Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מציגה פרוטוקול להקמת תרבות ההשעיה התא נגזר תה (Camellia סיננסיס L.) עלים כי ניתן להשתמש כדי ללמוד את חילוף החומרים של תרכובות חיצוניות, כי ניתן לקחת על ידי המפעל כולו, כגון הדברה.

Abstract

פלטפורמה לחקר חילוף החומרים קוטל חרקים באמצעות רקמות מבחנה של צמח תה פותחה. עלים של שתילי תה סטרילי המושרה כדי ליצור שיחה רופפת על מורראשיג ' ו Skoog (MS) בסיס מדיה עם הורמוני הצמח 2, 4-diלורוophenאוקסיאנפנול חומצה (2, 4-D, 1.0 mg L-1) ו kinetin (KT, 0.1 mg l-1). Callus נוצר לאחר 3 או 4 סיבובים של subculturing, כל אחד נמשך 28 ימים. יבלות משוחרר (כ 3 גרם) היה לאחר מכן מחוסן לתוך מדיה נוזלי B5 המכיל את אותו הורמוני צמח היה תרבותי באינקובטור רועד (120 rpm) בחושך ב 25 ± 1 ° c. לאחר 3 שלוש ארבע תרבויות, השעיית תא נגזר מעלה תה הוקמה ביחס תת-תרבות החל בין 1:1 ו 1:2 (אמא ההשעיה נוזל: בינוני טרי). באמצעות פלטפורמה זו, שישה קוטלי חרקים (5 μg mL-1 כל thiamethoxam, imidacloprid, מרחאמפריד, imidacloprid, מתודיטה, ו-omethoate) נוספו לתרבות ההשעיה של התה הנגזר של התא. מעקב אחר חילוף החומרים של הקוטלי חרקים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וכרומטוגרפיה של גז. כדי לאמת את התועלת של תרבות תא תה ההשעיה, מטבוליטים של thiamethoxan ו diמתואט הקיימים בתרביות תאים מטופלים וצמחים שלמים הושוו באמצעות ספקטרומטר מסה. בתרבויות תה מטופלים, שבעה מטבוליטים של טימאמתוסן ושני מטבוליטים של דימיואט נמצאו, בעוד שבצמחים שלמים שטופלו, רק שני מטבוליטים של תיאמטוקסאם ואחד מדיותוטה נמצאו. השימוש בתא מושעה באופן מפושט את ניתוח חילוף החומרים לעומת שימוש בצמחי תה שלמים, במיוחד עבור מטריצה קשה כגון תה.

Introduction

תה הוא אחד המשקאות הלא אלכוהוליים הנפוצים ביותר בעולם1,2. תה מופק מן העלים וניצנים של Camellia סיננסיס וודי צמחי תה מגודלים במטעים עצומים ורגישים מזיקים חרקים רבים3,4. בדרך כלל משתמשים בחומרי הדברה זרחניים ובneonicotinoid, כמו קוטלי חרקים מערכתית5 כדי להגן על צמחי תה ממזיקים כגון ויטנפלאס, העלים, ומינים שחדוניים6,7. לאחר היישום, חומרי הדברה אלה נספגים או ממוקמים בתוך הצמח. בתוך הצמח, קוטלי חרקים מערכתית אלה עשויים להשתנות באמצעות הידרוליזה, חמצון או הפחתת תגובות על ידי אנזימים צמח. מוצרי טרנספורמציה אלה יכולים להיות יותר קוטביים ורעילים פחות מאשר תרכובות האב. עם זאת, עבור חלק מהזרחן, הביו-פעילות של מוצרים מסוימים גבוהה יותר. לדוגמה, acephate הוא מטבוליזם לתוך מתיאמאמאופטות2 הרעילים יותר8,9, ומתועד לתוך omethoate10,11. מחקרים מטבוליים צמחיים חשובים ולכן לקביעת גורלם של חומרי הדברה בתוך צמח12.

תרביות רקמות הצמח הוכחו להיות פלטפורמה שימושית לחקירת חילוף החומרים של חומרי הדברה, עם מטבוליטים מזוהה דומה לאלה שנמצאו צמחים שלמים13,14,15. השימוש בתרביות רקמות, בעיקר בתרבויות ההשעיה של התא, יש מספר יתרונות. ראשית, ניסויים יכולים להתבצע ללא מיקרואורגניזמים, ובכך הימנעות הפרעות של שינוי הדברה או השפלה על ידי חיידקים. שנית, תרבות הרקמה מספקת חומרים עקביים לשימוש בכל עת. שלישית, מטבוליטים קל יותר לחלץ מתרבויות רקמה מאשר צמחים שלמים, ותרבויות רקמה לעתים קרובות יש פחות תרכובות interring והמורכבות הנמוכה של תרכובות. לבסוף, תרבויות רקמה יכול לשמש יותר בקלות כדי להשוות סדרה של חומרי הדברה מטבוליזם בניסוי אחד16.

במחקר זה, השעיית תא נגזר העלים של שתילי תה סטרילי מבוגרים הוקמה בהצלחה. התרבות ההשעיה של תא התה הייתה משמשת להשוואת התנהגויות הפיזור של שישה קוטלי חרקים מערכתית.

פרוטוקול זה מפורט נועד לספק מספר הדרכה כך החוקרים יכולים להקים מפעל התרבות הצמח פלטפורמה שימושי לחקר גורלם של מטבולית של xenobiotics לתה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התרבות שלנו תה

הערה: העלים הסטריליים נגזרו מתוך שורות מחוץ לתחום שפותחו לראשונה בקבוצת המחקר17. כל ההליכים עד לסעיף 5 בוצעו במכסה זרימה סטרילית, למעט זמן התרבות בחממה.

  1. כוונן את ה-pH של שתי המדיות (מורראשיג ו-Skoog [MS] המדיום הבזאלי ו-B5 בינוני נוזלי של גאמבורג) עד 5.8 לפני האוטוקלינג (121 ° c, 20 דקות).
  2. חותכים לאורך הווריד האמצעי של עלה סטרילי באמצעות מספריים, ולאחר מכן לחלק כל חצי לחתיכות קטנות של כ 0.3 ס"מ x 0.3 ס"מ צלחת פטרי.
  3. מניחים את explants סטרילי (חתיכות עלה קטן) אל מדיה MS בסיס המכיל את ההורמונים צמח 2, 4-D (1.0 mg L-1) ו-KT (0.1 mg l-1). שישה explants ניתן להציב בבקבוקון 300 mL המכיל 100 mL של מדיה בסיס MS.
  4. התרבות של העלה למעלה בטמפרטורה מתמדת של 25 ° c בחשכה. לאחר 28 ימים, בחר את הדור הראשון של יבלות המושרה ולהעביר בקבוקון טרי (תת-תרבות). לרכוש את השיחה רופף ומשוחרר לאחר 3-4 ל -4 תרבויות.

2. התליה של תא תה

  1. חותכים את היבלות הנמרצת, הפריכים והרופפים מהמדיום המוצק לחתיכות קטנות (טווח כאן 0.5-2 מ"מ) באמצעות להב כירורגי סטרילי בתנאים סטריליים.
  2. שוקלים בערך 3 גר'. מהחלקים הקטנים של הקריאה מניחים את הטלפון לתוך בקבוקון 150 mL המכיל 20 מ ל של B5 מדיה נוזלית בתוספת 2, 4-D (1.0 mg L-1) ו-KT (0.1 mg l-1).
  3. תרבות תא נוזלי מושעה בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° c) באינקובטור רועד ב 120 סל ד בחושך.
  4. לאחר 7 עד 10 ימים של culturing, להסיר את מבחנות התרבות ולתת להם לעמוד כמה דקות.
  5. לקחת את כל supernatant כמו חומר הזרע עבור תת-תרבות למדיום טרי (יחס התרבות של התלוי האם נוזל מדיום טרי נע בין 1:1 ו 1:2). , הסר את הזירז. יבלות גדולות
  6. השג את התרבות הסופית ההשעיה התא הסופי לאחר 3 על 4 מחזורי תת-תרבות של 28 ימים כל אחד.

3. היכולת של טריפנקסיל כלוריד של הכדאיות התאית

  1. להרוג מדגם של תאים חיים ב 100 ° c עבור 10 דקות כמו תא בקרה לפני כתמים הכדאיות.
  2. צנטריפוגה את כל התרבות ההשעיה התא עבור 8 דקות ב 6000 x g. הסר את הסופרנטנט לפני השעיית התאים ב-2.5 mL של מאגר מלוחים באגירה פוספט (pH 7.3), ונער אותו עבור 1 דקות ביד.
  3. הוסף 2.5 מ"ל של 0.4% triphenyl כלוריד (TTC) הפתרון ולטלטל ביד שוב.
  4. מודאת התערובת עבור 1 h באינקובטור עומד (30 ° c).

4. טיפול ודיגום תרבויות תה התליה עם קוטלי חרקים

  1. להוסיף סדרת מחלקים של 400 μl של מסנן-הפתרון מלאי מעוקר (500 μg-1) של ארבעה neonicotinoids (thiamethoxam, מרחאמפריד, imidacloprid, ו imidacloprid) או שני זרחנים (מתודיטה ו omethoate) לתוך התרבויות התא ההשעיה, בהתאמה.
    הערה: אם המטרה היא להשוות התנהגויות xenobiotic יוטי, להשתמש באותה אצווה אמא של השעיות התא כדי לבדוק את תרכובות שונות.
  2. התרבות דגימות של השעיות תא עם קוטלי חרקים בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° c) וטלטול מהירות החממה (120 rpm). קח את הדגימות (ראה שלב 4.3 או 4.4) על 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ו-75 ימים.
  3. כדי לבדוק מדגם המכיל neonicotinoid, להסיר את 1 mL של התרבות התא הומוגנית, למקם אותו לתוך שפופרת הצנטריפוגה פלסטיק 1.5 mL, וצנטריפוגה ב 4000 x g עבור 2 דקות.
    1. להעביר את הסופרנטנים דרך ממברנה מסנן 0.22-μm בגודל הנקבוביות לפני ניתוח על ידי ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-אולטרה סגול (כדיקות-UV) וביצועים גבוהים ביותר כרומטוגרפיה נוזלית-המוט פי ארבעה של הטיסה (חברת התעופה-QTOF) מסה ספקטרומטריה (טבלת חומרים).
  4. כדי לבדוק מדגם המכיל זרחן, להסיר את ה500 μl סדרת מחלקים של תרבות התא ומקום לתוך שפופרת צנטריפוגה של 35 ml או שפופרת הצנטריפוגה מפלסטיק ל 1.5 ml (להכין את המדגם האחרון כמו זה של neonicotinoid).
    1. הוסף 0.1 g של נתרן כלוריד ו 5 מ ל של אצטון/אתיל אצטט (3:7, v/v) לתוך שפופרת הצנטריפוגה של ה35 mL של דגימות μL 500.
    2. מערבולת התערובות עבור 1 דקות, ולאחר מכן לאפשר להם לנוח 10 דקות.
    3. קח 2.5 mL של supernatant לתוך 10 מ"ל זכוכית שפופרת והתנדפה ליובש באמצעות מאייד חנקן ב 40 ° c.
    4. לפזר את שאריות עם 1 מ ל אצטון, מערבולת עבור 1 דקות, להעביר אותו דרך ממברנה מסנן 0.22-μm לפני ניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה-הלהבה גלאי פוטומטרי (GC-FPD).

5. הכנת לדוגמא של צמח תה שלם עם קוטלי חרקים

הערה: משפט צמח תה שלמים נערך במערכת ידרופוני באמצעות שתילי תה גדל ב 50 mL של פתרון תזונתי (30 NH4+, 10 לא3-, 3.1PO 4-, 40 K+, 20 Ca2 +, 25 מ"ג2 +, 0.35 Fe2 +, 0.1 B 3 +, 1.0 Mn2 +, 0.1 zn2 +, 0.025 Cu2 +, 0.05 מו+, ו 10 אל3 +, ב mg L-1)18. חממה ניסיונית היתה תחת מחזור אור כהה (12 h של אור ו 12 h של חושך) ב 20 ° c באוניברסיטה החקלאית אנחווי.

  1. לשים 5 צמחים בסיר פלסטיק 4 L עבור 15 ימים.
  2. הוסף 0 עמודים לדקה (בקרה) או 100 עמודים לדקה של thiamethoxam או מתועד לסירים פלסטיים, בהתאמה.
  3. הכינו את דגימת הצמחים השלמה על פי השיטה הקודמת, למעט הטבילה19, ולאחר מכן לנתח עם ספקטרומטר מסה לספקטרום מסה מדויק.

6. ניתוח כלי הנגינה

  1. ניתוח האבחון של התנהגות המטבולית של neonicotinoids
    1. השתמש ב-בדיקות-UV (טבלת חומרים) כדי לזהות את התוכן ואת מוצרי חילוף החומרים של thiamethoxam ו מרחאמפריד באורך גל של 254 ננומטר, ו imidacloprid ו imidacloprid ב 270 ננומטר בדגימות מסעיף 4.3.
      הערה: החלת המבחון-UV הייתה זהה למחקר הקודם19.
  2. GC ניתוח של התנהגות מטבולית של זרחן
    1. לזהות את תוכן המיתוקות והמיתוקות בדגימות מסעיף 4.4 על-ידי כללי השימוש ב-GC-FPD באמצעות עמודת כיראאל (טבלת חומרים).
    2. השתמשו בחנקן כגז המוביל וקבעו את קצב הזרימה ב-1.0 mL min-1.
    3. הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית ל-120 ° c, והחזק אותו במשך 5 דקות. הגדל את הטמפרטורה ל-150 ° c ב-30 ° c מינימום-1 והחזק 3 דקות. הגדלה ל-170 ° c ב -10 ° c מינימום-1 והחזיקו מעמד 7 דקות. לבסוף לעלות ל 210 ° c ב 30 ° c מינימום1 ולאחר מכן להחזיק 5 דקות.
    4. הגדר את טמפרטורת ההזרקה ל-200 ° צ' במצב ללא שורשים; הגדר את טמפרטורת הגלאי ל-250 ° c.
    5. הגדר את אמצעי האחסון להזרקה ל-1 μL.
  3. החברה לניתוח מטבוליטים קוטל חרקים בתרבית תאים
    1. לזהות את מטבוליטים של קוטלי החרקים בתרבות התא (דגימות מסעיף 4.3) באמצעות ה-סי18 c-QTOF עם עמודה (טבלת חומרים).
    2. הגדר את קצב הזרימה ל-0.2 mL min-1. הגדר את אמצעי האחסון להזרקה ל-10 μL.
    3. לדגימות שטופלו על-ידי neonicotinoid, הגדר את השלב הנייד ההתחלתי ל-85% A (5 מילימטר אמוניום) ו -15% B (acetonitrile). מעל 10 דקות, להגדיל את שלב הנייד B כדי 38% ולחזור 15% מעל 1 דקות, להחזיק עבור 9 דקות.
    4. עבור הדגימות האנטי-זרחתית, הגדר את השלב הנייד ההתחלתי ל-55% A (0.1% החומצה פורמית) ו-45% B (acetonitrile). מעל 5 דקות, להגדיל את השלב הנייד B כדי 70%, ואז לחזור 45% של B על 0.5 דקות, החזק עבור 2.5 min.
    5. הגדר את פרמטרי הפעולה של QTOF כדלקמן: טמפרטורת הדלק, 325 ° c; ייבוש גז (חנקן), 10 L min-1; גז נדן טמפרטורה, 350 ° צ'; גז מעטפת זרם, 11 L min-1; מתח נימי, 4000 V; מתח זרבובית, 1000 V; מ100 V לחומרי הדברה מneonicotinoid או 110 V לקוטלי חרקים מזרחן; מתח מזרן, 65 V; פועל במצב יון חיובי.
    6. הגדר את המכשיר לספקטרום הסריקה המלאה והיעד MS/MS מצב.
    7. עיבוד הנתונים באמצעות כלי מסה מדויקים; להסיק את מטבוליטים ללא מוצרים סטנדרטיים מתוך ביאור ms/ms, כמו גם את הספרות12,15,20,21,22.
  4. בדיקת מטבוליטיס של קוטל חרקים בתמצית צמח שלם
    1. זיהוי מטבוליטים של קוטלי החרקים בתמצית צמחים שלמה בעזרת הספקטרומטר המסה של הבנק הגדול (שולחן חומרים).
    2. הגדר את הפרמטרים של הספקטרומטר המסה (טבלת חומרים) כדלקמן: לחץ גז נדן, 35 arb; טמפרטורת הדלק, 300 ° c; מתח זרבובית, 3.5 KV; טמפרטורת נימי, 350 ° c.
    3. הגדר את התוכניות הללו כמוצג לעיל (שלבים 6.3.3 ו-6.3.4) לניתוח של התרבות התאית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האינדוקציה של יבלות מעלים שנקטפו מן השדה הגדלים עצי תה ומעלים שנקטח מתוך שתילי תה גדל בתוך מבחנה בסביבה סטרילית הושווה על ידי מדידת זיהום, בראונינג, ו אינדוקציה לאחר 28 ימים של טיפוח על MS מדיה ( איור 1A). צמיחה callus הוקלטה ב 20, 37, 62 ו 90 ימים של תרבות (איור 1B). הקריאה הנגזרת מן העלים מחוץ לתחום הגדילה הראתה צמיחה נמרצת יותר מאשר הקריאה שנגזר מעלי השדה הגדלים במשך כל 90 הימים של הטיפוח-תרגול. הקריאה מהעלים הסטריליים הייתה צהובה בהירה, בעוד שהקריאה מהעלים הגדולים של השדה הייתה חומה (איור 1B).

בריכוז של 1.0 mg L-1 של 2, 4-D23, הריכוז של KT היה אופטימיזציה. ב 0.05 mg L-1 KT, שיעור הצמיחה של יבלות היה איטי, המרקם היה קומפקטי מעט, ואת יבלות היה לבן בצבע (איור 2c); ב 0.1 mg L-1 קשר הריכוז, שיעור הצמיחה יבלות היה הגבוה ביותר, עד 61.5% (איור 2a), המרקם היה רופף, והצבע היה צהבהב (איור 2a); כאשר KT הוגדלה כדי 0.5 mg L-1, הטלפון היה קומפקטי ולא סדיר וחום במרכז (איור 2c). לאחר שנבחר ריכוז קאפה-טאו, הריכוז של 2, 4-D נחקר עוד. בשילוב של 1 מ"ג ל-1 2, 4-D ו 0.1 mg l-1 KT, שיעור הצמיחה יבלות היה הגבוה ביותר, להגיע 46.9%, ואת המראה של יבלות היה הטוב ביותר (איור 2b,D).

לאחר התת-תרבות 2 על מדיה מוצק, יותר ממחצית המשטח של כל עלה מגורש היה מכוסה על ידי הגוברת יבלות (איור 3a). לאחר התת-תרבותה -4, מקטעי העלה היו מכוסים לחלוטין על ידי שיחות. לאחר התת-תרבותה -5, מרקם יבלות החל להיות קומפקטי עם כמה כתמים לבנים וחומים בתחתית.

כאשר מחזור תת-תרבות היה 21 ימים (איור 3b), יבלות היה נמרץ, אבל את הכמות הגדולה ביותר של הצמיחה לא הגיע, המציין כי תת-תרבות תכופים יגרום כמות פחות יבלות. כאשר מחזור תת-תרבות היה 28 ימים, הקריאה גדלה במרץ, הצבע היה צבע צהבהב והמרקם היה רופף. אחרי 35 ימים, השיחה החלה לחום מהמרכז. הקריאה הייתה במצב הגרוע ביותר, עם צבע חום עמוק והיא כבר לא גדלה, ב42 ימים.

שני סוגים של מדיה נוזלית הושוו על ההשפעות שלהם על הצמיחה של יבלות ואת הצבע של ההשעיה התא (איור 4). שלוש שונות של האם נוזלי לנפח הכולל של התרבות הנוזלית נבדקו. במהלך 75 הימים של התרגול, צפיפות התא גדלה בהדרגה בתרבויות החלה בכל שלושת היחסים. היחס של 15 גרם תאים ב 40 mL מדיה טרייה (v/v) הניבה צפיפות אופטית (OD) ערך גבוה באופן משמעותי מזה של 4 g ב 40 mL (v/v) ו 6 g ב 40 mL (v/v) (איור 5A). לאחר 4 מחזורי תת-תרבות של 28 ימים כל אחד, תא תה הבולם המערכת הוקמה בהצלחה של יבלות תה סטרילי ב מדיה נוזלית B5 (איור 6).

Figure 1
איור 1 : השוואה של האינדוקציה יבלות העלים הרים ושתילי סטרילי עלים. (א) השוואה של האינדוקציה יבלות מעלים שנקטפו מתוך צמחי מטעי תה ומעלים שנקטקה, בגידולים מחוץ למבחנה. הרחבות נצפו לזיהום, בראונינג ואינדוקציה של callus. (ב) השוואה של צמיחת העלים הנובעים מצמחי תה שגדלו במטע (סט 1) וסטרילי בגידולים מחוץ למבחנה (set 2): תמונות היו בימים שונים: 20 (פאנלים a); 37 (ב); 62 (ג); ו-90 (ד). דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : קצב הצמיחה ומצב הצמיחה של עלה תה נגזר מתחת לריכוזים שונים של הורמון צמחים. שיעור הצמיחה (A) ומצב גדילה (ג) של עלה תה נגזר מתחת לריכוזים שונים KT ו 1 מ"ג ל-1 2, 4-D; שיעור הצמיחה (ב) ומצב הצמיחה (D) של יבלות תחת שונים 2, 4-D ריכוזים ו 0.5 mg L-1 KT. דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : סטטוס Callus לאחר מספר שונה של מחזורי תת-תרבות (א) ואורכים שונים של מחזורי תת-תרבות (ב). דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : השפעה של סוגי מדיה שונים על צמיחה יבלות במערכת תרבות ההשעיה נוזל. (A) B5 בינוני. (ב) MS בינונית. דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : ערכי צפיפות אופטית וכתמים TTC. (A) ה-OD680 ערך ההשעיה של התא התחיל ביחס שונה מ -0 עד 75 ימים; (ב) הצביעת ttc של תאי חיים ושליטה. דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : תהליך הקמת תרבות תא תה תלוי בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° c) באינקובטור כהה. תרבות סטרילית של שתילי תה כמקור של העלה לחקור (א); עלה תה מחוסן על MS בינונית עם 2, 4-D (1.0 mg L-1) ו-KT (0.1 mg l-1) (ב); שיחה תרבותית ראשונית לאחר 28 ימים (ג); Callus מתאים ההשעיה התא לאחר 4 מחזורי תת-תרבות של 28 ימים כל אחד (ד); השלבים הנותרים היו באותה טמפרטורה, אבל במהירות מתמדת של 120 סל ד בחממה רועד: Callus מחוסן לתוך מדיום B5 עבור 7 עד 10 ימים (e); השעיית תא הזריעה לאחר הסרת הזירז והקריאה הגדולה (f); תת-תרבות של ההשעיה של התא לאחר 1 מחזור של 28 ימים (g); ההשעיה התא בוגרת לאחר 3-4 מחזורי תת-תרבות של 28 ימים כל אחד (h). דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משלימה איור 1: חילוף החומרים של 5 μg/mL של 6 הקוטלי חרקים בתרבות תא תה ההשעיה ובמדיה (CK) מודקרת בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° צ') ולרעוד מהירות החממה (120 rpm) מעל 75 ימים. תאמתוסן (א), איממיאכלופריד (ב), רחאמפריד (ג), איממיאכולוז (ד), דיתואט (E1), ו-omethoate (נ); (היכל ה,E2) הפקה במשך הזמן של המטטבוליט של דימואט (omethoate) המיוצרים בתרבות תא ומדיה המטופלת בדימואט. דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 2: יון כרומאטוגרמות כולל (טיקים) של תמציות מתרבות תא שליטה מטופלת, thiamethoxam, הטיפול בתרבות התא, מדיה התייחס thiamethoxam (ללא תא) לאחר 75 ימים. פסגות 1-5, 7 ו 8 היו מטבוליטים של thiamethoxam והפסגה 6 היה thiamethoxam (א); טיקים של תמציות מתוך תרבות התא מטופלים התייחס, diמתואט-מדיה מטופלים (ללא תא), ותאי בקרה לא מטופלים לאחר 60 ימים. פסגות 1 ו-2 היו מטבוליטים של דיתואט ו-שיא 3 היה מתואט (ב); טיקים של תמציות מתוך thiamethoxam-טיפול (העליון) ולא מטופל (נמוך) צמחים שלמים (C); טיקים של תמציות מתותואט (העליון) ולא מטופל (נמוך) צמחים שלמים (D); המטטבוליט של דיתואט ב- tR 1.86 min בצמחים שלמים (D1); תרכובות לא זוהו ב tR 1.86 min בצמחים לא מטופל (D2). דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 3: הספקטרומטר מסה משנית באמצעות התעשייה השנייה, הנגזרת מתרבויות (א) טמשתוקסאם (ב) ומתותיה. דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 4: מהספקטרומטר מסה משנית באמצעות הפסגות הנגזרות מצמח שלם שטופלו ב-thiamethoxam (A1, A2 ו- A3) ודימיוטה (B1 ו- B2). דמות זו שונתה מ-Jiao ואח '24. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מציג את התהליך המפורט של הקמת מודל של חילוף חומרים של חומרי הדברה ברקמת צמח תה, כולל הבחירה של explants, קביעת הכדאיות של התא, והקמת תרבות תא תה ההשעיה עם מטבולית גבוהה פעילות. חלקים כלשהם של רקמת הצמח יכול לשמש כדי ליזום יבלות בסביבה מחוטאת25. עלי תה נבחרו עבור חניכה יבלות במחקר זה, לא רק בגלל שהוא משאיר נוטים להיות מזוהמים פחות חלקים מתחת לקרקע, אבל גם בגלל שהם החלק האכיל של היבול ואת היעד העיקרי של יישום חומרי הדברה.

במחקר זה, שיעור אינדוקציה מעמד הצמיחה של יבלות מעלים שנבחר מן השדה ומעלים החוצה מצמח סטרילי גדל בתוך מבחנה השוו. העלים סטרילי היו הרבה יותר נמוך של בראונינג וזיהום ושיעור גבוה יותר של אינדוקציה לעומת עלים מגודלים בשדה. זה היה סביר כי העלים מצמחים מגודלים לא רק עברו עיקור באמצעות אתנול וכספית אלא גם שינוי בסביבת הצמיחה, בעוד עלים סטרילי טיפח בסביבה סטרילית ניתן להשתמש ישירות ללא עיקור נוספים. בנוסף, הקריאה הנגזרת מהשתילי הסטרילי, הגדלה והסטרילית, הראתה צמיחה נמרצת יותר מאשר העלים הגדלים במהלך 90 הימים של הטיפוח-תרגול. עלים של שתילי סטרילי היו מתאימים יותר עבור האינדוקציה של יבלות תה, לא רק בגלל האינדוקציה שלהם גבוהה יבלות ושיעורי זיהום נמוך, אלא גם בגלל הזמן הקצר יותר טרום הטיפול ועצמאות מגורמים עונתיים.

כדי התרבות משוחרר, שניתן לחיכוך, הפרמטרים הקריטיים, בעיקר צמח הוסת הצמיחה רמות ואורך של ומספר מחזורי תת-תרבות, חייב להיות ממוטב25. 2, 4-D יכול ביעילות לקדם את האינדוקציה יבלות וצמיחה הוא הורמון הנפוץ ביותר בתרבות יבלות26. זמני התרבות ואורך המחזור של תת-התרבות חשובים גם לתרבותם של החברה25. לאחר 2 עד 4 תרבויות משנה של 28 ימים של כל מחזור, השיחה היתה מרקם רופף עם צבע צהבהב ולא בראונינג. ניסויים אופטימיזציה קבע כי הפרוטוקול הטוב ביותר יבלות היתה למקום explants עלים מן שתילי סטרילי על מדיה בסיס MS המכיל 1 מ"ג l-1 2, 4-D ו 0.1 mg l-1 KT וכדי להעביר את ההסבר/יבלות כל 28 ימים עבור סך של 4 מחזורי תת-תרבות. פרוטוקול זה התחיל משוחרר והולם יבלות שהיה מתאים ייזום של השעיית תא.

בתרבות רקמת הצמח, המדיום מוצק המשמש לצמיחה יבלות יכול לעתים קרובות לשמש לתרבות ההשעיה התא בצורה נוזלית23. בעוד, תה מגיע להיות כמויות גדולות של פוליפנולים במדיום MS בסיס המכיל ריכוז גבוה של מלחים אורגניים, וכתוצאה מכך יבלות בראונינג27,28. במחקר זה, מדיה B5 נוזלי ו-MS מדיה נבדקו שניהם. שיעורי הצמיחה הממוצעת נמצאו ללא הבדל משמעותי בין שתי התרבויות (16.66% ב-B5 המדיה הבזליים ו 15.77% ב-MS בסיס מדיה; איור 4). עם זאת, היבלות היו חומות במדיה הבזליים של MS. כך, המדיה הבזליים B5 נבחרה בשיטה המוצעת.

חמצן חשוב לשתול צמיחת תאים וחילוף חומרים. בתרבות הנוזלית, נפח מופרז של נוזל תפחית את ריכוז החמצן ויעכב את צמיחת התאים, בעוד שמעט מאוד נוזלי גם מעכב את צמיחת התאים25. מספר יחסי של נוזל בקבוקון נפח (mL נוזלי: בקבוקון mL) נבדקו. בהתבסס על המשקל היבש של צמיחת התאים לאחר 21 ד, הנוזל: יחסי בקבוקון מדורגים כדלקמן: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. במחקר זה, 40 mL של התרבות נוזלי הוצב בבקבוקון 150 mL (40 mL: 150 mL) על פי איך ההשעיה התא נראה כפי שנצפתה על ידי עין בעירום.

תאי צמחים אינם יכולים לצמוח היטב כאשר צפיפות התא גבוהה מדי או נמוכה מדי. כך, את החלק של התרבות אמא תא ההשעיה למדיום טרי בזמן של תת-תרבות משפיע על פוטנציאל הצמיחה של התאים29. מחקר זה השתמש בערך OD של תרבות ההשעיה של התא הומוגנית כדי לייצג את כמות צמיחת התאים. חיסונים עם 15 גר' אמא נוזלי לתוך 40 mL של נפח הכולל של התרבות נוזלי (v/v) היה מתאים לצמיחת התאים. יחס תת-תרבות היה שווה בין 1:1 ו 1:2 (האם ההשעיה נוזל: בינוני טרי).

הכדאיות התא בתוך תרבות תא התה ההשעיה נבדקה על ידי כתמים TTC. תרכובת TTC חסר צבע ניתן להמיר את הצבע האדום בצבע על ידי dehydrogenases ב המיטו, של תאי החיים, אך לא ניתן לשנות את הצבעים מתאים מתים (איור 5B). שיטה זו אימתה את מצב הגדילה של התאים בתרבות הנוזלית.

הקמת התרבות תא תה ההשעיה מספק קל בפלטפורמת מחקר מתורבת לחקר חילוף החומרים ומטבוליטים של חומרי הדברה שונים. בלתי תלוי בעונה ובמזג האוויר, הבולם התרבויות התא ניתן לטפל עם חומרי הדברה שונים, ריכוזים שונים של המרכיב הפעיל, ועל אורכי זמן שונים. מטבוליטים המיוצרים התרבויות תה ההשעיה היו דומים לאלה שחולצו מצמחים שלמים (איור משלים 1 ואיור משלים 2). מעניין, שבעה מטבוליטים של thiamethoxam ושני מטבוליטים של דימיואט זוהו בתרבות תא תה ההשעיה, אבל רק שני מטבוליטים של thiamethoxam ואחד עבור diמתואט מטופלים צמחים שלמים (משלים איור 1, איור משלים 2, ומשלים איור 3). זה יכול להיות בגלל החילוץ קל יותר מתאים ללא שעווה מקוטיקולה, פחות תרכובות מן התה מפריעה עם תוצאות הספקטרומטר מסה (אפקט המטריצה), או את הפרופיל הפשוט מטבוליזם של תאי תה לעומת הצמח כולו.

התוצאות הראו כי thiamethoxam היה מטבוליזם בקלות יותר על ידי תא התה לעומת שלושת הneonicotinoids האחרים (איור משלים 4). שני החומרים הזרחני, שניהם בעלי חילוף חומרים, מהירים יותר מneonicotinoids. תוצאות אלה מציגות את הגיוון של משעולים חילוף החומרים ואת רגולציה של מטבולית בתא התה, אשר צריך ללמוד עוד.

שימוש בצמחים שלמים לחקר חילוף החומרים קוטל החרקים לזהות מטבולינים קוטל חרקים מציג קשיים רבים, כולל חסמים לקליטת התחבורה למרחקים ארוכים של תרכובות הראשונית והתמוטטות בתוך הצמח30. תרבויות התא ההשעיה לא יכול רק לפתור את הבעיה, אלא גם להפחית את הפרעות מטריקס בניתוח לדוגמה לעומת תמצית עלים טריים24. מחקר זה הוכיח כי תרבויות תה ההשעיה הם פלטפורמה יעילה ללימוד חילוף החומרים של תרכובות xenobiotic יוטי במפעל התה. זה יכול להיות מוגש כמצב ללמוד את חילוף החומרים של xenobiotics בצמחים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית פיתוח מפתח & לאומי (2016YFD0200900) של סין, הקרן הלאומית המדעית הטבעית של סין (No. 31772076 ו-No. 31270728), סין פוסט דוקטורט הקרן (2018M630700), ואת הקרן הפתוחה של מפתח המעבדה לביולוגיה של צמח התה וניצול (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
  2. Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
  3. Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
  4. Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
  5. Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
  6. Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
  7. Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
  8. Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
  9. Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
  10. Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
  11. Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
  12. Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
  13. Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
  14. Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
  15. Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
  16. Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
  17. Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
  18. Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
  19. Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
  20. Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
  21. Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
  22. Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
  23. Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
  24. Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
  25. Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
  26. Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
  27. Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
  28. Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
  29. Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
  30. Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).

Tags

ביוכימיה סוגיה 148 מתלה להכנת תה מפעל תה שלם קוטל חרקים מטבוליזם צמחי מטבוליזם ספקטרומטר מסה
מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (<em>Camellia Sinensis </em>L.) עלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J.,… More

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter