배양으로부터 추출물의 총 이온 크로마토그램(Tics),티아메톡삼 처리 세포 배양, 티아메톡삼 처리 배지(무세포) 75일 후. 봉우리 1-5, 7 및 8은 티아메톡삼의 대사산물이었고 피크6는 티아메톡삼(A);; 디메토이트 처리된 세포 배양물, 디메토이트 처리 배지(cell-free) 및 60일 후 처리되지 않은 대조군 세포로부터의 추출물의 TICs. 피크 1 및 2는 디메토에이트 및 피크 3의 대사산물이었으며, 이메토에이트(B);; 티아메톡삼 처리(상부) 및 미처리(하부) 손상되지 않은 식물(C)으로부터의 추출물의 TICs; 디메토에이트 처리(상부) 및 미처리(하부) 손상되지 않은식물(D)으로부터의 추출물의 TICs; 그대로 식물 (D1)에서 tR 1.86 분에서 디메토이트의 대사 산물; 처리되지 않은 식물 (D2)에서 tR 1.86 분에서 검출 된 화합물이 없습니다. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: (A) 티아메톡삼 및 (B) 디메토이트로 처리된 배양액으로부터 유래된 피크의 UPLC-QTOF를 이용한 이차 질량 분석법. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 4: 티아메톡삼 (A1, A2 및 A3) 및 디메토이트 (B1 및 B2)로 처리 된 손상되지 않은 식물에서 파생 된 피크의 Q-Exactive를 사용하는 이차 질량 분석법. 이 그림은 Jiao 등 에서 수정되었습니다.24. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기사는 이식물의 선택, 세포 생존력의 결정, 높은 대사를 가진 차 세포 현탁액 배양의 확립을 포함하여 차 식물 조직에 있는 농약 물질 대사의 모형을 설치하는 상세한 과정을 제시합니다 활동. 식물 조직의 모든 부분은 살균 된 환경에서 굳은 살을 시작하는 데 사용할 수있습니다 25. 차 잎은 이 연구에서 캘러스 개시를 위해 선택되었으며, 잎이 지하 부분보다 덜 오염되는 경향이 있을 뿐만 아니라 작물의 식용 부분이며 농약 적용의 주요 대상이기 때문입니다.
본 연구에서는, 시험관 내에서 자란 멸균 식물로부터 절제된 잎과 현장에서 수확한 잎으로부터의 캘러스의 유도 속도 및 성장 상태를 비교했다. 멸균 된 잎은 갈색 과 오염의 훨씬 낮은 속도와 필드 성장 잎에 비해 유도의 높은 비율을 했다. 이는 현장에서 자란 식물의 잎이 에탄올과 수은을 사용하여 표면 살균을 거쳤을 뿐만 아니라 성장 환경의 변화뿐만 아니라 멸균 된 잎이 멸균 환경에서 재배되어 멸균 환경에서 직접 사용할 수 있었기 때문입니다. 추가 살균. 또한, 시험관내에서 재배된 멸균 식물로부터 유래된 캘러스는 재배 90일 동안 밭에서 자란 잎보다 더 활발한 성장을 보였다. 멸균 식물에서 잎은 높은 캘러스 유도 및 낮은 오염률뿐만 아니라 짧은 전처리 시간과 계절 적 요인으로부터의 독립성 때문에 차 굳은 살의 유도에 더 적합했습니다.
느슨하고 부서지기 쉬운 굳은 동구를 배양하기 위해서는 주로 식물 성장 조절기 수준과 서브컬쳐 사이클의 길이 및 수를 25로 최적화해야 하는 중요한 매개 변수를 사용해야 합니다. 2,4-D효과적으로 캘러스 유도 및 성장을 촉진 할 수 있으며 캘러스 배양26에서가장 널리 사용되는 호르몬입니다. 하위 배양 시간 및 하위 배양 주기길이는 캘러스 배양(25)에도 중요하다. 매 주기마다 2~4일의 하위 배양 후, 캘러스는 황색과 갈색이 없는 느슨한 질감을 가졌습니다. 최적화 실험은 최고의 캘러스 유도 프로토콜이 1 mgL-1 2,4-D 및 0.1 mgL-1 KT를 포함하는 MS 기저 매에 멸균 식물에서 잎 박식물을 배치하고 28 일마다 배전 / 캘러스를 전송하는 것으로 결정했습니다. 총 4개의 하위 배양 주기. 이 프로토콜은 세포 현탁액의 개시에 적합한 느슨하고 부서지기 쉬운 캘러스를 시작했습니다.
식물 조직 배양에서, 캘러스 생장에 사용되는 고체 배지는 종종액체 형태(23)에서 세포 현탁액 배양에 사용될 수 있다. 반면, 차는 고농도의 무기염을 함유하는 MS 기저 배지에서 다량의 폴리페놀이 되어 캘러스브라우닝(27,28)을초래한다. 본 연구에서, 액체 B5 매체 및 MS 매체는 둘 다 시험되었다. 평균 성장률은 두 배양물(B5기저면 16.66%, MS기저마제15.77%)과 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그림4). 그러나, 굳은 살은 MS 기초 매체에서 갈색이었다. 따라서, 제안된 방법에서 B5 기저 매체를 선택하였다.
산소는 식물 세포 성장 및 신진 대사에 중요 하다. 액체 배양에서, 액체의 과도한 양은 산소 농도를 감소시키고 세포 성장을 억제할 것이고, 너무 적은 액체는 또한 세포 성장을 억제합니다25. 플라스크 부피(mL 액체: mL 플라스크)에 대한 액체의 여러 비율을 시험하였다. 21d 이후의 세포 성장의 건조 중량을 기준으로, 액체: 플라스크 비율은 다음과 같이 순위가 매겨지다: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. 본 연구에서, 40 mL의 배양액을 150 mL 플라스크(40 mL: 150 mL)에 배치하였으며, 육안으로 관찰된 세포 현탁액의 모습에 따라 선택하였다.
세포 밀도가 너무 높거나 너무 낮을 때 식물 세포는 잘 자랄 수 없습니다. 따라서, 하위 배양시에 신선한 배지에 대한 모세포 현탁액 배양의비율은 세포(29)의 성장 잠재력에 영향을 미친다. 본 연구는 균질한 세포 현탁액 배양의 OD 값을 사용하여 세포 성장량을 나타내하였다. 모성액체 15 g을 배양액(v/v)의 총 부피 40 mL로 접종하여 세포 성장에 적합하였다. 계배양 비율은 1:1과 1:2(서스펜션 마더 액: 신선한 배지)와 동일하였다.
티셀 현탁액 배양 내의 세포 생존력은 TTC 염색에 의해 시험되었다. 무색 TTC 화합물은 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 탈수소효소에 의해 적색 포르마잔으로 변환될 수 있지만,색은 죽은 세포로부터 변할 수 없다(도 5B). 이 방법은 액체 배양에서 세포의 성장 상태를 확인하였다.
차 세포 현탁액 배양의 설립 신진 대사와 다른 농약의 대사 산물을 공부 하기 위한 쉬운 시험관 내 연구 플랫폼을 제공 합니다. 계절과 날씨에 관계없이 세포 현탁액 배양은 다른 살충제, 활성 성분의 다른 농도 및 다양한 시간 동안 처리 될 수 있습니다. 차 세포 현탁액 배양물에서 생성된 대사산물은 그대로 식물로부터 추출된 것과 유사하였다(보충도 1 및 보충도2). 흥미롭게도, 티아메톡삼의 7가지 대사산물과 디메토아테의 대사산물 2개가 차세포 현탁액 배양물에서 검출되었지만, 티아메톡삼의 대사산물 2개와 처리된 식물에서 이메트호이트에 대한 대사산물 1개(보충그림1, 보충 도2, 및 보충 도3). 이것은 왁시 큐티클이없는 세포로부터의 더 쉬운 추출, 질량 분석 결과 (매트릭스 효과) 또는 전체 식물에 비해 차 세포의 단순한 대사 산물 프로필을 방해하는 차의 화합물 수 때문일 수 있습니다.
그 결과 티아메톡삼은 다른 3개의 네오니코티노이드에 비해 차 세포에 의해 더 쉽게 대사되었다는 것을보여주었다(보충도4). 두 유기 인산염 (디메토에이트 및 오메토에이트)은 네오니코티노이드보다 빠르게 대사되었습니다. 이 결과는 차 세포에 있는 신진 대사 통로 그리고 신진 대사 규칙의 다양성을 보여줍니다, 추가 공부될 필요가 있는.
살충제 대사를 연구하고 살충제 대사 산물을 확인하기 위해 그대로 식물을 사용하여 식물 내의 초기 및 고장 화합물의흡수 및 장거리 수송장벽을 포함하여 수많은 어려움을 제시30. 세포 현탁액 배양은 이러한 문제를 해결할 뿐만 아니라 신선한 잎(24)으로부터의 추출물에 비해 시료 분석에서 매트릭스 간섭을 감소시킬 수 있었다. 이 연구는 차 세포 현탁액 배양이 차 식물에서 xenobiotic 화합물의 신진 대사를 연구하기위한 효과적인 플랫폼임을 증명했다. 그것은 다른 식물에서 xenobiotics의 신진 대사를 연구 하는 모드로 제공 될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFD0200900), 중국의 국가 자연 과학 재단 (No. 31772076 및 No. 31270728), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M630700), 그리고 오픈 펀드의 지원을 받았습니다. 차 식물 생물학 및 활용의 국가 키 연구소 (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
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