Summary
Bu çalışma, bir hücre süspansiyon kültürü çay (Camellia sinensis L.) bu böcek ilaçları gibi tüm bitki tarafından alınabilir dış bileşiklerin metabolizmasını incelemek için kullanılabilir yaprakları türetilen kurulması için bir protokol sunuyor.
Abstract
Çay bitkinin in vitro dokularında kullanarak böcek ilacı metabolizmasını incelemek için bir platform geliştirilmiştir. Steril çay fidanları yaprakları Murashige ve Skoog üzerinde gevşek nasır oluşturmak için indüklenen edildi (MS) bitki hormonları ile bazal medya 2, 4-dichlorophenoxyasetic asit (2, 4-D, 1,0 mg l-1) ve Kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus, her biri 28 gün süren 3 veya 4 turdan sonra kuruldu. Loose nasır (yaklaşık 3 g) daha sonra aynı bitki hormonları içeren B5 sıvı medya içine aşı ve 25 ± 1 °c karanlıkta bir sallayarak kuluçk (120 rpm) kültürlü oldu. 3 − 4 alt kültürden sonra, 1:1 ve 1:2 (süspansiyon anne sıvısı: taze orta) arasında değişen bir alt kültür oranıyla çay yapraklarından türetilen bir hücre süspansiyonu kuruldu. Bu platformu kullanarak, altı böcek öldürücüler (5 μg mL-1 her thiaetoxam, imidacloprid, acetayiprid, imidaclothiz, dimethoate, ve omethoate) çay yaprağı türeyen hücre süspansiyon kültürü içine eklenmiştir. Böcek öldürücülerinin metabolizması sıvı kromatografi ve gaz kromatografi kullanılarak izleniyordu. Çay hücresi süspansiyonu kültürünün kullanışlılığını doğrulamak için, tedavi edilen hücre kültürlerinde ve bozulmamış bitkilerin içinde bulunan thiaminetoxan ve dimethoate metabolitleri kitle spektrometresi kullanılarak karşılaştırıldı. Tedavi edilen çay hücresi kültürlerinde, thiametoksin yedi metabolitleri ve dimethoate iki metabolitleri bulundu, tedavi edilen bozulmamış bitkiler iken, thiametokam sadece iki metabolitleri ve bir dimethoate bulundu. Bir hücre süspansiyonunun kullanımı, özellikle çay gibi zor bir matris için, bozulmamış çay bitkilerin kullanımına kıyasla metabolik analizini basitleştirmiştir.
Introduction
Çay dünya1,2en çok tüketilen alkolsüz içeceklerin biridir. Çay yaprakları ve odunsu çok yıllık Camellia sinensis L. çay bitkileri büyük tarlaları yetiştirilen ve çok sayıda böcek zararlıları için duyarlı olan tomurcukları üretilmektedir3,4. Organophosphorus ve egemenliğinize böcek ilaçları genellikle sistemik böcek öldürücüler olarak kullanılır5 whiteflies gibi zararlıları çay bitkileri korumak için, yaprak Hoppers, ve bazı lepidopteran türler5/6. Uygulamadan sonra, bu böcek öldürücüler bitki içine emilir veya transloke. Tesis içinde, bu sistemik böcek öldürücüler hidroliz, oksidasyon veya bitki enzimlerinin azaltma reaksiyonları yoluyla dönüştürülebilir. Bu dönüşüm ürünleri daha Polar ve üst bileşiklerin daha az toksik olabilir. Ancak, bazı organofosfat için, bazı ürünlerin bioactivities daha yüksektir. Örneğin, acephate daha toksik methasidophos içinde metabolize edilir8,9, ve omethoate içine dimethoate10,11. Bitki metabolik çalışmalar bu nedenle bir bitki içinde bir pestisit kaderini belirlemek için önemlidir12.
Bitki dokusu kültürler pestisit metabolizmasını araştırmak için yararlı bir platform olduğu kanıtlanmıştır, tespit metabolitleri bozulmamış bitkiler bulunan benzer ile13,14,15. Doku kültürlerinin kullanımı, özellikle hücre süspansiyon kültürler, çeşitli avantajları vardır. Öncelikle, deneyler mikroorganizmaların serbest yapılabilir, böylece pestisit dönüşümü veya mikroplar tarafından bozulması müdahalesi kaçınarak. İkincisi, doku kültürü her zaman kullanım için tutarlı malzemeler sağlar. Üçüncüsü, metabolitleri bozulmamış bitkilerin daha doku kültürlerinden ayıklamak için daha kolay, ve doku kültürler genellikle daha az interring bileşikleri ve bileşiklerin daha düşük karmaşıklık var. Son olarak, doku kültürler daha kolay tek bir deneme16pestisit metabolizması bir dizi karşılaştırmak için kullanılabilir.
Bu çalışmada, steril-yetiştirilen çay bağlanırlar yapraklarından türetilen bir hücre süspansiyonu başarıyla kuruldu. Daha sonra çay hücresi süspansiyon kültürü, altı sistemik böcek öldürücülerine ilişkin dağılma davranışlarını karşılaştırmak için kullanılmıştır.
Bu ayrıntılı protokol, araştırmacılar bir bitki dokusu kültür platformu çay Ksenobiyotiklerin metabolik kaderi incelemek için yararlı kurabilir, böylece bazı rehberlik sağlamak için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çay nasır kültürü
Not: steril yaprakları ilk araştırma grubu17geliştirilen içinde vitro-yetiştirilen bağlanırlar hatları türetilmiştir. Bölüm 5 ' e kadar olan tüm prosedürler, bir kuluçte kültür zamanı dışında steril bir laminar akış kaputunda yürütülmüştür.
- İki medyanın pH 'Sını (Murashige ve Skoog [MS] bazal orta ve Gamborg 'un B5 sıvı orta) 5,8 için otoklavlama öncesinde (121 °C, 20 dk) ayarlayın.
- Makas kullanarak steril bir yaprak orta ven boyunca Cut, ve daha sonra bir petri çanak yaklaşık 0,3 cm x 0,3 cm küçük parçalar halinde her yarısını alt bölümlere.
- Steril Method (küçük yaprak parçaları) bitki hormonları 2, 4-D (1,0 mg l-1) ve KT (0,1 mg l-1) içeren MS bazal medya üzerine yerleştirin. Altı Method 100 ml MS bazal medya içeren bir 300 ml Flask yerleştirilebilir.
- Karanlık 25 °c sabit sıcaklıkta Yukarıdaki yaprak Method kültürü. 28 gün sonra, indüklenen nasır ilk nesil seçin ve taze Flask (bir alt kültür) transfer. 3 − 4 alt kültürden sonra gevşek ve kayrak nasır kazanın.
2. çay hücresi süspansiyon kültürü
- Steril koşullarda steril bir cerrahi bıçak kullanarak katı ortamdan küçük parçalara (0,5 − 2 mm aralığında) kadar güçlü, soğuk ve gevşek aramaları keser.
- Küçük arama parçaları yaklaşık 3 gr ağırlığında. 2, 4-D (1,0 mg l-1) ve KT (0,1 mg l-1) ile tamamlayıcı 20 ml B5 sıvı medya içeren bir 150 ml Flask içine nasır yerleştirin.
- Karanlık 120 RPM 'de bir sallayarak inkübörü içinde sabit bir sıcaklıkta (25 ± 1 °C) sıvı hücre süspansiyon kültür.
- 7 ila 10 gün sonra, kültür şişeler kaldırmak ve onları birkaç dakika stand izin.
- Taze orta için alt kültür için tohum malzemesi olarak tüm süpernatant alın (taze orta için süspansiyon anne sıvı alt kültür oranı 1:1 ve 1:2 arasında değişmektedir). Çöktürülmüş, büyük nasırlarını çıkarın.
- Her biri 28 gün 3 − 4 alt kültür döngüsünden sonra son iyi yetiştirilen hücre süspansiyonu kültürünü elde edersiniz.
3. hücre canlılığı Triphenyl tetrazolyum klorür tahlil
- 100 °c ' de canlı hücrelerden oluşan bir numuneyi, canlılığı boyama öncesinde kontrol hücresi olarak 10 dakika boyunca öldür.
- 6000 x g'de 8 dakika boyunca tüm hücre süspansiyonu kültürünü santrifüjle 2,5 ml fosfat-tamponlu tuz (PBS) tampon (pH 7,3) hücrelerinde askıya almadan önce süpernatant çıkarın ve el ile 1 dakika sallayın.
- % 0.4 Triphenyl tetrazolyum klorür (TTC) çözeltisi 2,5 ml ekleyin ve tekrar elle sallayın.
- Karışımı, ayakta bulunan bir kuluçk (30 °C) içinde 1 saat boyunca kulvatın.
4. böcek öldürücüler ile çay hücresi süspansiyon kültürlerinin tedavi ve örnekleme
- Dört neonicotinoidin (thiametoxam) 400 μL filtre sterilize edilmiş stok çözeltisi (500 μg ml-1) bir kısım ekleyin acetayiprid, imidacloprid, ve imidaclothiz) veya iki organophosp, (dimethoate ve omethoate) hücre süspansiyon kültürlerine, Sıra -sıyla.
Not: amaç ksenobiyotik davranışları karşılaştırmak için, farklı bileşikleri test etmek için hücre süspansiyonları aynı anne toplu kullanın. - Sabit sıcaklıkta (25 ± 1 °C) böcek öldürücülerle hücre süspansiyonlarının örneklerine ve kuluçlan hızı (120 rpm) sallama. Örnekleri alın (bkz. Adım 4,3 veya 4,4) 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ve 75 gün.
- Bir neonicotinoid içeren bir örnek test etmek için, homojen hücre kültürünün 1 ml kısım kaldırmak, bir 1,5 ml plastik santrifüj tüp içine yerleştirin ve 2 dakika için 4000 x g Santrifüjü.
- Yüksek performanslı sıvı kromatografi-ultraviyole (HPLC-UV) ve ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi-dört ayaklı zaman-uçuş (UPLC-QTOF) kütlesi ile analizden önce 0,22-μm gözenek boyutunda filtre membranı aracılığıyla Süpernatantları geçirin spektrometri (malzeme tablosu).
- Bir Organophosphate içeren bir örnek test etmek için, hücre kültürünün bir 500 μL kısım kaldırmak ve bir 35 ml santrifüj tüp veya bir 1,5 ml plastik santrifüj tüp içine yerleştirin (neonicotinoid gibi ikinci örnek hazırlayın).
- 0,1 gr sodyum klorür ve 5 mL aseton/etil asetat (3:7, v/v), 500 μL numunelerin 35 mL Santrifüjlü tüpüne ekleyin.
- 1 dakika karışımları Vortex ve sonra onları 10 dakika dinlenmesine izin.
- 2,5 mL 'yi 10 mL 'lik cam tüpüne götürün ve 40 °C ' de azot evaporatör kullanarak yakın kuruluğu Buharlaştırıcı olarak yerleştirin.
- 1 mL aseton, 1 dk için Vortex ile kalıntı çözülür, gaz kromatografi-alev fotometrik dedektör (GC-FPD) tarafından analiz önce bir 0,22-μm filtre membranı üzerinden geçirin.
5. böcek öldürücüler ile bozulmamış çay bitkinin numune hazırlanması
Not: bozulmamış çay bitki deneme bir hidroponik sistemde bir besin çözeltisi 50 mL yetiştirilen çay fidanları kullanarak yapılmıştır (30 NH4+, 10 No3-, 3,1 PO4-, 40 K+, 20 CA2 +, 25 mg2 +, 0,35 Fe2 +, 0,1 B 3 +, 1,0 MN2 +, 0,1 Zn2 +, 0,025 cu2 +, 0,05 Mo+, ve 10 Al3 +, mg L-1)18. Bir deneysel sera, Anhui tarımsal Üniversitesi 'nde 20 °C ' de hafif karanlık bir döngüye (12 saat ışık ve 12 saat karanlığa) sahipti.
- 15 gün boyunca 4 L plastik tencerede beş bitki koyun.
- 0 ppm (kontrol) veya 100 ppm tiaminetoxam veya dimethoate plastik tencere, sırasıyla ekleyin.
- 19perokside daldırmak dışında, önceki yönteme göre bozulmamış bitki örneği hazırlamak ve sonra doğru bir kitle spektrum için kütle spektrometresi ile analiz.
6. enstrüman Analizi
-
Neonicotinoidlerin metabolik davranışının HPLC analizi
- Bir HPLC-UV kullanın (malzeme tablosu) 254 nm bir dalga boyu thiasetoxam ve acetayiprid içeriği ve metabolik ürünleri algılamak için, ve Imidacloprid ve imidaclothiz de 270 Nm örneklerde Bölüm 4,3.
Not: HPLC-UV durumu önceki çalışma19ile aynıydı.
- Bir HPLC-UV kullanın (malzeme tablosu) 254 nm bir dalga boyu thiasetoxam ve acetayiprid içeriği ve metabolik ürünleri algılamak için, ve Imidacloprid ve imidaclothiz de 270 Nm örneklerde Bölüm 4,3.
-
Organofosfatların metabolik davranışının GC Analizi
- (Malzeme tablosu) bir kiral sütun kullanarak bir GC-FPD tarafından Bölüm 4,4 örneklerinde dimethoate ve omethoate içeriğini algılar.
- Azot taşıyıcı gaz olarak kullanın ve 1,0 mL min-1akış hızını ayarlayın.
- İlk sıcaklığı 120 °C ' ye ayarlayın ve 5 dakika tutun. sıcaklığı 150 °C ' de 30 °C dk-1 ' e yükseltin ve 3 dakika tutun. 10 °c Min-1 ' e 170 °C ' ye kadar artış ve 7 dakika tutun. Son olarak 30 °C Min-1 ' e 210 °c ' ye yükseltir ve sonra 5 dakika tutun.
- Enjeksiyon sıcaklığını 200 ° c 'ye ayırısız modda ayarlayın; Dedektör sıcaklığını 250 °C ' ye ayarlayın.
- Enjeksiyon hacmini 1 μL olarak ayarlayın.
-
UPLC-QTOF hücre kültüründe böcek ilacı metabolitleri Analizi
- Bir C18 sütun (malzeme tablosu) Ile UPLC-QTOF kullanarak hücre kültüründe (Bölüm 4,3 örnekleri) böcek öldürücülerin metabolitleri algılayın.
- Akış hızını 0,2 mL min-1olarak ayarlayın. Enjeksiyon hacmini 10 μL olarak ayarlayın.
- Neonicotinoid tedavi numuneleri için, ilk mobil aşamasını% 85 A (5 mM amonyum Format suyu) ve% 15 B (Asetonitril) olarak ayarlayın. 10 dk üzerinde,% 38 için mobil faz B artış ve% 15 geri dönmek 1 dakika, 9 dakika tutun.
- Organofosfat tedavi örnekleri için, ilk mobil faz ayarlayın 55% A (0,1% formik asit suyu) ve 45% B (acetonitrile). Üzerinde 5 dk, artış mobil faz B için 70%, sonra geri dönün 45% B üzerinde 0,5 dk, tutmak için 2,5 dk.
- QTOF işlem parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: gaz sıcaklığı, 325 °C; kurutma gazı (Azot), 10 L min-1; Kılıf gaz sıcaklığı, 350 °C; Kılıf gaz akışı, 11 L min-1; kapiller voltaj, 4000 V; Meme gerilimi, 1000 V; fragmentor voltaj, 100 egemenliğinize böcek ve 110 v için organofosfor böcek öldürücüler için v; Skimmer voltaj, 65 V; pozitif iyon modunda çalışma.
- Cihazı tam tarama spektrumuna ve hedef MS/MS moduna ayarlayın.
- Doğru kütle araçlarını kullanarak verileri işleme; MS/MS ek açıklamanın yanı sıra literatür12,15,20,21,22ile hiçbir standart ürün ile metabolitleri Infer.
-
Bozulmamış bitki ekstresi içinde böcek ilacı metabolitleri UPLC-Orbitrap Analizi
- UPLC-Orbitrap kütle spektrometresi (malzeme tablosu) kullanarak bozulmamış Bitki ekstresinin böcek ilaçlarının metabolitlerini algılayın.
- Kütle spektrometresi (malzeme tablosu) çalışma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: kılıf gaz basıncı, 35 ARB; gaz sıcaklığı, 300 °C; Meme gerilimi, 3,5 KV; kapiller sıcaklığı, 350 °C.
- UPLC-QTOF hücre kültürünün analizi için yukarıdaki (Steps 6.3.3 ve 6.3.4) olarak elüsyon programlarını ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alan yetiştirilen çay ağaçları hasat yaprakları ve steril bir ortamda içinde vitro yetiştirilen çay fidanları gelen yaprakları gelen nasır indüksiyon kontaminasyon ölçümü ile karşılaştırıldığında, Browning, ve indüksiyon sonra 28 MS medya ekimi gün ( Şekil 1a). Callus büyüme 20, 37, 62 ve 90 gün Kültür (Şekil 1B) kaydedildi. İn vitro yetiştirilen yapraklardan elde edilen Nasır, yetiştirmenin tüm 90 gün boyunca alan yetiştirilen yapraklardan elde edilen çağrı daha güçlü bir büyüme gösterdi. Steril yaprakları gelen nasır parlak sarı, alan yetiştirilen yaprakları gelen çağrı kahverengi iken (Şekil 1B).
1,0 bir konsantrasyonda mg L-1 2, 4-D23, kt konsantrasyonu optimize edilmiştir. At 0,05 mg L-1 kt, nasır büyüme oranı yavaş, doku biraz kompakt, ve çağrı rengi beyaz (Şekil 2C); at 0,1 mg L-1 kt konsantrasyon, nasır büyüme oranı en yüksek, kadar 61,5% (Şekil 2a), doku gevşek ve renk sarımsı oldu (Şekil 2C); KT 0,5 mg L-1' e yükseltildiğinde, çağrı merkezi (Şekil 2C) kompakt ve düzensiz ve kahverengi oldu. KT konsantrasyonu seçildikten sonra, 2, 4-D konsantrasyonu daha da incelenmiştir. 1 mg l-1 2, 4-D ve 0,1 mg l-1 kt bir arada, nasır büyüme oranı en yüksek, ulaşan 46,9%, ve nasır görünümü en iyisidir (Şekil 2B,D).
Katı medyada 2ND alt kültürden sonra, her bir eksiz yaprak yüzeyinin yarısından fazlası (Şekil 3A) büyüyen çağrı ile kaplanmıştır. 4. alt kültürden sonra, yaprak bölümler tamamen Callus tarafından kaplanmıştır. 5. Subculture sonra, nasır doku alt bazı beyaz ve kahverengi lekeler ile kompakt olmaya başladı.
Alt kültür döngüsü 21 gün uzun (Şekil 3B) olduğunda, nasır güçlü oldu, ancak en büyük büyüme miktarı ulaşıldı, sık alt kültür daha az çağrı miktarı neden olacağını belirten. Ne zaman alt kültür döngüsü 28 gün uzun, çağrı şiddetle büyüdü vardı, renk sarımsı renk ve doku gevşek oldu. 35 gün sonra, nasır merkezinden kahverengi başladı. The nasır en kötü durumda, derin kahverengi renk ve artık büyüyen, 42 gün oldu.
İki çeşit sıvı medya, nasır büyümesi ve hücre süspansiyonunun rengi üzerindeki etkileri ile karşılaştırıldı (Şekil 4). Üç farklı oranlarda anne sıvısının toplam hacmine ait Kültür sıvısı test edildi. Ekimi 75 gün boyunca, hücre yoğunluğu giderek kültürlerde arttı üç oranlarda başladı. 40 mL 'Lik taze medyada (v/v) 15 g hücrelerinin oranı, 40 mL 'de (v/v) 4 g 'den ve 40 mL 'de (v/v) 6 g 'lik (Şekil 5A) daha yüksek bir optik yoğunluk (OD) değeri sağladı. Her biri 28 gün boyunca 4 alt kültür döngüsünden sonra, bir çay hücresi süspansiyon sistemi B5 sıvı medyasında steril çay çağrısıyla başarıyla kurulmuştur (Şekil 6).
Şekil 1 : Seçilmiş yaprakları ve steril bağlanırlar yaprakları gelen çağrı indüksiyon karşılaştırılması. (A) çiftlikten yetiştirilen çay bitkilerinin hasat edilen yapraklardan gelen arama indüksiyonlarının karşılaştırılması ve steril, in vitro yetiştirilen plantlets gelen yaprakları. Explants kontaminasyon, Browning ve Callus indüksiyon için gözlenmiştir. (B) ağaçlandırma-yetiştirilen çay bitkileri (Set 1) ve steril in vitro yetiştirilen fidanları (Set 2) elde edilen yaprakları arama büyüme karşılaştırması: fotoğraflar farklı günlerde vardı: 20 (paneller a); 37 (b); 62 (c); ve 90 (d). Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Farklı bitki hormonu konsantrasyonları altında çay yaprağı türetilmiş nasır büyüme oranı ve büyüme durumu. Büyüme oranı (A) ve büyüme durumu (C) çay yaprağı türetilen nasır farklı kt konsantrasyonları ve 1 mg L-1 2, 4-D; Farklı 2, 4-d konsantrasyonları ve 0,5 mg L-1 kt altında nasır büyüme oranı (B) ve büyüme durumu (D). Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Alt kültür döngüleri (A) farklı sayıda ve alt kültür döngüleri (B) farklı uzunlukları sonra Callus durumu. Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Sıvı süspansiyon kültürü sisteminde farklı medya türlerinin arama büyümesi üzerine etkisi. (A) B5 orta. (B) MS orta. Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Optik yoğunluk değerleri ve TTC boyama. (A) hücre SÜSPANSIYONUNUN od680 değeri 0 ile 75 gün arasında farklı oranlarda başladı; (B) yaşam ve kontrol hücrelerinin TTC boyama. Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Karanlık bir kuluçardıda sabit sıcaklıkta (25 ± 1 °c) çay hücresi süspansiyon kültürü kurma süreci. Yaprak eksplant kaynağı olarak çay fidanları steril kültürü (a); Çay yaprağı 2, 4-D (1,0 mg l-1) ve KT (0,1 mg l-1) (b) ile MS orta üzerine aşı; 28 gün (c) sonra ilk kültürlü çağrı; Callus hücre süspansiyonu için uygun 4 alt kültür döngüleri sonra 28 gün her (d); Kalan adımlar aynı sıcaklıkta ama 120 rpm bir sallayarak kuluçk içinde sabit bir hızda oldu: Callus B5 orta içine 7 ila 10 gün (e) aşı; Çöktürülmüş ve büyük çağrı (f) çıkardıktan sonra hücre süspansiyonu seeded; 1 döngüsünden sonra hücre süspansiyonunun alt kültürü 28 gün (g); Olgun hücre süspansiyon sonra 3-4 alt kültür döngüleri 28 gün her (h). Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: çay hücresi süspansiyon kültüründe ve medyada (CK) 5 μg/ml 'lik 6 böcek ilacının metabolizması, 75 gün boyunca sabit sıcaklıkta (25 ± 1 °c) inkükuler hızı (120 rpm) ele geçiriyor. Thiaminetoxan (A), Imidacloprid (B), acetaminrid (C), imidaclothiz (D), dimethoate (E1) ve omethoate (F); (E2) Dimethoate (omethoate) metabolitinin zaman içinde üretiliyor. Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: tedavi edilmemiş kontrol hücresi kültüründen özler toplam iyon kromatogram (Ti), thiametoxam-tedavi hücre kültürü, thiametoxam-tedavi medya (hücre-ücretsiz) sonra 75 gün. Doruklarına 1-5, 7 ve 8 tiyaminokam metabolitleri ve Peak 6 thiaminetoxam oldu (A); Dimethoate işlenmiş hücre kültüründen özler tikler, dimethoate-tedavi medya (hücre-ücretsiz), ve tedavi edilmemiş kontrol hücreleri sonra 60 gün. Dorukların 1 ve 2 dimethoate ve Peak metabolitleri oldu 3 dimethoate oldu (B); Tiyaminetoxam-tedavi edilen (üst) ve işlenmemiş (alt) bozulmamış bitkilerin (C) özlerinin ti; Dimethoate-tedavi (üst) ve işlenmemiş (alt) bozulmamış bitkiler (D) gelen özler ti; TR 1,86 min 'de dimethoate metaboliti bozulmamış bitkiler (D1); Tedavi edilmemiş bitkilerin tR 1,86 dk 'Da (D2) hiçbir bileşikler algılanmadı. Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: (A) thiaminetoxam ve (B) dimethoate ile tedavi edilen kültürlerden elde edilen UPLC-QTof zirveleri kullanılarak ikincil kütle spektrometresi. Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: thiaminetoxam (a1, a2 ve a3) ve dimethoate (B1 ve B2) ile tedavi edilen bozulmamış bitkinden elde edilen tepelerin Q-exactive kullanarak ikincil kütle spektrometresi . Bu rakam Jiao ve al.24' ten değiştirildi. Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, explants seçimi, hücre viability belirlenmesi ve yüksek metabolik ile bir çay hücresi süspansiyon kültürünün kurulması da dahil olmak üzere, çay bitki dokusu pestisit metabolizması bir model kurulması ayrıntılı süreci sunar Etkinlik. Bir bitki dokusunun herhangi bir parçası sterilize edilmiş bir ortamda nasır başlatmak için kullanılabilir25. Çay yaprakları bu çalışmada nasır başlatma için seçildi, sadece çünkü yaprakları daha az zemin altında parçaları daha kontamine eğilimindedir, ama aynı zamanda onlar ürün ve pestisit uygulamanın ana hedef yenilebilir parçasıdır çünkü.
Bu çalışmada, alan ve yetiştirilmiş steril bir bağlanırlar 'den gelen yapraklardan gelen kalların indüksiyon oranı ve büyüme durumu karşılaştırıldı. Steril yaprakları çok daha düşük oranları Browning ve kirlilik ve indüksiyon daha yüksek bir oran alan yetiştirilen yaprakları kıyasla vardı. Bu büyük olasılıkla çünkü alan yetiştirilen bitkilerin yaprakları sadece etanol ve cıva kullanarak yüzey sterilizasyonu değil, aynı zamanda büyüme ortamında bir değişiklik yapıldı, steril yaprakları steril bir ortamda yetiştirilmiş ve olmadan doğrudan kullanılabilir iken ek sterilizasyon. Buna ek olarak, Invitro yetiştirilen, steril fidanları türetilen çağrı, Tarım 90 gün boyunca alan yetiştirilen yaprakları daha fazla kuvvetli büyüme gösterdi. Steril fidanları yaprakları daha fazla çay nasır indüksiyon için daha uygun, çünkü onların yüksek nasır indüksiyon ve düşük kontaminasyon oranları, aynı zamanda kısa ön tedavi süresi ve mevsimsel faktörlerin bağımsızlığı nedeniyle.
Kültür gevşek ve kayrak Callus, önemli parametreler, öncelikle bitki büyüme regülatörü seviyeleri ve uzunluğu ve alt kültür döngüleri sayısı, optimize edilmelidir25. 2, 4-D etkili çağrı indüksiyon ve büyüme teşvik ve en yaygın kullanılan hormon nasır kültürü26. Alt kültür süreleri ve alt kültür döngüsü uzunluğu, nasır Culture25için de önemlidir. Her döngüsünün 28 gün 2 ila 4 subkültürler sonra, nasır sarımsı bir renk ve hiçbir Browning ile gevşek bir doku vardı. Optimizasyon denemeleri, en iyi nasır indüksiyon protokolünün, 1 mg l-1 2, 4-D ve 0,1 mg l-1 kt ve explant/nasır her 28 günde bir transfer için MS bazal medyada steril fidanları yaprak Method yerleştirmek olduğunu belirledi Toplam 4 alt kültür döngüsü. Bu protokol, hücre süspansiyonunun başlatılması için uygun olan gevşek ve soğuk bir çağrı başlattı.
Bitki dokusu kültüründe, çağrı büyüme için kullanılan katı orta genellikle sıvı formda hücre süspansiyon kültürü için kullanılabilir23. Ancak, çay büyük miktarlarda polifenoller MS bazal orta inorganik tuzları yüksek konsantrasyon içeren içine gelir, nasır Browning ile sonuçlanan27,28. Bu çalışmada, sıvı B5 medya ve MS medya her ikisi de test edildi. Ortalama büyüme oranları iki kültür arasında önemli bir fark bulunamadı (16,66% B5 bazal medya ve 15,77% MS bazal medyada; Şekil 4). Ancak, çağrı MS bazal medyada kahverengi idi. Yani, önerilen yöntemle B5 bazal medya seçildi.
Oksijen, hücre büyümesini ve metabolizmasını bitki için önemlidir. Sıvı kültüründe, aşırı miktarda sıvı oksijen konsantrasyonunu düşürür ve hücre büyümesini inhibe eder, ayrıca çok az sıvı da hücre büyümesini engeller25. Çeşitli oranlarda sıvı Flask hacmi (mL sıvı: mL Flask) test edildi. 21 d sonra hücre büyüme kuru ağırlığı dayanarak, sıvı: Flask oranları aşağıdaki gibi sıralanır: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. Bu çalışmada, 40 mL kültür sıvısının 150 mL 'lik bir Flask (40 mL: 150 mL) içine konulması, hücre süspansiyonunun çıplak gözle gözlenen şekilde nasıl göründüğünü göre seçilmiştir.
Hücre yoğunluğu çok yüksek veya çok düşük olduğunda bitki hücreleri iyi büyüyemez. Böylece, alt kültür sırasında anne hücresi süspansiyon kültürünün taze ortama oranı hücrelerin büyüme potansiyelini etkiler29. Bu çalışmada hücre büyümesi miktarını temsil etmek için homojen hücre süspansiyon kültürünün OD değerini kullandı. İnoculation ile 15 g anne sıvı içine 40 mL kültür sıvı toplam hacmi (v/v) hücre büyümesi için uygun oldu. Alt kültür oranı 1:1 ve 1:2 arasında eşit oldu (süspansiyon anne sıvı: taze orta).
Çay hücresi süspansiyon kültürü içinde hücre canlılık TTC boyama tarafından test edildi. Renksiz TTC bileşik yaşayan hücrelerin mitokondri içinde dehydrogenases tarafından kırmızı renkli formazan dönüştürülebilir, ama renk ölü hücrelerden değiştirilemez (Şekil 5B). Bu yöntem, sıvı kültürdeki hücrelerin büyüme durumunu doğrulanır.
Bir çay hücresi süspansiyon kültürü kurulması metabolizma ve farklı pestisit metabolitleri okumak için kolay bir in vitro araştırma platformu sağlar. Sezon ve hava koşullarına bağımsız olarak, hücre süspansiyon kültürlerinde farklı pestisit, aktif madde farklı konsantrasyonları ve zaman farklı uzunlukları ile tedavi edilebilir. Çay hücresi süspansiyon kültürlerinde üretilen metabolitler, bozulmamış bitkiler (ek şekil 1 ve ek Şekil 2) çıkarılan bu benzer. İlginçtir, thiametokam ve iki metabolitleri dimethoate yedi metabolitleri çay hücresi süspansiyon kültüründe tespit edildi, ama sadece iki metabolitleri thiasetoxam ve bir dimethoate için tedavi bozulmamış bitkiler (ek Şekil 1, Ek şekil 2ve ek şekil 3). Bu mum Cuticle olmadan hücrelerden daha kolay ekstraksiyon nedeniyle olabilir, çay kütlesi spektrometri sonuçları (matris etkisi), ya da çay hücrelerinin tüm bitki ile karşılaştırıldığında basit metaboliti profili ile müdahale daha az bileşikler.
Sonuçlar, thiaminetoxam daha kolay diğer üç neonicotinoids (ek Şekil 4) ile karşılaştırıldığında çay hücresi tarafından metabolize olduğunu gösterdi. Her iki organofosfat (dimethoate ve omethoate) neonicotinoids daha hızlı metabolize edildi. Bu sonuçlar, daha fazla incelenmelidir çay hücresi, metabolik yollar ve metabolik düzenleme çeşitliliği gösterir.
Böcek ilacı metabolizmasını incelemek ve böcek ilacı metabolitleri tanımlamak için bozulmamış bitkiler kullanarak, bitki30içinde ilk ve arıza bileşiklerinin emilimi ve uzun mesafe taşıma engelleri de dahil olmak üzere çok sayıda zorluklar sunar. Hücre süspansiyon kültürlerinde sadece bu sorunu çözmek değil, aynı zamanda taze yaprakları24özü ile karşılaştırıldığında numune analizinde matris girişim azaltmak. Bu araştırma, çay hücresi süspansiyon kültürlerinin çay fabrikasında ksenobiyotik bileşiklerin metabolizmasını incelemek için etkili bir platform olduğunu kanıtladı. Diğer bitkilerin Ksenobiyotiklerin metabolizmasını incelemek için bir mod olarak servis edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma ulusal anahtar araştırma & geliştirme programı (2016YFD0200900) Çin, Çin Ulusal Doğal bilimsel Vakfı (No. 31772076 ve No. 31270728), Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2018M630700) ve açık Fonu tarafından destekleniyordu Çay tesisi biyoloji ve kullanım devlet anahtar Laboratuvarı (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W.
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
