Ce travail présente un protocole pour établir une culture de suspension cellulaire dérivée de feuilles de thé(Camellia sinensis L.) qui peut être utilisée pour étudier le métabolisme des composés externes qui peuvent être pris par l'ensemble de la plante, tels que les insecticides.
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Article de méthode
Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une plate-forme pour étudier le métabolisme des insecticides à l'aide de tissus in vitro de la plante de thé a été développée. Les feuilles des plantulettes stériles de thé ont été induites pour former le callus lâche sur le média basal de Murashige et de Skoog (MS) avec les hormones végétales 2,4-dichlorophenoxyacetic acide (2,4-D, 1.0 mg L-1) et kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus s'est formé après 3 ou 4 tours de sublituring, chacun d'une durée de 28 jours. Le callus lâche (environ 3 g) a ensuite été inoculé dans le support liquide B5 contenant les mêmes hormones végétales et a été cultivé dans un incubateur secouant (120 tr/min) dans l'obscurité à 25 à 1 oC. Après 3-4 sous-cultures, une suspension cellulaire dérivée de la feuille de thé a été établie à un rapport de sous-culture allant de 1:1 à 1:2 (suspension mère liquide: milieu frais). À l'aide de cette plate-forme, six insecticides (5 g mL-1 chaque thiaméthoxam, imidaclopride, acétamipride, imidaclothiz, diméthoate et omethoate) ont été ajoutés dans la culture de suspension cellulaire dérivée des feuilles de thé. Le métabolisme des insecticides a été suivi à l'aide de chromatographie liquide et de chromatographie gazeuse. Pour valider l'utilité de la culture de suspension de cellules de thé, les métabolites du thiaméthoxan et du diméthoate présents dans les cultures cellulaires traitées et les plantes intactes ont été comparés utilisant la spectrométrie de masse. Dans les cultures traitées de cellules de thé, sept métabolites du thiaméthoxan et deux métabolites du diméthoate ont été trouvés, tandis que dans les usines intactes traitées, seulement deux métabolites du thiamethoxam et un de dimethoate ont été trouvés. L'utilisation d'une suspension cellulaire a simplifié l'analyse métabolique par rapport à l'utilisation de plantes de thé intactes, en particulier pour une matrice difficile comme le thé.
Introduction
Le thé est l'une des boissons non alcoolisées les plus consommées dans le monde1,2. Le thé est produit à partir des feuilles et des bourgeons de la forêt use use vivace Camellia sinensis L. Les plantes à thé sont cultivées dans de vastes plantations et sont sensibles à de nombreux insectes nuisibles3,4. Les insecticides organophosphorés et néonicotinoïdes sont souvent utilisés comme insecticides systémiques5 pour protéger les plants de thé contre les ravageurs tels que les mouches blanches, les larves de feuilles et cer....
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Protocole
1. Culture de callus de thé
REMARQUE : Les feuilles stériles ont été dérivées de lignées végétales cultivées in vitro développées pour la première fois dans le groupe de recherche17. Toutes les procédures jusqu'à la section 5 ont été effectuées dans une hotte d'écoulement laminaire stérile, à l'exception du temps de culture dans un incubateur.
- Ajuster le pH des deux supports (le milieu basal de Murashige et Skoog [MS] et le milieu liquide B5 de Gamborg) à 5,8 avant l'autoclatage (121 oC, 20 min).
- Couper le long de la veine moyenne d'une feuille stérile à l'aide de ciseaux, puis subdiviser chaque m....
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Résultats
L'induction du calus à partir de feuilles récoltées dans des arbres à thé cultivés en campagne et à partir de feuilles extraites de plantlettes de thé cultivées in vitro dans un environnement stérile a été comparée en mesurant la contamination, le brunissement et l'induction après 28 jours de culture sur les milieux de La SP ( Figure 1A). La croissance de Callus a été enregistrée à 20, 37, 62 et 90 jours de culture (figure 1B). L.......
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Discussion
Cet article présente le processus détaillé d'établir un modèle du métabolisme de pesticide dans le tissu de plante de thé, y compris la sélection des explants, la détermination de la viabilité de cellules, et l'établissement d'une culture de suspension de cellules de thé avec le métabolisme élevé activité. Toutes les parties d'un tissu végétal pourraient être utilisées pour initier le callus dans un environnement stérilisé25. Les feuilles de thé ont été choisies pour l'initiation du calus dans cet.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program (2016YFD0200900) de Chine, la National Natural Scientific Foundation of China (No. 31772076 et No. 31270728), China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700), et Open Fund of State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acétamipride (99,8 %) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | N° CAS : 135410-20-7 |
| Acétonitrile (CAN, 99,9 %) | Tedia | AS1122-801 | N° CAS : 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technologie | A8190 | N° CAS : 9002-18-0 |
| Clothianidine (99,8 %) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | N° CAS : 210880-92-5 |
| Diméthoate (98,5 %) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | N° CAS : 60-51-5 |
| Imidaclopride (99,8 %) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | N° CAS : 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99,5 %) | Toronto Research Chemical | I275000 | N° CAS : 105843-36-5 |
| Kinétine (KT, >98,0 %) | Solarbio Science & Technologie | K8010 | N° CAS : 525-79-1 |
| Ométhoate (98,5 %) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | N° CAS : 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technologie | P8070 | N° CAS : 25249-54-1 |
| Saccharose | Tocris Bioscience | 5511 | N° CAS : 57-50-1 |
| Thiaméthoxame (99,8 %) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | N° CAS : 153719-23-4 |
| Chlorure de triphényltétrazolium (TTC, 98,0 %) | Solarbio Science & Technologie | T8170 | N° CAS : 298-96-4 |
| Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D, >98,0 %) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | N° CAS : 94-75-7 |
| colonne chirale | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Colonne de chromatographie (30 m × ; 0,25 mm & times ; 0,25 &mu ; m) |
| Chromatographie en phase gazeuse (GC) | Shimadu | 2010-Plus | couplé à un détecteur photométrique de flamme (FPD) ; ; |
| Chromatographie liquide haute performance (HPLC) | Agilent | 1260 | Couplé à un détecteur d’ultraviolets (UV) |
| Colonne HSS T3 C18 | Waters | 186003539 | Colonne de chromatographie (100 mm × ; 2.1 mm & times ; 1.8 &mu ; m) |
| Chromatographie liquide à ultra-hautes performances (UPLC) | Spectromètre | masse à temps de vol quadripolaire en tandem (QTOF) | |
| Chromatographie liquide à ultra-hautes performances (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | connecté à un spectromètre de masse Orbitrap |
Références
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al.
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Réimpressions et autorisations
