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Biochemistry

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

Este trabalho apresenta um protocolo para o estabelecimento de uma cultura de suspensão celular derivada de folhas de chá (Camellia sinensis L.) que podem ser utilizadas para estudar o metabolismo de compostos externos que podem ser tomados por toda a planta, como inseticidas.

Abstract

Uma plataforma para estudar o metabolismo do insecticida usando in vitro os tecidos da planta de chá foi desenvolvida. As folhas das plântulas de chá estéreis foram induzidas para formar calo solto nos meios basais de Murashige e Skoog (MS) com os hormônios vegetais 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 1,0 mg L-1) e CINETINA (KT, 0,1 mg l-1). Callus formado após 3 ou 4 rodadas de subculturação, cada um com duração de 28 dias. O calo frouxo (aproximadamente 3 g) foi inoculado então em meios líquidos B5 que contêm os mesmos hormônios de planta e foi cultivado em uma incubadora de agitação (120 rpm) no escuro em 25 ± 1 ° c. Após 3 − 4 subculturas, uma suspensão da pilha derivada da folha do chá foi estabelecida em uma relação da subcultura que varia entre 1:1 e 1:2 (líquido da mãe da suspensão: meio fresco). Usando esta plataforma, seis insecticidas (5 μg mL-1 cada Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, e omethoate) foram adicionados na cultura folha-derivada do chá da suspensão da pilha. O metabolismo dos inseticidas foi rastreado usando cromatografia líquida e cromatografia gasosa. Para validar a utilidade da cultura da suspensão da pilha de chá, os metabolitos do tiametoxam e do dimetoato atuais em culturas de pilha tratadas e em plantas intactas foram comparados usando a espectrometria maciça. Em culturas tratadas da pilha de chá, sete Metabolites de tiametoxam e dois Metabolites do dimetoato foram encontrados, quando em plantas intactas tratadas, somente dois Metabolites do tiametoxam e um do dimetoato foram encontrados. O uso de uma suspensão celular simplificou a análise metabólica em comparação com o uso de plantas de chá intactas, especialmente para uma matriz difícil, como o chá.

Introduction

O chá é uma das bebidas não alcoólicas mais consumidas no mundo1,2. O chá é produzido a partir das folhas e gemas do Woodyperene Camellia sinensis L. as plantas de chá são cultivadas em vastas plantações e são suscetíveis a numerosas pragas de insetos3,4. Os insecticidas do organophosphorus e do neonicotinóides são usados frequentemente como insecticidas sistemáticas5 para proteger plantas de chá das pragas tais como whiteflies, funis da folha, e alguma espécie do lepidóptero6,7. Após a aplicação, estes insecticidas são absorvidos ou translocalizados na planta. Dentro da planta, esses inseticidas sistêmicas podem ser transformados por meio de reações de hidrólise, oxidação ou redução por enzimas vegetais. Estes produtos da transformação podem ser mais polares e menos tóxicos do que os compostos do pai. No entanto, para alguns organofosforados, as Bioatividades de alguns produtos são mais elevadas. Por exemplo, o acefato metaboliza-se nos metamidofos mais tóxicos8,9, e dimetoato no ometoato10,11. Os estudos metabólicos da planta são assim importantes para determinar o Fate de um insecticida dentro de uma planta12.

As culturas de tecidos vegetais têm sido provadas como uma plataforma útil para investigar o metabolismo de pesticidas, com os metabólitos identificados semelhantes aos encontrados em plantas intactas13,14,15. O uso de culturas de tecidos, particularmente culturas de suspensão celular, tem várias vantagens. Em primeiro lugar, experimentos podem ser realizados livres de microrganismos, evitando assim a interferência da transformação de pesticidas ou degradação por micróbios. Em segundo lugar, a cultura do tecido fornece materiais consistentes para o uso a qualquer hora. Em terceiro lugar, os metabolitos são mais fáceis de extrair das culturas do tecido do que das plantas intactas, e as culturas do tecido têm frequentemente menos compostos interring e uma mais baixa complexidade dos compostos. Finalmente, as culturas do tecido podem mais facilmente ser usadas para comparar uma série de metabolismo dos insecticidas em um único experimento16.

Neste estudo, uma suspensão da pilha derivada das folhas do plantlet estéril-crescido do chá foi estabelecida com sucesso. A cultura de suspensão de células de chá foi então utilizada para comparar os comportamentos de dissipação de seis inseticidas sistêmicas.

Este protocolo detalhado é pretendido fornecer alguma orientação de modo que os investigadores possam estabelecer uma plataforma da cultura do tecido de planta útil para estudar o Fate metabólico de xenobióticos no chá.

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Protocol

1. cultura do calo do chá

Nota: as folhas estéreis foram derivadas de linhas de plânteria cultivadas in vitro, desenvolvidas pela primeira vez no grupo de pesquisa17. Todos os procedimentos até a seção 5 foram conduzidos em uma capa estéril do fluxo laminar, à exceção do tempo da cultura em uma incubadora.

  1. Ajuste o pH dos dois meios (Murashige e Skoog [MS] meio basal e o meio líquido B5 de Gamborg) para 5,8 antes de autoclavagem (121 ° c, 20 min).
  2. Corte ao longo da veia média de uma folha estéril usando tesouras e, em seguida, subdivida cada metade em pequenos pedaços de cerca de 0,3 cm x 0,3 cm em uma placa de Petri.
  3. Coloc os explantes estéreis (as partes pequenas da folha) em meios básicos do MS que contêm os hormones de planta 2,4-D (1,0 MGS L-1) e KT (0,1 magnésio l-1). Seis explantes podem ser colocados em um balão de 300 mL contendo 100 mL de MS de meios basais.
  4. Cultura os explantes acima da folha em uma temperatura constante de 25 ° c no escuro. Após 28 dias, selecione a primeira geração de calo induzido e transfira para a garrafa fresca (uma subcultura). Adquira o calo frouxo e friável após 3 − 4 subcultures.

2. cultura da suspensão da pilha de chá

  1. Corte os calos vigorosos, friáveis e frouxos do meio contínuo em partes pequenas (escala aqui 0.5 − 2 milímetros) usando uma lâmina cirúrgica estéril circunstâncias estéreis.
  2. Pesar cerca de 3 g dos pequenos pedaços de calo. Coloque o calo em um balão de 150 mL contendo 20 mL de meio líquido B5 suplementado com 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg l-1).
  3. Cultura a suspensão da pilha líquida em uma temperatura constante (25 ± 1 ° c) em uma incubadora de agitação em 120 RPM no escuro.
  4. Após 7 a 10 dias de cultivo, retire os frascos de cultura e deixe-os ficar por alguns minutos.
  5. Tome todo o sobrenadante como material de semente para a subcultura ao meio fresco (a relação da subcultura do líquido da mãe da suspensão ao meio fresco variou entre 1:1 e 1:2). Remova os calos precipitados, grandes.
  6. Obtenha a cultura final da suspensão celular bem cultivada após 3 − 4 ciclos de subcultura de 28 dias cada.

3. ensaio de cloreto de trifenilo tetrazólio de viabilidade celular

  1. Mate uma amostra de células vivas a 100 ° c por 10 min como uma célula de controle antes da coloração da viabilidade.
  2. Centrifugue toda a cultura da suspensão da pilha por 8 minutos em 6000 x g. Retire o sobrenadante antes de suspender as células em 2,5 mL de tampão salino com tampão fosfato (PBS) (pH 7,3), e agitar por 1 min à mão.
  3. Adicionar 2,5 mL da solução de cloreto de tetrazólio de 0,4% de trifenilo (TTC) e agitar à mão novamente.
  4. Incubar a mistura durante 1 h numa incubadora permanente (30 ° c).

4. tratamento e amostragem de culturas de suspensão de células de chá com inseticidas

  1. Adicionar uma alíquota de 400 μL de solução de stock esterilizada por filtro (500 μg mL-1) de quatro neonicotinóides (tiametoxam, acetamipride, imidaclopride e imidaclothiz) ou dois organofosforados (dimetoato e ometoato) nas culturas de suspensão celular, Respectivamente.
    Nota: se o objetivo é comparar os comportamentos xenobióticos, use o mesmo lote mãe de suspensões celulares para testar os diferentes compostos.
  2. Cultura das amostras de suspensões celulares com inseticidas em temperatura constante (25 ± 1 ° c) e velocidade da incubadora de agitação (120 rpm). Tome as amostras (ver passo 4,3 ou 4,4) em 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 e 75 dias.
  3. Para testar uma amostra contendo um neonicotinóide, retire uma alíquota de 1 mL da cultura celular homogênea, coloque-a em um tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mL e centrifugue a 4000 x g por 2 min.
    1. Passe os sobrenadantes através de uma membrana de filtro de tamanho de poros de 0,22 μm antes da análise por cromatografia líquida de alta eficiência-ultravioleta (HPLC-UV) e cromatografia líquida de ultra alto desempenho-massa quadrupolar de tempo de voo (UPLC-QTOF) espectrometria (tabela de materiais).
  4. Para testar uma amostra contendo um organofosfato, retire uma alíquota de 500 μL da cultura celular e coloque em um tubo de centrífuga de 35 mL ou um tubo de centrifugação de plástico de 1,5 mL (Prepare a última amostra como a de neonicotinóide).
    1. Adicionar 0,1 g de cloreto de sódio e 5 mL de acetona/acetato de etilo (3:7, v/v) no tubo de centrifugação de 35 mL das amostras de 500 μL.
    2. Vórtice as misturas por 1 min, e depois permitir-lhes descansar por 10 min.
    3. Tomar 2,5 mL do sobrenadante em um tubo de vidro de 10 mL e evadir-se para Near-dryness usando um evaporador de nitrogênio a 40 ° c.
    4. Dissolver o resíduo com 1 mL de acetona, vortex por 1 min, passá-lo através de uma membrana de filtro de 0,22 μm antes da análise por cromatografia gasosa-detector fotométrico de chama (GC-FPD).

5. preparação da amostra da planta de chá intacta com insecticidas

Nota: o ensaio da planta do chá intacto foi conduzido em um sistema hidropônico usando mudas de chá cultivadas em 50 mL de uma solução nutritiva (30 NH4+, 10 não3-, 3,1 PO4-, 40 K+, 20 CA2 +, 25 mg2 +, 0,35 FE2 +, 0,1 B 3 +, 1,0 Mn2 +, 0,1 Zn2 +, 0, 25 UC2 +, 0, 5 mo+, e 10 Al3 +, em mg L-1)18. Uma estufa experimental estava um ciclo claro-escuro (12 h da luz e 12 h da escuridão) em 20 ° c na Universidade agricultural de Anhui.

  1. Coloque cinco plantas em um pote de plástico de 4 L por 15 dias.
  2. Adicione 0 ppm (controle) ou 100 ppm de tiametoxam ou dimetoate em vasos plásticos, respectivamente.
  3. Prepare a amostra de planta intacta de acordo com o método anterior, exceto para presoaking19, e depois analise com espectrometria de massas para um espectro de massa exato.

6. análise do instrumento

  1. Análise de HPLC do comportamento metabólico de neonicotinóides
    1. Use um HPLC-UV (tabela de materiais) para detectar o índice e os produtos metabólicos de tiametoxam e de acetamipride em um comprimento de onda de 254 nanômetro, e de imidaclopride e de imidaclothiz em 270 nanômetro nas amostras da seção 4,3.
      Nota: a condição HPLC-UV foi a mesma do estudo anterior19.
  2. Análise do GC do comportamento metabólico de organofosforados
    1. Detecte o conteúdo de dimetoato e ometoato em amostras da seção 4,4 por um GC-FPD usando uma coluna quiral (tabela de materiais).
    2. Use o nitrogênio como o gás de portador e ajuste a taxa de fluxo em 1,0 mL min-1.
    3. Ajuste a temperatura inicial para 120 ° c, e segure-a por 5 min. aumente a temperatura para 150 ° c a 30 ° c Min-1 e segure por 3 min. aumente para 170 ° c a 10 ° c Min-1 e segure por 7 min. Finalmente, aumente para 210 ° c a 30 ° c Min-1 e depois Segure por 5 min.
    4. Ajuste a temperatura da injeção a 200 ° c no modo splitless; Ajuste a temperatura do detector a 250 ° c.
    5. Defina o volume de injeção para 1 μL.
  3. Análise de UPLC-QTOF dos metabolitos do insecticida na cultura de pilha
    1. Detecte os metabolitos dos insecticidas na cultura de pilha (amostras da seção 4,3) usando o UPLC-QTOF com uma coluna C18 (tabela dos materiais).
    2. Defina a vazão para 0,2 mL min-1. Defina o volume de injeção para 10 μL.
    3. Para as amostras tratadas com neonicotinóides, defina a fase móvel inicial para 85% A (5 mM de água de formato de amónio) e 15% B (acetonitrila). Sobre 10 minutos, aumente a fase móvel B a 38% e retorne a 15% sobre 1 minuto, preensão por 9 minutos.
    4. Para as amostras tratadas com organofosfato, defina a fase móvel inicial para 55% A (0,1% de água de ácido fórmico) e 45% B (acetonitrila). Sobre 5 minutos, aumente a fase móvel B a 70%, a seguir retorne a 45% de B sobre 0,5 minutos, preensão para o minuto 2,5.
    5. Defina os parâmetros de operação QTOF da seguinte forma: temperatura do gás, 325 ° c; gás de secagem (nitrogênio), 10 L min-1; temperatura do gás da bainha, 350 ° c; fluxo de gás da bainha, 11 L min-1; tensão capilar, 4000 V; tensão do bocal, 1000 V; fragmentor tensão, 100 V para inseticidas neonicotinóides ou 110 V para inseticidas organofosforados; tensão do skimmer, 65 V; operando em modo de íon positivo.
    6. Defina o instrumento para o espectro de digitalização completo e o modo MS/MS de destino.
    7. Processe os dados usando ferramentas de massa precisas; Inferir os metabólitos sem produtos padrão da anotação MS/MS, bem como a literatura12,15,20,21,22.
  4. Análise de UPLC-Orbitrap dos metabolitos do insecticida no extrato intacto da planta
    1. Detecte os metabolitos dos insecticidas no extrato intacto da planta usando a espectrometria maciça de UPLC-Orbitrap (tabela dos materiais).
    2. Defina os parâmetros de operação da espectrometria de massas (tabela de materiais) da seguinte forma: pressão de gás da bainha, 35 ARB; temperatura do gás, 300 ° c; tensão do bocal, 3,5 KV; temperatura capilar, 350 ° c.
    3. Ajuste os programas da eluição como acima (etapas 6.3.3 e 6.3.4) para a análise de UPLC-QTOF da cultura de pilha.

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Representative Results

A indução de calo de folhas colhidas de árvores de chá cultivadas em campo e de folhas excisadas de plântulas de chá cultivadas in vitro em ambiente estéril foi comparada através da medição de contaminação, escurecimento e indução após 28 dias de cultivo em MS Media ( Figura 1a). O crescimento do calo foi registrado aos 20, 37, 62 e 90 dias de cultura (Figura 1b). O calo derivado das folhas cultivadas in vitro mostrou um crescimento mais vigoroso do que o calo derivado das folhas cultivadas em campo durante todo o período de 90 dias de cultivo. O calo das folhas estéreis era amarelo brilhante, enquanto o calo das folhas cultivadas em campo era marrom (Figura 1b).

Na concentração de 1,0 mg L-1 de 2,4-D23, a concentração de KT foi otimizada. Em 0, 5 mg L-1 KT, a taxa de crescimento do calo foi lenta, a textura era um pouco compacta, e o calo era de cor branca (Figura 2C); na concentração de 0,1 mg L-1 KT, a taxa de crescimento do calo foi a mais alta, até 61,5% (Figura 2a), a textura estava solta, e a cor era amarelada (Figura 2C); Quando o KT foi aumentado para 0,5 mg L-1, o calo foi compacto e irregular e marrom no centro (Figura 2C). Após a seleção da concentração de KT, a concentração de 2,4-D foi mais estudada. Em uma combinação de 1 mg L-1 2, 4-D e 0,1 mg l-1 KT, a taxa de crescimento do calo foi a mais alta, atingindo 46,9%, e o aparecimento do calo foi o melhor (Figura 2b,D).

Após a subcultura 2ND em meios sólidos, mais da metade da superfície de cada folha extirpada foi coberta pelo calo crescente (Figura 3a). Após a 4ª subcultura, as secções foliares foram completamente cobertas pelo calo. Após a 5ª subcultura, a textura do calo começou a se tornar compacta com algumas manchas brancas e marrons na parte inferior.

Quando o ciclo de subcultura foi de 21 dias (Figura 3B), o calo foi vigoroso, mas a maior quantidade de crescimento não foi atingida, indicando que a subcultura frequente resultaria em menor quantidade de calo. Quando o ciclo da subcultura era 28 dias de comprimento, o calo tinha crescido vigorosamente, a cor era cor amarelada e a textura estava solta. Após 35 dias, o calo começou a dourar do centro. O calo estava no pior estado, com uma cor marrom profunda e não mais crescendo, em 42 dias.

Dois tipos de meios líquidos foram comparados por seus efeitos sobre o crescimento do calo e a cor da suspensão celular (Figura 4). Três proporções diferentes do líquido da mãe ao volume total de líquido da cultura foram testadas. Durante os 75 dias do cultivo, a densidade da pilha aumentou gradualmente nas culturas começadas em todas as três relações. A proporção de 15 g de células em 40 mL de mídia fresca (v/v) rendeu um valor de densidade óptica (OD) significativamente maior que a de 4 g em 40 mL (v/v) e 6 g em 40 mL (v/v) (Figura 5a). Após 4 ciclos de subcultura de 28 dias cada, um sistema de suspensão de células de chá foi estabelecido com sucesso a partir de calo de chá estéril em meio líquido B5 (Figura 6).

Figure 1
Figura 1 : Comparação da indução do calo das folhas colhidas e das folhas estéreis do plantlet. (A) comparação da indução do calo a partir das folhas colhidas de plantas de chá cultivadas e das folhas excisadas de plântulas estéreis, cultivadas in vitro. Explantes foram observados para contaminação, escurecimento e indução de calo. (B) comparação do crescimento de calos de folhas derivadas de plantas de chá cultivadas em plantações (conjunto 1) e de plântulas cultivadas in vitro (conjunto 2): as fotografias foram em dias diferentes: 20 (painéis a); 37 (b); 62 (c); e 90 (d). Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : A taxa de crescimento e o status de crescimento do calo derivado da Tea-Leaf concentrações diferentes da hormona de planta. A taxa de crescimento (a) e o estado de crescimento (C) do calo derivado da Tea-Leaf diferentes concentrações de KT e 1 mg L-1 2,4-D; A taxa de crescimento (B) e o estado de crescimento (D) do calo diferentes concentrações de 2,4-d e 0,5 mg L-1 KT. Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Status de Callus após diferentes números de ciclos de subcultura (A) e diferentes comprimentos de ciclos de subcultura (B). Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Influência de diferentes tipos de mídia no crescimento do calo no sistema de cultura de suspensão líquida. (A) meio B5. (B) média MS. Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Os valores de densidade óptica e a coloração TTC. (A) o valor OD680 da suspensão celular iniciou-se em diferentes proporções de 0 a 75 dias; (B) a coloração TTC de células vivas e de controle. Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : O processo de estabelecer uma cultura da suspensão da pilha de chá na temperatura constante (25 ± 1 ° c) em uma incubadora escura. Cultura estéril de plântulas de chá como fonte de explante foliar (a); Folha de chá inoculada no meio MS com 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg l-1) (b); Calo inicial cultivado após 28 dias (c); Callus adequado para suspensão celular após 4 ciclos de subcultura de 28 dias cada (d); As etapas restantes estavam na mesma temperatura mas em uma velocidade constante de 120 RPM em uma incubadora de agitação: Callus inoculado no meio B5 por 7 a 10 dias (e); Suspensão de células semeadas após a remoção do calo precipitado e grande (f); A subcultura da suspensão celular após 1 ciclo de 28 dias (g); Suspensão de células maduras após 3-4 ciclos de subcultura de 28 dias cada (h). Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: o metabolismo de 5 μg/ml de 6 inseticidas em cultura de suspensão de células de chá e em meios de comunicação (CK) incubados a temperatura constante (25 ± 1 ° c) e agitando a velocidade da incubadora (120 rpm) durante 75 dias. Thiamethoxan (A), imidaclopride (B), acetamipride (C), imidaclothiz (D), dimetoato (E1), e ometoato (F); (E2) Produção ao longo do tempo do metabolito do dimetoato (ometoato) produzido em cultura e mídia de células tratadas com dimetoato. Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 2: cromatogramas totais do íon (tiques) dos extratos da cultura de pilha do controle não tratada, Thiamethoxam-cultura de pilha tratada, Thiamethoxam-meios tratados (Cell-Free) após 75 dias. Os picos 1-5, 7 e 8 foram metabólitos do tiametoxam e o pico 6 foi o tiametoxam (A); TICs dos extratos da cultura de pilha dimethoate-tratada, meios dimethoate-tratados (Cell-Free), e pilhas de controle não tratadas após 60 dias. Os picos 1 e 2 foram metabólitos do dimetoato e o pico 3 foi dimetoato (B); Tiques dos extratos de plantas intactas tratadas com tiametoxam (superior) e não tratadas (inferiores) (C); Tiques dos extratos de plantas intactas (superiores) e não tratadas (inferiores) tratadas com dimetoato (D); O metabolito do dimetoato em tR 1,86 min em plantas intactas (D1); Nenhum composto detectado em tR 1,86 min em plantas não tratadas (D2). Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 3: a espectrometria de massas secundária utilizando uplc-qtof de picos derivados de culturas tratadas com (A) tiametoxam e (B) dimetoato. Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 4: a espectrometria de massas secundária utilizando Q-exactive de picos derivados de plantas intactas tratadas com tiametoxam (a1, a2 e a3) e dimetoato (B1 e B2). Este número foi modificado de Jiao et al.24. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

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Discussion

Este artigo apresenta o processo detalhado de estabelecimento de um modelo de metabolismo de pesticidas no tecido vegetal do chá, incluindo a seleção de explantes, a determinação da viabilidade celular, e o estabelecimento de uma cultura de suspensão de células de chá com alta metabólica Atividade. Todas as partes de um tecido vegetal podiam ser usadas para iniciar o calo em um ambiente esterilizado25. As folhas de chá foram escolhidas para a iniciação do calo neste estudo, não somente porque as folhas tendem a ser menos contaminadas do que as partes abaixo da terra, mas igualmente porque são a parte comestível da colheita e o alvo principal da aplicação do insecticida.

Neste estudo, comparou-se a taxa de indução e o estado de crescimento do calo das folhas colhidas do campo e das folhas excisadas de uma planta estéril cultivada in vitro. As folhas estéreis tiveram taxas muito mais baixas de escurecimento e contaminação e uma taxa mais elevada de indução comparada às folhas campo-crescidas. Isto era provável porque as folhas das plantas campo-crescidas não somente se submeteram à esterilização de superfície usando o álcool etílico e o mercúrio mas igualmente uma mudança no ambiente do crescimento, quando as folhas estéreis foram cultivadas em um ambiente estéril e poderiam ser usadas diretamente sem esterilização adicional. Além disso, o calo derivado das plântulas cultivadas in vitro e estéril mostrou um crescimento mais vigoroso do que as folhas cultivadas no campo durante os 90 dias de cultivo. As folhas de plântulas estéreis foram mais adequadas para a indução do calo do chá, não só por causa de sua alta indução de calo e baixas taxas de contaminação, mas também por causa do menor tempo de pré-tratamento e independência dos fatores sazonais.

Para a cultura de calo frouxo e friável, os parâmetros cruciais, principalmente os níveis de regulador de crescimento da planta e comprimento e número de ciclos de subcultura, deve ser otimizado25. 2, 4-D pode efetivamente promover a indução de calo e crescimento e é o hormônio mais amplamente utilizado na cultura de calo26. Os tempos de subcultura e o comprimento do ciclo de subcultura também são importantes para a cultura de calo25. Após 2 a 4 subculturas de 28 dias de cada ciclo, o calo tinha uma textura solta com uma cor amarelada e sem escurecimento. Os experimentos de otimização determinaram que o melhor protocolo de indução de calo foi colocar explantes foliares de plântulas estéreis em meio basal de MS contendo 1 mg L-1 2, 4-D e 0,1 mg l-1 KT e transferir o explante/calo a cada 28 dias para um total de 4 ciclos de subcultura. Este protocolo iniciou o calo frouxo e friável que era apropriado para a iniciação de uma suspensão da pilha.

Na cultura do tecido vegetal, o meio sólido utilizado para o crescimento do calo pode ser usado frequentemente para a cultura da suspensão celular em uma forma líquida23. Considerando que o chá vem sendo uma grande quantidade de polifenóis em meio basal de MS contendo uma alta concentração de sais inorgânicos, resultando no calo Browning27,28. Neste estudo, os meios líquidos B5 e os meios do MS foram ambos testados. As taxas médias de crescimento não foram encontradas diferença significativa entre as duas culturas (16,66% nos meios basais B5 e 15,77% nos meios básicos de MS; Figura 4). Entretanto, os calos eram marrons em meios básicos do MS. Assim, os meios basais B5 foram selecionados no método proposto.

O oxigênio é importante para plantar o crescimento e o metabolismo das células. Na cultura líquida, um volume excessivo de líquido diminuirá a concentração de oxigênio e inibirá o crescimento celular, enquanto muito pouco líquido também inibe o crescimento celular25. Foram testadas várias proporções de líquido para volume de balão (mL de líquido: mL de balão). Com base no peso seco do crescimento celular após 21 d, as razões líquido: balão foram classificadas da seguinte forma: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. Neste estudo, 40 mL de líquido de cultura foi colocado em um balão de 150 mL (40 mL: 150 mL) foi selecionado de acordo com a forma como a suspensão celular olhou como observado a olho nu.

As células vegetais não podem crescer bem quando a densidade da célula é muito alta ou muito baixa. Assim, a proporção de cultura de suspensão de células-mãe para meio fresco no momento da subcultura afeta o potencial de crescimento das células29. Este estudo utilizou o valor de OD da cultura de suspensão celular homogênea para representar a quantidade de crescimento celular. A inoculação com 15 g de líquido materno em 40 mL de volume total de líquido de cultura (v/v) foi adequada para o crescimento celular. A relação da subcultura era igual a entre 1:1 e 1:2 (líquido da mãe da suspensão: meio fresco).

A viabilidade da pilha dentro da cultura da suspensão da pilha de chá foi testada pela mancha de TTC. O composto incolor de TTC pode ser convertido ao formazan colorido vermelho por desidrogenases na mitocôndria de pilhas vivas, mas a cor não pode ser mudada das pilhas inoperantes (Figura 5b). Este método verificou o status de crescimento das células na cultura líquida.

O estabelecimento de uma cultura da suspensão da pilha de chá fornece uma plataforma in vitro fácil da pesquisa para estudar o metabolismo e os metabolitos de insecticidas diferentes. Independente da estação e do tempo, as culturas da suspensão da pilha podem ser tratadas com insecticidas diferentes, concentrações diferentes do ingrediente ativo, e para comprimentos de tempo diferentes. Os metabólitos produzidos nas culturas de suspensão de células de chá foram semelhantes aos extraídos de plantas intactas (Figura suplementar 1 e Figura suplementar 2). Curiosamente, sete metabólitos de tiametoxam e dois metabólitos do dimetoato foram detectados na cultura da suspensão de células de chá, mas apenas dois metabólitos de tiametoxam e um para dimetoato em plantas intactas tratadas (Figura complementar 1, Complementar Figura 2e suplementar Figura 3). Isto pode ser por causa da extração mais fácil das pilhas sem cutícula waxy, menos compostos do chá que interferem com os resultados da espectrometria maciça (o efeito da matriz), ou o perfil mais simples do metabolito de pilhas do chá comparados à planta inteira.

Os resultados mostraram que o tiametoxam foi mais prontamente metabolizado pela célula de chá em comparação com os outros três neonicotinóides (Figura suplementar 4). Ambos os organofosforados (dimetoato e ometoato) foram metabolizados mais rapidamente do que os neonicotinóides. Esses resultados mostram a diversidade das vias metabólicas e da regulação metabólica na célula do chá, que precisam ser mais estudadas.

Usar plantas intactas para estudar o metabolismo do insecticida e identificar Metabolites dos insecticidas apresenta dificuldades numerosas, incluindo barreiras à absorção e ao transporte interurbano de compostos iniciais e da avaria dentro da planta30. Culturas de suspensão celular não só poderia resolver este problema, mas também reduzir a interferência da matriz na análise da amostra em comparação com o extrato de folhas frescas24. Esta pesquisa provou que as culturas da suspensão da pilha de chá são uma plataforma eficaz para estudar o metabolismo de compostos xenobióticos na planta de chá. Ele pode ser servido como um modo de estudar o metabolismo de xenobióticos em outras plantas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo programa nacional de pesquisa & desenvolvimento (2016YFD0200900) da China, a Fundação Nacional de ciência natural da China (n º 31772076 e n º 31270728), China pós-doutorado Science Foundation (2018M630700), e fundo aberto de Laboratório chave do estado da biologia e da utilização da planta do chá (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

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Bioquímica suspensão de células de chá planta de chá intacta inseticida metabolismo vegetal metabolismo espectrometria de massas
Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (<em>Camellia sinensis </em>L.) Folhas
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Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

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