Summary
Dette arbeidet presenterer en protokoll for å etablere en celle suspensjon kultur avledet fra te (Camellia Sinensis L.) blader som kan brukes til å studere metabolismen av eksterne forbindelser som kan tas opp av hele planten, slik som insektmidler.
Abstract
En plattform for å studere insektmiddel metabolisme bruker in vitro vev av te anlegget ble utviklet. Leaves fra steril te plantlets ble indusert å danne løse Callus på Murashige og Skoog (MS) basal Media med anlegget hormoner 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D, 1,0 mg L-1) og KINETIN (KT, 0,1 mg l-1). Callus dannet etter 3 eller 4 runder med subculturing, hver varig 28 dager. Loose Callus (ca 3 g) ble deretter inokulert i B5 flytende medier som inneholder samme plantehormoner og ble kultivert i en risting inkubator (120 RPM) i mørket ved 25 ± 1 ° c. Etter 3 − 4 subkulturer, en celle suspensjon avledet fra Tea Leaf ble etablert på et under kultur forhold som spenner mellom 1:1 og 1:2 (suspensjon mor væske: fersk medium). Ved hjelp av denne plattformen, seks insektmidler (5 μg mL-1 hver thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, og omethoate) ble lagt inn i te blad-avledet celle suspensjon kultur. Metabolismen av insektmidler ble sporet ved hjelp av flytende kromatografi og gass kromatografi. Å validere nytten av te celle suspensjon kultur, metabolitter av thiamethoxan og dimethoate tilstede i behandlet cellekulturer og intakt planter ble sammenlignet ved hjelp av masse massespektrometri. I behandlede te cellekulturer, syv metabolitter av thiamethoxan og to metabolitter av dimethoate ble funnet, mens i behandlet intakt planter, bare to metabolitter av thiamethoxam og en av dimethoate ble funnet. Bruken av en celle suspensjon forenklet metabolsk analyse i forhold til bruk av intakt te planter, spesielt for en vanskelig matrise som te.
Introduction
Te er en av de mest brukte alkoholfrie drikkevarer i verden1,2. Te er produsert fra bladene og knopper av woody flerårig Camellia Sinensis L. te planter dyrkes i store plantasjer og er mottakelige for mange insekt skade3,4. Organofosfor og neonicotinoid insektmidler blir ofte brukt som systemiske insektmidler5 for å beskytte te planter fra planter som whiteflies, Leaf Hoppers, og noen Lepidoptera arter6,7. Etter påføring blir disse insektmidler absorbert eller translocated inn i anlegget. Innenfor anlegget, kan disse systemiske insektmidler bli forvandlet gjennom hydrolyse, oksidasjon eller reduksjon reaksjoner av plante enzymer. Disse transformasjon produkter kan være mer Polar og mindre giftig enn den overordnede forbindelser. Imidlertid, for noe organophosphates, det bioactivities av noe produktene er høyere. For eksempel er acephate metaboliseres til mer giftig methamidophos8,9, og dimethoate i omethoate10,11. Plant metabolske studier er derfor viktig for å bestemme skjebnen til en plantevernmidler innenfor en plante12.
Plante vev kulturer har vist seg å være en nyttig plattform for å undersøke plantevernmidler metabolisme, med identifiserte metabolitter ligner de som finnes i intakt planter13,14,15. Bruken av vev kulturer, spesielt celle suspensjon kulturer, har flere fordeler. For det første kan eksperimenter utføres uten mikroorganismer, og dermed unngår forstyrrelser av plantevernmidler transformasjon eller degradering av mikrober. For det andre gir vev kultur konsistent materiale til bruk når som helst. For det tredje er metabolitter lettere å trekke ut fra vev kulturer enn fra intakt planter, og vev kulturer ofte har færre interring forbindelser og lavere kompleksitet av forbindelser. Endelig kan vev kulturer lettere brukes til å sammenligne en rekke plantevernmidler metabolisme i et enkelt eksperiment16.
I denne studien ble en celle suspensjon avledet fra bladene av sterile dyrket te plantlet vellykket etablert. Den te celle suspensjon kulturen ble deretter brukt til å sammenligne spredning atferd av seks systemiske insektmidler.
Denne detaljerte protokollen er ment å gi noen veiledning slik at forskerne kan etablere en plante vev kultur plattform nyttig for å studere metabolsk skjebne xenobiotics i te.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tea Callus kultur
Merk: sterile blader er avledet fra in vitro-dyrket plantlet linjer først utviklet i forskningsgruppen17. Alle prosedyrer opp til § 5 ble utført i en steril laminær Flow hette, med unntak av kulturen tid i en inkubator.
- Juster pH i de to mediene (Murashige og Skoog [MS] basal medium og Gamborg ' s B5 flytende medium) til 5,8 før autoklavering (121 ° c, 20 min).
- Skjær langs midten venen av en steril blad med saks, og deretter dele hver halvdel i små biter av ca 0,3 cm x 0,3 cm i en Petri parabolen.
- Plasser sterile explants (den lille blad brikker) på MS basal medier som inneholder plantehormoner 2, 4-D (1,0 mg L-1) og KT (0,1 mg l-1). Seks explants kan plasseres i en 300 mL kolbe som inneholder 100 mL av MS basal medier.
- Kultur ovennevnte blad explants ved en konstant temperatur på 25 ° c i mørket. Etter 28 dager, Velg den første generasjonen av indusert Callus og overføring til fersk kolbe (en under kultur). Skaff deg de løse og friable Callus etter 3 − 4 subkulturer.
2. te celle suspensjon kultur
- Skjær den kraftige, friable og løse hard hud fra det faste mediet i små biter (rekkevidde her 0,5 − 2 mm) ved hjelp av et sterilt kirurgisk blad under sterile forhold.
- Veie om 3 g av det liten stykker av Callus. Plasser Callus i en 150 mL kolbe som inneholder 20 mL B5 væske medium supplert med 2, 4-D (1,0 mg L-1) og KT (0,1 mg l-1).
- Kultur væsken celle suspensjonen ved en konstant temperatur (25 ± 1 ° c) i en risting inkubator på 120 RPM i mørket.
- Etter 7 til 10 dager med dyrking, fjerne kulturen flasker og la dem stå i noen minutter.
- Ta alle supernatanten som frø materiale for under kultur til friskt medium (under kultur ratio av suspensjon mors væske til friskt medium varierte mellom 1:1 og 1:2). Fjern igangsatte, store hard hud.
- Få tak i den siste godt dyrkede celle fjærings kulturen etter 3 − 4 under kultur sykluser på 28 dager hver.
3. trifenylfosfat tetrazolium klorid analyse av celle levedyktighet
- Drep en prøve av levende celler ved 100 ° c i 10 min som en kontroll celle før levedyktighet farging.
- Sentrifuger all celle suspensjon kultur for 8 min ved 6000 x g. Fjern supernatanten før du suspenderer cellene i 2,5 mL av fosfat-bufret saltvanns buffer (PBS) (pH 7,3), og rist den i 1 min for hånd.
- Tilsett 2,5 mL av 0,4% trifenylfosfat tetrazolium klorid (TTC) løsning og rist for hånd igjen.
- Ruge blandingen til 1 time i en stående inkubator (30 ° c).
4. behandling og prøvetaking av te celle suspensjon kulturer med insektmidler
- Tilsett en alikvot på 400 μL av filter-sterilisert lagerløsning (500 μg mL-1) av fire neonicotinoids (thiamethoxam, acetamiprid, imidacloprid og imidaclothiz) eller to organophosphates (dimethoate og omethoate) inn i celle fjærings kulturen, Henholdsvis.
Merk: Hvis målet er å sammenligne xenobiotic oval atferd, bruk samme mor batch av celle suspensjoner for å teste de ulike forbindelsene. - Kultur prøvene av celle suspensjoner med insektmidler ved konstant temperatur (25 ± 1 ° c) og risting inkubator hastighet (120 RPM). Ta prøvene (se trinn 4,3 eller 4,4) på 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 og 75 dager.
- For å teste et utvalg som inneholder en neonicotinoid, Fjern en 1 mL alikvot av den homogene celle kulturen, plasser den i en 1,5 mL plast sentrifuge slange, og sentrifuger ved 4000 x g i 2 min.
- Pass supernatanter gjennom et filter membran med 0,22 μm-størrelse før analysen med høy ytelse flytende kromatografi-ultrafiolett (HPLC-UV) og ultra-høy ytelse flytende kromatografi-quadrupole time-of-Flight (UPLC-QTOF) masse massespektrometri (tabell av materialer).
- For å teste et utvalg som inneholder en organophosphate, Fjern en 500 μL alikvot av celle kulturen og plasser den i en 35 mL sentrifuge slange eller et 1,5 mL plast sentrifugerør (klargjør sistnevnte eksempel som neonicotinoid).
- Tilsett 0,1 g natriumklorid og 5 mL aceton/etanol acetate (3:7, v/v) inn i 35 mL sentrifuge slangen til de 500 μL prøvene.
- Vortex blandinger i 1 min, og deretter la dem hvile i 10 min.
- Ta 2,5 mL av supernatanten inn i en 10 mL glass slange og fordamper til nær tørrhet ved hjelp av en nitrogen fordamper ved 40 ° c.
- Løs opp restene med 1 mL aceton, Vortex for 1 min, send det gjennom en 0,22-μm filter membran før analyse av gass kromatografi-flamme fotometriske detektor (GC-FPD).
5. prøve utarbeidelse av intakt te anlegg med insektmidler
Merk: intakt te anlegget rettssaken ble gjennomført i et hydroponic system ved hjelp av te frøplanter dyrket i 50 mL av et næringsstoff løsning (30 NH4+, 10 nei3-, 3,1 PO4-, 40 K+, 20 ca2 +, 25 mg2 +, 0,35 Fe2 +, 0,1 B 3 +, 1,0 MN2 +, 0,1 Zn2 +, 0,025 Cu2 +, 0,05 Mo+og 10 Al3 +, i mg L-1)18. En eksperimentell drivhus var under en lys-mørk syklus (12 h av lys og 12 h av mørket) ved 20 ° c ved Anhui Agricultural University.
- Sett fem planter i en 4 L plast gryte i 15 dager.
- Legg til 0 ppm (kontroll) eller 100 ppm av thiamethoxam eller dimethoate i plast Potter, henholdsvis.
- Forbered intakt plante prøven i henhold til den forrige metoden, bortsett fra presoaking19, og deretter analysere med masse massespektrometri for en nøyaktig masse spektrum.
6. instrument analyse
-
HPLC analyse av metabolsk atferden til neonicotinoids
- Bruk en HPLC-UV (tabell av materialer) for å oppdage innholdet og metabolske produkter av thiamethoxam og acetamiprid med en bølgelengde på 254 NM, og av imidacloprid og imidaclothiz ved 270 NM i prøver fra § 4,3.
Merk: HPLC-UV-tilstanden var den samme som den forrige studien19.
- Bruk en HPLC-UV (tabell av materialer) for å oppdage innholdet og metabolske produkter av thiamethoxam og acetamiprid med en bølgelengde på 254 NM, og av imidacloprid og imidaclothiz ved 270 NM i prøver fra § 4,3.
-
GC analyse av metabolsk oppførsel av organophosphates
- Oppdag innholdet av dimethoate og omethoate i prøver fra § 4,4 av en GC-FPD ved hjelp av en chiral kolonne (tabell av materialer).
- Bruk nitrogen som transportøren gass og sette strømningshastigheten på 1,0 mL min-1.
- Still inn start temperaturen på 120 ° c, og hold den i 5 min. Øk temperaturen til 150 ° c ved 30 ° c min-1 og hold i 3 min. øk til 170 ° c ved 10 ° c min-1 og hold i 7 min. Til slutt økes det til 210 ° c ved 30 ° c min-1 og hold i 5 min.
- Still inn injeksjons temperaturen til 200 ° c i splitless modus; Still inn detektor temperaturen til 250 ° c.
- Still inn injeksjonsvolumet til 1 μL.
-
UPLC-QTOF analyse av insektmiddel metabolitter i cellekultur
- Oppdage metabolitter av insektmidler i cellekultur (prøver fra § 4,3) ved hjelp UPLC-QTOF med en C18 kolonne (tabell av materialer).
- Sett strømningshastigheten til 0,2 mL min-1. Still inn injeksjonsvolumet til 10 μL.
- For de neonicotinoid prøvene setter du den første mobile fasen til 85% A (5 mM ammonium formiat vann) og 15% B (acetonitril). Over 10 min, øke mobil fase B til 38% og gå tilbake til 15% over 1 min, hold i 9 min.
- For de organophosphate prøvene setter du den første mobile fasen til 55% A (0,1% maursyre yre vann) og 45% B (acetonitril). Over 5 min, øke mobile fase B til 70%, deretter tilbake til 45% av B over 0,5 min, hold i 2,5 min.
- Sett QTOF operasjons parametre som følger: gass temperatur, 325 ° c; tørking gass (nitrogen), 10 L min-1; skjede gass temperatur, 350 ° c; skjede gass flyt, 11 L min-1; kapillær spenning, 4000 V; dyse spenning, 1000 V; fragmentor penning, 100 V for neonicotinoid insektmidler eller 110 V for organofosfor insektmidler; skimmer spenning, 65 V; fungerer i positiv ion-modus.
- Sett instrumentet til full Scan spektrum og målrette MS/MS modus.
- Behandle dataene ved hjelp av nøyaktige masse verktøy; Antyde metabolitter med ingen standard produkter fra MS/MS merknad samt litteraturen12,15,20,21,22.
-
UPLC-Orbitrap analyse av insektmiddel metabolitter i intakt plante ekstrakt
- Oppdage metabolitter av insektmidler i intakt plante ekstrakt ved hjelp av UPLC-Orbitrap masse massespektrometri (tabell av materialer).
- Angi operasjons parametere for masse massespektrometri (materialfortegnelsen) på følgende måte: kappe gasstrykk, 35 arb; gass temperatur, 300 ° c; dyse spenning, 3,5 KV; kapillær temperatur, 350 ° c.
- Sett eluering programmer som ovenfor (trinn 6.3.3 og 6.3.4) for UPLC-QTOF analyse av cellekultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Induksjon av Callus fra bladene høstet fra felt-dyrket te trær og fra blader excised fra te plantlets vokst in vitro i et sterilt miljø ble sammenlignet ved å måle forurensning, Browning, og induksjon etter 28 dager med dyrking på MS Media ( Figur 1a). Callus vekst ble registrert ved 20, 37, 62 og 90 dager med kultur (figur 1B). Callus avledet fra in vitro-vokst bladene viste mer energisk vekst enn den Callus avledet fra felt-dyrket blader i løpet av hele 90 dager med dyrking. Callus fra de sterile bladene var lys gul, mens Callus fra felt dyrket bladene var brune (figur 1B).
Ved en konsentrasjon av 1,0 mg L-1 av 2, 4-D23, konsentrasjonen av KT var optimalisert. På 0,05 mg L-1 kt, den Callus vekstraten var langsom, teksturen var litt kompakt, og Callus var hvit i fargen (figur 2C); på 0,1 mg L-1 kt konsentrasjon, den Callus vekstraten var den høyeste, opp til 61,5% (figur 2a), teksturen var løs, og fargen var gulaktig (figur 2C); Når KT ble økt til 0,5 mg L-1, Callus var kompakt og uregelmessig og brun i midten (figur 2C). Etter KT-konsentrasjonen ble valgt, ble konsentrasjonen av 2, 4-D ytterligere studert. På en kombinasjon av 1 mg L-1 2, 4-D og 0,1 mg l-1 kt, den Callus vekstraten var den høyeste, nådde 46,9%, og utseendet på Callus var den beste (figur 2b,D).
Etter 2nd under kultur på solide medier, mer enn halvparten av overflaten av hver excised blad ble dekket av voksende Callus (figur 3a). Etter de 4th under kultur, var blad seksjoner fullstendig dekket av Callus. Etter 5th under kultur, begynte Callus teksturen å bli kompakt med noen hvite og brune flekker på bunnen.
Da under kultur syklusen var 21 dager lang (figur 3b), var Callus energisk, men den største mengden vekst var ikke nådd, noe som tyder på at hyppig under kultur ville resultere i mindre Callus beløp. Da under kultur syklusen var 28 dager lang, hadde Callus vokst kraftig, fargen var gulaktig farge og teksturen var løs. Etter 35 dager begynte Callus å brune fra sentrum. Den Callus var i verste tilstand, med en dyp brun farge og ikke lenger vokser, på 42 dager.
To typer flytende medier ble sammenlignet for deres virkninger på veksten av Callus og fargen på cellen suspensjonen (Figur 4). Tre forskjellige forhold av mors væske til totalt volum av kultur væske ble testet. I løpet av 75 dager av dyrking, celle tetthet gradvis økt i kulturer startet på alle tre forholdstall. Forholdet mellom 15 g celler i 40 mL friske medier (v/v) ga en verdi for optisk tetthet (OD) signifikant høyere enn for 4 g i 40 mL (v/v) og 6 g i 40 mL (v/v) (figur 5a). Etter 4 under kultur sykluser på 28 dager hver, ble en te celle fjæringssystem vellykket etablert fra steril te Callus i B5 flytende Media (figur 6).
Figur 1 : Sammenligning av Callus induksjon fra plukkede blader og sterile plantlet blader. (A) sammenligning av Callus induksjon fra blader høstet fra plantasje-dyrket te planter og fra blader excised fra sterile, in vitro-dyrket plantlets. Explants ble observert for forurensning, Browning og induksjon av Callus. (B) sammenligning av Callus vekst av blader avledet fra plantasje-dyrket te planter (sett 1) og sterile in vitro-dyrket plantlets (sett 2): fotografier var på forskjellige dager: 20 (paneler a); 37 (b); 62 (c); og 90 (d). Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Vekstraten og vekst status te-Leaf avledet Callus under forskjellige plante hormon konsentrasjoner. Vekstraten (A) og vekst status (C) av Tea-Leaf AVLEDET Callus under forskjellige kt-konsentrasjoner og 1 mg L-1 2, 4-D; Vekstraten (B) og vekst status (D) av Callus under forskjellige 2, 4-D konsentrasjoner og 0,5 mg L-1 KT. Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Callus status etter ulike antall under kultur sykluser (A) og ulike lengder av under kultur sykluser (B). Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Påvirkning av ulike medietyper på Callus vekst i flytende fjærings kultur system. (A) B5 medium. (B) MS medium. Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Den optiske tettheten verdier og TTC farging. (A) OD680 verdi av celle suspensjon startet på ulike forhold fra 0 til 75 dager; (B) den TTC farging av levende og kontroll celler. Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Prosessen med å etablere en te celle suspensjon kultur ved konstant temperatur (25 ± 1 ° c) i en mørk inkubator. Steril kultur te plantlets som kilde til blad explant (a); Tea Leaf inokulert på MS medium med 2, 4-D (1,0 mg L-1) og KT (0,1 mg l-1) (b); Innledende kultivert Callus etter 28 dager (c); Callus egnet for celle oppheng etter 4 under kultur sykluser på 28 dager hver (d); De resterende trinnene var ved samme temperatur, men med en konstant hastighet på 120 RPM i en risting inkubator: Callus inokulert i B5 medium for 7 til 10 dager (e); Seeded celle suspensjon etter fjerning av igangsatte og store Callus (f); Under kultur av celle suspensjon etter 1 syklus av 28 dager (g); Modne celle suspensjon etter 3-4 under kultur sykluser på 28 dager hver (h). Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: metabolismen av 5 μg/ml av 6 insektmidler i te-celle fjærings kultur og i Media (ck) inkubert ved konstant temperatur (25 ± 1 ° c) og risting inkubator hastighet (120 RPM) over 75 dager. Thiamethoxan (A), imidacloprid (B), acetamiprid (C), Imidaclothiz (D), dimethoate (E1) og omethoate (F); (E2) Produksjon over tid av metabolitten av dimethoate (omethoate) produsert i dimethoate cellekultur og media. Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: Total ion Kromatogrammene (rykninger) av ekstrakter fra ubehandlet kontroll cellekultur, thiamethoxam cellekultur, thiamethoxam medier (celle-fri) etter 75 dager. Topper 1-5, 7 og 8 var metabolitter av thiamethoxam og Peak 6 var thiamethoxam (A); Rykninger i ekstrakter fra dimethoate cellekultur, dimethoate medier (celle-fri) og ubehandlede kontroll celler etter 60 dager. Peaks 1 og 2 var metabolitter av dimethoate og Peak 3 var dimethoate (B); Av ekstrakter fra thiamethoxam-behandlet (øvre) og ubehandlet (lavere) intakt planter (C); Av ekstrakter fra dimethoate-behandlet (øvre) og ubehandlet (lavere) intakt planter (D); Metabolitten av dimethoate ved tR 1,86 min i intakte planter (D1); Ingen forbindelser oppdaget ved tR 1,86 min i ubehandlede planter (D2). Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende Figur 3: den sekundære massen MASSESPEKTROMETRI bruker UPLC-QTOF av topper avledet fra kulturer behandlet med (A) thiamethoxam og (B) dimethoate. Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende Figur 4: den sekundære massen massespektrometri bruker Q-Exactive av topper avledet fra intakt plante behandlet med Thiamethoxam (a1, a2 og a3) og Dimethoate (B1 og B2). Dette tallet er endret fra Jiao et al.24. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer den detaljerte prosessen med å etablere en modell av plantevernmidler metabolisme i te plante vev, inkludert valg av explants, fastsettelse av celle levedyktighet, og etablering av en te-celle suspensjon kultur med høy metabolske Aktivitet. Alle deler av et plante vev kan brukes til å initiere Callus i et sterilisert miljø25. Tea bladene ble valgt for Callus innvielse i denne studien, ikke bare fordi bladene til en tendens til å være mindre forurenset enn delene under bakken, men også fordi de er den spiselige delen av avlingen og Hovedmålet for plantevernmidler søknad.
I denne studien, induksjon rate og vekst status Callus fra bladene plukket fra feltet og fra bladene excised fra en steril plantlet vokst in vitro ble sammenlignet. De sterile bladene hadde mye lavere forekomst av Browning og forurensning og en høyere rate av induksjon i forhold til felt-dyrket blader. Dette var sannsynligvis fordi bladene fra felt-dyrket planter ikke bare gjennomgikk overflaten sterilisering ved hjelp av etanol og kvikksølv, men også en endring i vekst miljø, mens sterile bladene ble dyrket i et sterilt miljø og kan brukes direkte uten ytterligere sterilisering. I tillegg Callus avledet fra in vitro-vokst, sterile plantlets viste mer energisk vekst enn felt-dyrket blader i løpet av 90 dager av dyrking. Leaves fra sterile plantlets var mer egnet for induksjon av te Callus, ikke bare på grunn av deres høye Callus induksjon og lav forurensning priser, men også på grunn av kortere pre-behandling tid og uavhengighet fra sesongmessige faktorer.
Til kultur løs og friable Callus, de avgjørende parametrene, primært plantevekst regulator nivåer og lengde på og antall under kultur sykluser, må optimaliseres25. 2, 4-D kan effektivt fremme Callus induksjon og vekst og er den mest brukte hormonet i Callus kultur26. Kultur tider og kulturelle syklus lengder er også viktige for Callus kulturen25. Etter 2 til 4 subkulturer av 28 dager etter hver syklus, hadde Callus en løs tekstur med en gulaktig farge og ingen Browning. Optimaliseringen eksperimenter fastslått at den beste Callus induksjon protokollen var å plassere Leaf explants fra sterile plantlets på MS basal medier som inneholder 1 mg L-1 2, 4-D og 0,1 mg l-1 kt og å overføre explant/Callus hver 28 dager for en totalt 4 under kultur sykluser. Denne protokollen startet løs og friable Callus som var egnet for initiering av en celle suspensjon.
I anlegget vev kultur, fast medium som brukes for Callus vekst kan ofte brukes for celle suspensjon kultur i en flytende form23. Mens, te kommer til å bli store mengder polyfenoler i MS basal medium inneholder en høy konsentrasjon av uorganiske salter, noe som resulterer i Callus Browning27,28. I denne studien ble både flytende B5-medier og MS-Media testet. Den gjennomsnittlige veksten ble funnet noen signifikant forskjell mellom de to kulturene (16,66% i B5 basal Media og 15,77% i MS basal Media; Figur 4). Men hard hud var brune i MS basal Media. Så, B5 basal Media ble valgt i den foreslåtte metoden.
Oksygen er viktig å plante cellevekst og metabolisme. I flytende kultur, et overdreven volum av væske vil redusere oksygenkonsentrasjonen og hemme cellevekst, mens for lite væske hemmer også cellevekst25. Flere forhold med væske til kolbe volum (mL væske: mL kolbe) ble testet. Basert på den tørre vekten av celleveksten etter 21 d, væsken: kolbe prosenter rangert som følger: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. I denne studien ble 40 mL kultur væske plassert i en 150 mL kolbe (40 mL: 150 mL) ble valgt i henhold til hvordan celle fjæringen så ut som observert av det blotte øye.
Plant celler kan ikke vokse godt når celle tettheten er for høy eller for lav. Dermed påvirker andelen av mor cellen suspensjon kultur til friskt medium på tidspunktet for under kultur vekstpotensialet i cellene29. Denne studien brukte OD-verdien av den homogene celle fjærings kulturen til å representere mengden cellevekst. Inoculation med 15 g mors væske i 40 mL totalt volum av kultur væske (v/v) var egnet for cellevekst. Under kultur forholdet var lik mellom 1:1 og 1:2 (suspensjon mors væske: fersk medium).
Cell levedyktighet innenfor te celle suspensjon kulturen ble testet av TTC farging. Den fargeløs TTC sammensatte kan konverteres til den røde fargede formazan ved dehydrogenases i mitokondrier av levende celler, men fargen kan ikke endres fra døde celler (figur 5B). Denne metoden bekreftet vekst status for cellene i flytende kultur.
Etableringen av en te celle suspensjon kultur gir en lett in vitro forskning plattform for å studere metabolisme og metabolitter av ulike plantevernmidler. Uavhengig av sesong og vær, celle oppheng kulturer kan behandles med ulike sprøytemidler, ulike konsentrasjoner av aktiv ingrediens, og for ulike lengder tid. Metabolitter produsert i te celle suspensjon kulturer var lik de Hentet fra intakt planter (supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Interessant, syv metabolitter av thiamethoxam og to metabolitter av dimethoate ble påvist i te celle suspensjon kultur, men bare to metabolitter av thiamethoxam og en for dimethoate i behandlet intakt planter (supplerende figur 1, Supplerende figur 2og supplerende figur 3). Dette kan være på grunn av lettere ekstraksjon fra celler uten voksaktig cuticle, færre forbindelser fra te forstyrrer massen massespektrometri resultater (matrisen effekt), eller den enklere metabolitten profil av te celler i forhold til hele anlegget.
Resultatene viste at thiamethoxam var lettere metaboliseres av te-cellen sammenlignet med de andre tre neonicotinoids (supplerende figur 4). Begge organophosphates (dimethoate og omethoate) metaboliseres raskere enn neonicotinoids. Disse resultatene viser mangfoldet av metabolske trasé og metabolske regulering i te-cellen, som må bli ytterligere studert.
Bruke intakt planter for å studere insektmiddel metabolisme og å identifisere insektmiddel metabolitter presenterer en rekke vanskeligheter, inkludert barrierer for absorpsjon og langdistanse transport av både innledende og sammenbrudd forbindelser innenfor anlegget30. Cell suspensjon kulturer kunne ikke bare løse dette problemet, men også redusere matrise interferens i utvalgs analyse i forhold til ekstrakt fra friske blader24. Denne forskningen viste at te celle suspensjon kulturer er en effektiv plattform for å studere metabolismen av xenobiotic oval forbindelser i te-anlegget. Det kan serveres som en modus for å studere metabolismen av xenobiotics i andre planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale nøkkel forskning & Development program (2016YFD0200900) i Kina, National Natural Scientific Foundation i Kina (nr. 31772076 og nr. 31270728), Kina postdoktor Science Foundation (2018M630700), og Open Fund of State Key laboratorium te Plant biologi og utnyttelse (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W.
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
