Summary
L'exemple d'invasion cellulaire in vitro est utilisé pour mesurer le potentiel de la métastes du cancer en quantifiant le potentiel cellulaire d'invasion et de migration à l'aide d'inserts de culture cellulaire contenant de la matrice protéique. Les cellules sont mises au défi de migrer à travers la matrice protéique et une membrane poreuse, vers un chimioattractant, puis quantifiées par microscopie légère.
Abstract
L'analyse d'invasion in vitro utilise une matrice riche en protéines dans une chambre Boyden pour mesurer la capacité des cellules cultivées à passer à travers la matrice et une membrane poreuse dans un processus analogue aux premières étapes de la métasse des cellules cancéreuses. Les cellules testées peuvent être modifiées pour l'expression du gène ou traitées avec des inhibiteurs pour tester les changements dans le potentiel d'invasion. Cette expérience teste le phénotype agressif des cellules de tumeur mammaire de souris pour découvrir et caractériser les oncogènes potentiels qui favorisent l'invasion cellulaire. Cette technique, cependant, peut être polyvalente et adaptée à de nombreuses applications différentes. L'expérience elle-même peut être faite en une journée et les résultats sont obtenus par microscopie légère en moins d'une journée. Les résultats comprennent le nombre de cellules envahissantes pour la comparaison et l'analyse. L'analyse d'invasion in vitro est une méthode rapide, peu coûteuse et claire pour déterminer le comportement cellulaire dans une culture qui peut être utilisée comme une évaluation initiale avant d'être plus impliquée in vivo.
Introduction
L'analyse d'invasion in vitro peut être un outil utile pour mesurer la capacité d'une cellule à migrer à travers une membrane enrobée de protéines, analogue aux premières étapes de la métastes. Une caractéristique clé des cellules cancéreuses malignes est leur capacité à migrer à travers et envahir les tissus voisins. Le cancer qui s'est propagé ou métastasé pose plus de défis de traitement et a des taux plus bas de survie à long terme, alors que les tumeurs localisées sont plus faciles à traiter et ont des taux plus élevés de survie à long terme. Afin de métastaser, les cellules cancéreuses doivent quitter la tumeur primaire et migrer dans le système circulatoire ou lymphatique, un processus qui nécessite de passer par la matrice extracellulaire et la membrane du sous-sol1. Dans le processus appelé la transition mésenchymale épithéliale (EMT), les cellules de tumeur doivent casser des contacts de cellule-cellule, migrer directionnellement, et envahir le sang ou les vaisseaux lymphatiques voisins. Les premières étapes de cette cascade de métastes sont d'un grand intérêt puisque ces étapes sont ce qui peut rendre le cancer plus mortel. Les facteurs génétiques et épigénétiques impliqués dans les premières étapes de la métastes font l'objet d'une grande quantité de recherche, mais des outils expérimentaux précis et fiables sont nécessaires pour tester ces premières étapes in vivo et in vitro.
Les outils pour mesurer les changements dans la migration cellulaire tels que la cicatrisation des plaies (rayures) ou la croissance dans les environnements 3D tels que les essais d'agar doux peuvent répondre en partie à la nécessité de méthodes expérimentales de mesure des premières étapes de la métasse, mais un test pour mesurer l'invasion est plus difficile puisque le processus se produit dans le corps dans un microenvironnement complexe de tumeur. Aux fins du dépistage des médicaments ou des altérations génétiques pour déterminer les facteurs importants dans l'invasion et la métastase, un système qui peut être utilisé in vitro avec des cellules cultivées et imiter les défis rencontrés par les cellules métastatiques in vivo est l'essai d'invasion2, 3. Le cancer du sein est le type de cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes, de sorte que la compréhension des gènes responsables de l'invasion des cellules du cancer du sein et des métastes est d'une importance cruciale pour la santé publique. En outre, les cellules de souris sont un système modèle utile pour étudier le cancer du sein et sa progression.
L'exemple d'invasion in vitro est basé sur l'assemblée de la Chambre Boyden où deux chambres de médias de croissance sont séparées par une membrane poreuse3. Pour imiter le microenvironnement de tumeur, un gel protéine-riche est également inclus pour séparer des cellules dans une chambre d'un chimioattractant dans l'autre et agir comme barrière de membrane de sous-sol. Afin de migrer vers le chimioattractant, les cellules doivent d'abord passer à travers la barrière riche en protéines, puis passer à travers la membrane poreuse - un processus analogue à la façon dont les cellules métastatiques migrent à travers le stroma. Le gel riche en protéines peut être modifié en fonction des besoins de l'expérience, mais se compose généralement de collagène, ou extrait de membrane de sous-sol (par exemple, Matrigel)4. Il s'agit d'un mélange complexe de protéines, de protéoglycanes et de facteurs de croissance, mais se compose principalement de laminins et de collagène IV 4,5. Les cellules doivent alors passer à travers une membrane poreuse typiquement faite de polycarbonate, de polyester ou de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Les membranes peuvent être achetées commercialement avec ou sans gel protéique (généralement des collagènes), ou le gel peut être acheté séparément et ajouté. La taille des pores peut être ajustée en fonction de la taille de la cellule. Alors que les tailles de pores sont disponibles de 0,4 à 8,0 m, seuls les pores de 3,0 à 8,0 m sont assez grands pour la migration cellulaire. L'exemple d'invasion a été utilisé pour déterminer l'efficacité des inhibiteurs sur la capacité des cellules à migrer et à envahir. Bien qu'il manque le microenvironnement tumoral exact qui est présent in vivo, l'analyse d'invasion in vitro est bénéfique au dépistage de nombreuses conditions dans un court laps de temps tout en minimisant le besoin de modèles animaux. Le but de ces expériences est de comparer l'expression génique des oncogènes suspects et de déterminer les effets sur le comportement des cellules cancéreuses et l'agressivité de la maladie en utilisant l'analyse d'invasion in vitro et d'autres tests. Dans l'ensemble, l'essai d'invasion fournit des résultats cohérents, quantitatifs et rapides pour déterminer le potentiel métastatique tout en étant une méthode relativement peu coûteuse, simple et adaptable.
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Protocol
Toutes les expériences et méthodes ont été réalisées comme l'autorise le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Villanova (IACUC).
1. Expression génique dans les cellules de tumeur mammaire de souris cultivées
- Tout d'abord, préparer les lignées cellulaires à tester.
-
Utilisez une colonie reproductrice de souris BALB/cV. Ces souris portent la souche BALB/cV du virus de tumeur mammaire de souris, transmise aux chiots dans le lait6,7. Cinquante pour cent des femelles reproductrices développent des tumeurs mammaires à l'âge de 10 mois.
- Pour établir une ligne de cellules de tumeur, sacrifiez un barrage tumeur-portant utilisant un protocole IACUC-approuvé. Tremper la peau abdominale dans 70% EtOH et enlever la tumeur dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Les tumeurs sont sous-cutanées, alors prenez soin d'éviter de perforer le péritoine.
- Placez des fragments tumoraux de zones non nécrotiques dans un plat de Pétri avec une petite quantité de solution saline équilibrée stérile Hanks (HBSS) et hachez très finement avec une lame de rasoir stérile.
- Transférer les amas cellulaires dispersés dans un flacon de culture cellulaire T25 contenant 5 mL du moyen d'aigle modifié ou DMEM (4,5 g/L de glucose, de phenol rouge et de L-glutamine) complété par 50 % de sérum bovin fœtal ou FBS et 1 % de solution antibiotique/antimycotique. Cultivez des cellules dans des flacons de culture cellulaire traitée dans un incubateur avec 5 % de CO2 et 100 % d'humidité à 37 oC.
- Laver les cellules non adhérentes après 24-48 h et remplacer le DMEM par 50% FBS et 1% antibiotique / solution antimycotique. Remettre les cellules à l'incubateur.
- Remplacez les supports de culture liquide tous les 3 jours.
- Diviser ou passer les cellules quand ils sont 90% confluents. Enlever les supports de culture et laver les cellules adhérentes avec hbSS (sans calcium ni magnésium). Incuber les cellules avec une solution Trypsin-EDTA de 0,25 % pendant 1 à 5 min à 37 oC jusqu'à ce que les cellules soient arrondies et détachées. Diluer les cellules 1:10 dans les médias de culture fraîche et ajouter à un nouveau flacon. Un flacon de culture cellulaire T-25 nécessite 5-8 ml de milieu de culture, 5 mL de HBSS à laver, et 1 ml de trypsin-EDTA au passage. Remettre le flacon à l'incubateur.
- Réduire la concentration FBS à 40% après le premier passage, puis 30% après le deuxième passage, puis 20% après le troisième passage, et enfin 10% pour tous les passages suivants. Le processus d'établissement de la croissance dans le milieu Standard DMEM avec 10% FBS nécessite quatre passages et 2 - 8 mois.
-
Une fois que la lignée cellulaire (s) est établie, modifiez l'expression des oncogènes présumés par transfection de l'ARNm shRNA ou CRISPR pour les gènes non essentiels.
- Établir des lignées cellulaires stables résistantes aux antibiotiques avec des clones individuels qui sont vérifiés par la tache occidentale et/ou rt-qPCR pour des résultats cohérents, cependant, les transfections transitoires peuvent fonctionner aussi bien puisque l'analyse ne nécessite que 22 h. Les lignées cellulaires de contrôle avec des séquences cibles non spécifiques sont également nécessaires.
2. In Vitro Invasion Assay
- Cultivez les cellules mammaires adhérentes de tumeur de souris dans un flacon de T25 jusqu'à 70-90% confluent pour le jour 1 de l'expérience.
REMARQUE: D'autres lignées cellulaires ou conditions expérimentales peuvent nécessiter différents médias de culture cellulaire. Par exemple, si des cellules cancéreuses du sein sensibles aux hormones sont testées, un sérum filtré au charbon de bois peut être nécessaire pour éliminer les composés qui activent l'œstrogène ou d'autres récepteurs hormonaux. - Préparer les inserts de chambre Boyden en les réchauffant à la température ambiante (à partir de -20 oC de stockage) pendant environ 20 min dans une hotte de culture cellulaire. Évitez les cycles de gel et de dégel pour les inserts inutilisés. Utilisez trois inserts (répliques) pour générer des données statistiquement valides pour chaque lignée cellulaire pour chaque expérience.
- Ajouter le support DMEM de 37 oC sans sérum réchauffé au puits, puis l'insert. Pour les inserts conçus pour les plats de 24 puits, ajoutez 500 l de DMEM sans sérum au puits, puis 500 l de DMEM sans sérum à l'insert afin que la membrane poreuse et le gel soient hydratés des deux côtés.
REMARQUE: Pour les inserts plus grands conçus pour un plat de 6 puits, utilisez 2 ml de DMEM sans sérum des deux côtés.
- Ajouter le support DMEM de 37 oC sans sérum réchauffé au puits, puis l'insert. Pour les inserts conçus pour les plats de 24 puits, ajoutez 500 l de DMEM sans sérum au puits, puis 500 l de DMEM sans sérum à l'insert afin que la membrane poreuse et le gel soient hydratés des deux côtés.
- Placer le plat avec des inserts dans un incubateur de culture cellulaire de 37 oC avec 5 % de CO2 et 100 % d'humidité pendant au moins 2 h pour bien hydrater et acclimater.
- Préparer les cellules en enlevant le support de croissance et en rinçant les cellules avec 5 mL de HBSS.
- Retirez le HBSS et ajoutez 1 mL 0,25% de solution trypsine-EDTA pendant 1 à 5 min à 37 oC ou jusqu'à ce que les cellules apparaissent arrondies ou montrent des signes de détachement du flacon.
- Appuyez doucement sur le flacon pour détacher toutes les cellules. Resuspendre les cellules en 5 ml de DMEM à 10 % DE FBS et transférer dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 1000 x g pendant 5 min pour granuler doucement les cellules. Retirez le support et remplacez-le par un DMEM sans sérum de 5 ml pour resuspendre les cellules.
- Répétez la centrifugation et la suspension dans des supports sans sérum deux fois de plus pour un total de 3 lavages.
- Resuspendre soigneusement les cellules dans les 5 ml de DMEM sans sérum et s'assurer qu'il n'y a pas d'amas de cellules.
- Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre. Ne comptez que des cellules viables. Diluer la suspension cellulaire à 5 x 104 cellules/mL dans 5 ml de DMEM sans sérum.
REMARQUE: Cette concentration donne 2 500 cellules par insert dans un plat de 24 puits. Ce nombre de cellules est suffisant pour les cellules cancéreuses agressives avec des taux élevés de migration et d'invasion. Des lignées cellulaires moins agressives peuvent nécessiter plus de cellules, jusqu'à 10 000 cellules par insert pour les cellules d'invasion observables. Si l'invasion cellulaire réduite est prévue, envisager de maximiser les cellules envahissantes en augmentant le nombre de cellules. Si l'invasion cellulaire accrue est prévue, commencez avec moins de cellules. - Retirer le plat de culture cellulaire de l'incubateur et aspirer doucement le support de l'insert. Soulevez l'insert et aspirez le support du puits. En travaillant rapidement, ajouter le chimioattractant à la chambre basse. Pour un plat de 24 puits, ajouter 750 l de DMEM avec 5% de FBS.
- Placez l'insert dans le puits et ajoutez les cellules à l'insert. Pour un plat de 24 puits, utilisez une suspension cellulaire de 500 l., à l'utilisation de 500 ll. Pour un encart plat de 6 puits, utiliser 2,5 ml de chimioattract et 2 ml de cellules. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air n'est présente de part et d'autre de la membrane.
- Remettre le plat à l'incubateur de culture cellulaire pendant 22 h.
- Après 22 h, fixer et tacher les cellules. Préparer une solution de 1% de paraformaldéhyde en 1x phosphate tamponné saline (PBS) pour la fixation.
- Dans un plat propre de culture cellulaire de 24 puits, ajouter 1 ml de fixatif aux puits individuels afin qu'il y ait un puits pour chaque insert.
- Préparer la solution de coloration (fraîchement faite) de 0,1 % de violette cristalline (w/v) dans une solution de PBS avec 10 % d'éthanol (v/v). De même, ajouter 1 ml de solution de coloration à un puits propre dans un plat de culture de 24 puits pour chaque insert.
- Retirez chaque insert un à la fois avec des forceps et placez un coton-tige stérile à l'intérieur de l'insert et tamponnez le côté supérieur de la membrane pour enlever les cellules non migrées.
- Répéter l'opération avec un deuxième coton-tige. La membrane est assez forte, donc une pression douce pendant l'écouvillonnage ne compromet pas l'intégrité de la membrane.
- Retirez les supports restants de l'intérieur de l'insert et ajoutez 750 L de PBS pour laver les cellules détachées.
- Retirez le PBS et répétez le lavage. Placez l'insert dans un puits contenant du fixatif pour fixer les cellules migrées sur le dessous de la membrane. Répétez l'opération pour tous les inserts.
- Fixer les inserts pendant 15 min à température ambiante.
- Après fixation, retirez l'insert. Laver l'insert à nouveau avec 750 L PBS.
- Placez l'insert dans le puits avec la solution de coloration pour tacher toutes les cellules migrées et fixes. Taclez les cellules pendant 15 min à température ambiante.
REMARQUE: Pour les inserts plats de 6 puits, utilisez 2 ml de solution fixative, 2 ml de solution de coloration et 2 ml de lavage PBS.
- Utilisez un bécher avec de l'eau distillée pour desicher les inserts. Retirez les inserts et trempez-les dans l'eau distillée jusqu'à ce que l'eau qui s'écoule de l'insert soit claire.
- Retirer les gouttelettes d'eau excédentaires et placer les inserts sur un papier filtre sur le côté pour sécher à l'air (généralement pendant la nuit).
- Préparer la membrane pour l'imagerie en étiquetant une lame de microscope en verre propre pour chaque insert et placer une petite goutte d'huile d'immersion au microscope au centre de la diapositive.
- Détachez la membrane de l'insert à l'aide d'un scalpel pour couper le périmètre de la membrane à l'intérieur de l'insert en plastique.
- Retirez la membrane à l'aide de forceps et placez-la sur le dessus de la goutte d'huile sur la glissière pour la maintenir en place.
REMARQUE: Les membranes sont très minces et très légères, de sorte qu'elles peuvent facilement être perdues par le flux d'air doux.
3. Imagerie et analyse
- Puisque les membranes poreuses sont claires et les cellules de coloration avec la violette de cristal leur donnent le contraste, emploient un microscope léger composé pour voir les cellules. Utilisez une caméra et/ou un logiciel pour quantifier de nombreux échantillons, mais n'est pas nécessaire. Afficher les cellules à 5x, 10x, ou 20x grossissement. Pour la quantification, utilisez plusieurs images non superposées à 10x grossissement. Alternativement, comptez toutes les cellules migrées sur la membrane au grossissement 10x.
- Déterminer le nombre total de cellules ou de cellules envahissantes par zone pour tous les échantillons. Pour chaque expérience, effectuez chaque condition dans l'analyse avec trois inserts de répétition et répétez plusieurs fois pour des résultats statistiquement utiles.
- Lorsque vous comparez différentes lignées cellulaires avec des taux de croissance et de migration différents, faites une expérience parallèle pour comparer les cellules qui envahissent à travers une matrice protéique et comparer à un assemblage de chambre Boyden sans matrice de protéines (cellules migrées seulement). Calculer l'invasion pour cent pour chaque lignée cellulaire (Nombre de cellules envahies/nombre de cellules migrées x 100%).
REMARQUE: Cette approche peut aider à comparer le taux d'invasion aux taux de migration. Si la comparaison des différentes conditions appliquées à la même lignée cellulaire, le calcul de l'invasion seule est des calculs plus pertinents. Le bord externe de la membrane a parfois un nombre plus élevé de cellules que les zones centrales et est, par conséquent, moins précis. Si cela se produit, excluez ces cellules de la quantification et assurez-vous que toutes les cellules sont enlevées par un coton-tige dans une expérience répétée.
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Representative Results
Cette méthode d'invasion in vitro par une matrice de protéine a été employée pour évaluer les phénotypes agressifs et les comportementsde cellules oncogènes des cellules mammaires de tumeur de souris avec l'expression altérée de la protéine de doigt de zinc ZC3H8 8. En conjonction avec d'autres approches qui examinent également la migration et la croissance cellulaires dans les environnements 3D, il a été constaté que des niveaux plus élevés d'expression de Zc3h8 dans les lignées cellulaires tumorales, ou par l'expression par promoteur-négocié à partir d'un plasmide, a entraîné des taux rapides de cellules prolifération, migration rapide, croissance dans les environnements 3D, et invasion accrue dans l'exemple d'invasion in vitro8. Inversement, l'expression diminuée par des constructions de shRNA a eu comme conséquence la prolifération, la migration, et l'invasion moins agressives8. Ces résultats ont été confirmés in vivo où l'expression plus élevée de Zc3h8 a produitde plus grandes tumeurs qui sont apparues rapidement, alors que l'expression diminuée a produit moins de tumeurs qui étaient plus petites et moins fréquentes 8.
Pour étendre ce travail, plasmides d'expression qui peuvent sauver shRNA-mediated knockdown de l'expression Zc3h8 ont été poignardée transfectées dans les cellules mammaires de souris pour évaluer si la croissance et le comportement agressifs de cellules pourraient être rétablissements dans ces cellules. Tous les knockdown et le sauvetage des expressions ont été vérifiés par western blot ou RT-qPCR8. Un exemple d'invasion a été utilisé avec 5 000 cellules par chambre dans un plat de 24 puits et documenté avec des photographies telles que montrées dans la figure 1 et la figure 2. La figure 3 montre les résultats de l'analyse d'invasion qui démontrent comment l'invasion cellulaire a diminué lors du renversement de l'ARNh de l'expression Zc3h8, mais cette invasion est sauvée lorsque l'expression est sauvée. Ces données montrent que l'essai d'invasion peut fournir une méthode rapide pour tester les lignées cellulaires in vitro avant de se lancer dans des approches plus coûteuses et plus longues.
Figure 1 : Composants d'assay d'invasion. (A) Insert de chambre Boyden pour un plat de culture de tissu de 24 puits. (B) Un plat de culture tissulaire de 24 puits utilisé pour la fixation, la coloration et le lavage après 22 h d'incubation avec des cellules. Les nombres 1, 2 et 3 sont des répliques d'une seule lignée cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Graphique d'assay d'invasion avec l'échelle de temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats d'analyse d'invasion d'échantillon d'une cellule de tumeur mammaire de souris modifiée pour l'expression de Zc3h8, qui change le phénotype oncogène. (A, B) Les cellules isolées des tumeurs mammaires de souris ont été poignardées transfected avec le shRNA ciblant une séquence de commande de l'ARNm ou ciblant l'ARNm Zc3h8. (C) La lignée cellulaire postérieure a ensuite été sauvée en exprimant le Zc3h8 recombinant conçu pour ne pas être affecté par le shRNA. Les cellules sont tachées de violette cristalline et capturées à 10x grossissement à l'aide d'un microscope léger. Barre d'échelle de 500 m. (D) Quantification montrant que l'expression réduite de Zc3h8 a diminué le nombre de cellules envahissantes et le potentiel de métastasie. Le sauvetage de l'expression génique sauve des taux plus élevés d'invasion cellulaire. Les valeurs représentent le nombre total de cellules envahissantes à partir d'un encart d'évaluation d'invasion de 24 puits. Pour chaque réplique de l'expérience, le nombre moyen de cellules envahissantes a été calculé. Cela a été répété pour trois expériences. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'essai d'invasion in vitro est une méthode peu coûteuse, rapide, quantitative, et simple pour étudier les facteurs favorisant l'invasion de cellules cancéreuses. Le cancer du sein est le cancer le plus souvent diagnostiqué chez les femmes. Des trois principaux sous-types de cancer du sein, triple négatif, (ou ER-, PR-, HER2/neu-), est le plus agressif, le plus susceptible de métastaser, et le plus mortel9. Par conséquent, la compréhension des gènes et de l'expression qui entraînent une métastasie peut aider à trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et des marqueurs génétiques pour la maladie. Tandis que beaucoup des gènes importants pour l'invasion et la métastes de cellules cancéreuses ont été identifiés et caractérisés, les niveaux d'expression et l'activité des conducteurs de métastasie contre les suppresseurs de métastasie peuvent être un aspect critique de la progression de la maladie9, 10.
Au-delà de l'expression des gènes, l'analyse de l'invasion in vitro a également été utilisée pour étudier le rôle des microARN et d'autres organismes de réglementation dans la promotion ou la prévention de l'invasion des cellules cancéreuses11,12. La méthode de configuration d'invasion in vitro peut être employée pour l'étude des inhibiteurs, des environnements de tumeur de type multicellulaire, des cellules CRISPR-éditées, ou des changements à court terme aux environnements cellulaires de croissance. La polyvalence et l'adaptabilité rendent ce résultat très avantageux.
L'analyse d'invasion peut être utilisée dans une première étape dans l'analyse des gènes et des facteurs qui contribuent à ou empêchent la progression tumorale. Par exemple, Yan et coll. (2010) ont utilisé les essais d'invasion in vitro pour définir le rôle de GATA-3 dans la suppression de l'EMT par la lignée cellulaire du cancer du sein très agressive MDA-MB 23113. Ils ont ensuite été en mesure de démontrer que cette suppression était corrélée avec une diminution de la capacité de former des métastases dans un avertissement in vivo13. Les stratégies thérapeutiques potentielles peuvent être au commencement caractérisées par la capacité des inhibiteurs de voie de limiter l'invasion par Matrigel, également corréléavec avec l'effet de ces inhibiteurs sur la formation de tumeur dans les modèles animaux. L'analyse d'invasion in vitro peut être utilisée pour une analyse plus approfondie des oncogènes connus et potentiels et des partenaires en interaction. Par exemple, la dissection moléculaire des motifs fonctionnels connus d'une oncoprotéine ou l'analyse rapide des mutations peut être faite avec l'analyse in vitro d'invasion comme écran initial ou évaluation de signification. Cela peut fournir un aperçu précieux dans les domaines critiques ainsi qu'une compréhension fonctionnelle des phénotypes cellulaires au niveau moléculaire.
Bien que l'exemple d'invasion de la Chambre Boyden présente de nombreux avantages, il y a des limites. Par exemple, l'analyse d'invasion ne porte que sur l'intravasation, l'une des premières étapes de la métastes, mais pas les étapes ultérieures lorsque les cellules cancéreuses colonisent des endroits secondaires. Par conséquent, seule une vue partielle du potentiel de métastasie peut être conclue. La longueur de 22 h de l'épreuve, bien que flexible, ne peut exclure une certaine division cellulaire qui pourrait fausser des changements subtils dans la mesure de l'invasion des populations cellulaires asynchrones. Des inhibiteurs tels que la mitomycine C peuvent être utilisés pour prévenir la division cellulaire dans le cas de cellules de plongée rapide. Enfin, l'utilisation de la solution FBS à 5 % pour les chimiotaxis se diffuse lentement au fil du temps et s'équilibre entre les chambres supérieures et inférieures. La densité du gel protéique ralentit cette diffusion et présente aux cellules la possibilité de migrer latéralement à travers le gel et la membrane (haplotaxis) ou à travers la matrice protéique et à travers les pores vers les concentrations plus élevées de FBS (chemotaxis). D'autres agents chimiotaxis peuvent être substitués ou des indemnités de temps plus courtes pour l'invasion peuvent être utilisées pour mesurer seulement les cellules qui ont envahi avant l'équilibre. C'est la flexibilité, et non la rigidité, de l'analyse d'invasion in vitro qui permet la personnalisation qui rend cet analyse si utile. Les adaptations futures de cet avertissement comprennent un dépistage à grande échelle des composés, des changements d'expression génique et l'évaluation de l'efficacité des médicaments spécifiques à l'allele. En outre, un système de chambre double avec des milieux circulants pourrait défier des cellules pour envahir par une matrice de protéine, traverser un environnement liquide, et rétablir sur une deuxième matrice de protéine à un endroit secondaire. Enfin, une membrane plus difficile peut être utilisée avec le système d'analyse d'invasion in vitro comme une monocouche de cellules non invasives qui serait plus difficile pour les cellules cancéreuses à traverser.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention R15CA169978 des National Institutes of Health. Des fonds supplémentaires ont été accordés à l'Université Villanova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
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