Summary
SEC-BioSAXS-målinger af biologiske makromolekyler er en standardmetode til bestemmelse af opløsningsstrukturen for makromolekyler og deres komplekser. Her analyserer vi SEC-BioSAXS-data fra to typer af almindeligt forekommende SEC-spor – kromatogrammer med fuldt løste og delvist løste toppe. Vi demonstrerer analysen og deconvolution ved hjælp af scatter og BioXTAS RAW.
Abstract
BioSAXS er en populær teknik, der anvendes i molekylær og strukturel biologi til at bestemme opløsningen struktur, partikelstørrelse og form, overflade-til-volumen forhold og konformationelle ændringer af makromolekyler og makromolekylære komplekser. Et SAXS-datasæt af høj kvalitet til strukturel modellering skal være fra monodisperse, homogene prøver, og dette opnås ofte kun ved en kombination af inline kromatografi og øjeblikkelig SAXS-måling. Oftest anvendes størrelsesudelukkelseskromatografi til at adskille prøver og udelukke forurenende stoffer og aggregering fra den interessepartikel, der gør det muligt at foretage SAXS-målinger fra en velkonfekt kromatografisk top af en enkelt proteinart. Stadig, i nogle tilfælde, selv inline rensning er ikke en garanti for monodisperse prøver, enten fordi flere komponenter er for tæt på hinanden i størrelse eller ændringer i form induceret gennem bindende ændre opfattes elution tid. I disse tilfælde kan det være muligt at dekonstruere SAXS-data for en blanding for at opnå de idealiserede SAXS-kurver for de enkelte komponenter. Her viser vi, hvordan dette opnås, og den praktiske analyse af SEC-SAXS-data udføres på ideelle og vanskelige prøver. Konkret viser vi SEC-SAXS analyse af vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.
Introduction
Biologiske makromolekyler er for små til at blive set selv med de bedste lysmikroskoper. Nuværende metoder til at bestemme deres strukturer generelt indebærer krystallisering af protein eller målinger på stort antal identiske molekyler på samme tid. Mens krystallografi giver oplysninger om det atomare niveau, det repræsenterer en kunstig prøve miljø, da de fleste makromolekyler ikke præsenteres i en krystallinsk form i cellen. I løbet af de sidste par år kryo-elektron mikroskopi leveret lignende høj opløsning strukturer af store makromolekyler / makromolekylære komplekser, men selv om prøverne er tættere på fysiologiske tilstand, de er stadig frosset, og dermed immobile og statisk. Bio-lille vinkel X-ray spredning (BioSAXS) giver en strukturel måling af makromolekyle, under forhold, der er relevante for biologi. Denne tilstand kan visualiseres som en 3D-figur med lav opløsning, der bestemmes på nanometerskalaen, og indfanger hele makromolekylets kropslige rum i opløsningen. BioSAXS-eksperimenter vurderer effektivt oligomeric state, domæne og komplekse arrangementer samt fleksibilitet mellemdomæner 1,2,3. Metoden er nøjagtig, for det meste ikke-destruktiv og kræver normalt kun et minimum af prøveforberedelse og tid. Men for at få den bedste fortolkning af dataene skal prøverne være monodisperse. Det er en udfordring. biologiske molekyler er ofte modtagelige for forureninger, dårlig rensning og sammenlægning, for eksempel fra fryse optøning4. Udviklingen af inline kromatografi efterfulgt af øjeblikkelig SAXS-måling hjælper med at afbøde disse virkninger. Størrelsesudelukkelseskromatografi adskiller prøverne efter størrelse og udelukker således de fleste forurenende stoffer ogaggregering 5,6,7,8,9,10. I nogle tilfælde er selv SEC-SAXS imidlertid ikke tilstrækkelig til at producere en monodisperseprøve, fordi blandingen kan bestå af komponenter, der er for tæt på, eller deres fysiske egenskaber eller deres hurtige dynamik fører til overlappende toppe i SEC UV-spor. I disse tilfælde kan et softwarebaseret deconvolutiontrin for de opnåede SAXS-data føre til en idealiseret SAXS-kurve for den enkeltekomponent5,11,12. Som et eksempel, i protokol afsnit 2, viser vi standard SEC-SAXS analyse af vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant (E9 exominus) i kompleks med DNA. Vaccinia repræsenterer modelorganismen i Poxviridae, en familie, der indeholder flere patogener, for eksempel den menneskelige kopper virus. Polymerase blev vist sig at binde tæt til DNA i biokemiske tilgange, med strukturen af komplekset for nylig løst ved røntgenkrystallografi13.
De fleste synchrotron-faciliteter giver en automatiseret databehandlingspipeline, der udfører datanalisering og integration, der producerer et sæt ikke-pakkede rammer. Men den fremgangsmåde, der er beskrevet i dette manuskript kunne også bruges med en lab kilde forudsat SEC-SAXS udføres. Desuden kan der være yderligere automatisering til rådighed, som vil afvise strålingsskadede rammer og udføre buffern subtraktion14. Vi vil vise, hvordan du udfører primær dataanalyse på forbearbejdede data og får mest muligt ud af de tilgængelige data i afsnit 2.
I afsnit 3 viser vi, hvordan man deconvoluterer SEC-SAXS-data og analyserer kurverne effektivt. Mens der er flere deconvolution metoder såsom Gaussian peak deconvolution, gennemført i USA-SOMO15 og Guinier optimeret maksimal sandsynlighed metode, der gennemføres i DELA software16, disse generelt kræver en model for peak form12. Den begrænsede størrelse af de enkelte toppe, vi undersøger, gør det muligt at anvende udvikling af faktoranalyser (EFA) som en forbedret form for entalværdi nedbrydning (SVD) til at deconvolute overlappende toppe uden at forlade sig på topformen eller spredningsprofilen5,11. En SAXS-specifik implementering findes i BioXTAS RAW17. EFA blev første gang anvendt på kromatografidata, da 2D-diodearraydata gjorde det muligt at danne matricer ved absorbans mod retentionstid og bølgelængdedata18. Hvor miljømæssige fokusområder excellerer er, at den fokuserer på entalsværdiers udvikling, hvordan de ændrer sig med fremkomsten af nye komponenter, med det forbehold, at der er en iboenderækkefølge i erhvervelsen 10. Heldigvis SEC-SAXS data giver alle de nødvendige bestilte erhvervelse data i organiseret 2D-data arrays, udlån sig pænt til EFA teknik.
I afsnit 4 vil vi demonstrere det grundlæggende i model-uafhængig SAXS analyse fra buffer-baggrund trukket SAXS kurve. Model-uafhængig analyse bestemmer partikelens radius-of-gyration (Rg), volumen-of-korrelation (Vc), Porod Volume (Vp), og Porod-Debye Exponent (PE). Analysen giver en semi-kvantitativ vurdering af partikelens termodynamiske tilstand med hensyn til kompakthed eller fleksibilitet via det dimensionsløse Kratky-plot2,4,19.
Endelig måles SAXS-data i gensidige rumenheder, og vi vil vise, hvordan SAXS-dataene omdannes til real-space for at genoprette pardistancen, P(r), distributionsfunktionen. P(r)-fordelingen er sættet af alle afstande, der findes i partiklen, og omfatter partiklens maksimale dimension, dmax. Da der er en termodynamisk måling, repræsenterer P(r)-fordelingen det fysiske rum, der er optaget af partiklernes kropslige rum. Korrekt analyse af et SAXS-datasæt kan give indsigt i løsningstilstand, der supplerer oplysninger med høj opløsning fra krystallografi og kryo-EM.
Protocol
1. Proteinudtryk, rensning og SEC-SAXS-måling er baseret på den offentliggjorte protokol13
- Følg den inline SEC-SAXS dataindsamling protokol (Brennich et al.6)kort.
- Ligevægt af SEC-kolonnen med mindst 2 kolonnevolumener AF SEC-løbebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl).
- Der klargøres 50 μL prøve af E9 exominus ved 8\u201210 mg/ml med 20 % kindtandsoverskud af en delvis dsDNA (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC og GGCTAAACCCTGTTATCTT). E9 exominus binder med et KD på 12 ± 6 nM (se supplerende data).
- 50 μL af denne blanding indsprøjtes på en SEC-kolonne (S200 Increase) inline med flowcellen til SAXS-målinger ved 0,3 ml/min.
- Saml 1000 billeder ved 1 s eksponering hver.
BEMÆRK: På BioSAXS beamline BM29, på european synchrotron facility (ESRF), behandles de enkelte rammer automatisk og uafhængigt inden for EDNA-rammen14. Efter dataindsamlingen skal du åbne ISPyB-databasen20 og under fanen Dataindsamling trykke på knappen Gå for at få adgang til datasættet og resultaterne af den automatiske analyse21.
- Download dataene.
2. Primær dataanalyse
- Åbn det Java-baserede program Scatter IV (se Tabel over materialer) og udføre en baggrunds subtraktion for data om størrelsesudelukkekromatografi (SEC).
- Åbn fanen SEK. Træk og slip de reducerede datafiler (*.dat) ind i vinduet "Slip data nedenfor". Angiv outputmappen "Out Dir ::" ved at klikke på knappen Output Dir med blå etiket.
BEMÆRK: Hvis dine data blev indsamlet i nm-1, skal en konverteringsboks kontrolleres (nederst til venstre i panelet), når du smider filer i vinduet eller undertraktionsfanen. - Rediger de eksperimentelle detaljer, brug knappen Rediger detaljer og udfyld så mange felter som muligt, disse omfatter sektioner, hvor kilde / beamline blev brugt til at indsamle data, indsamlingsparametre og eksempeldetaljer. Disse vil blive gemt sammen med dataene og gøre det lettere at udfylde afsnittet "Dataindsamlingsparametre" i fremtidige publikationer.
- Angiv eksempelnavnet i feltet Gem som. Klik på TRACE.
BEMÆRK: Dette har to effekter. For det første vil det skabe en *.sec fil til data. Dette er en enkelt tekstfil, der vil samle alle de eksperimentelle observationer fra de separate * .dat filer. Desuden indeholder *.sec-filen det gennemsnitlige sæt rammer, der er bufferbaggrunden, alle de rammer, der bruges i gennemsnittet, samt de buffer-baggrundsdetrukket rammer på tværs af hele SEC-SAXS-eksperimentet. For det andet oprettes der et signalplot, som afbilder rammetallet i forhold til Integral-forholdet til baggrunden. Dette viser de markerede rammer (grå), der blev gennemsnitt for bufferns subtraktion. Punkterne for den gennemsnitlige buffer bestemmes ud fra hele dataområdet. Det er dog tilrådeligt manuelt at vælge bufferrammerne for gennemsnit, da en dårligt defineret baggrund kan forekomme på grund af dårligt ligevægtede eller snavsede kolonner eller kapillær tilsmudsning22. - Vælg bufferrammer manuelt. Klik på Ryd buffere, og vælg derefter et bufferområde igen med et venstre klik-træk på sporingskurven. Ideelt set bør dette være en flad region før det ugyldige volumen af SEC kolonne på ca 100 billeder. Klik på SET BUFFER, og opdater derefter for at genberegne *.sec-filen, som kan tage et par minutter.
- Identificer et interesseområde. På signalplottet skal du vælge området for den mest af største interesse med et venstre klik-træk.
BEMÆRK: Dette udfylder tre parceller i højre panel. De to øverste parceller er forbundet med trådkors bevæger sig mellem dem, et andet signal plot (øverst til højre) viser kun ROI valgt, med intensiteten af hver ramme i blå og den tilsvarende Rg af hver ramme i rødt og en tilsvarende varme kort nedenfor, viser resterne for hver ramme farvet i henhold til Durbin-Watson auto-korrelation analyse. Regioner med høj lighed er farvet cyan (Durbin-Watson, d = 2), mens forskellige rammer vil følge mørkere blues til pinks og endelig til røde afhængigt af sværhedsgraden af forskellen (d > 2). Det nederste plot er en subtraheret I versus q kurve for den centrale valgte ramme (også angivet med en lodret linje). Piletasterne kan bruges til at navigere gennem de fratrerede rammer. I versus q plottet vil demonstrere kvaliteten af de subtrerede rammer fra SEC eksperimentet. - Vælg rammer, der skal flettes. Klik på trådkorset i varmekortplottet for at vælge det undersæt af rammer, der skal bruges til sammenlægning. Sigtekornet vil identificere et trekantet område af overvejende cyan, der falder til nederste højre side af trådkorset. Brug et museklik til at indstille disse rammer som markerede og fremhæve rammerne i det tilsvarende område af signalplottet ovenfor. Disse rammer bør ideelt set fremhæve en region med en stabil Rg.
BEMÆRK: Zoom ind på varmekortet med et venstreklik træk og zoom ud med et venstreklik stryg til højre. - Klik på FLFLer , når de er tilfredse med de markerede rammer. Dette vil flette de fratrerede rammer og præsentere dem under fanen ANALYSE.
- Åbn fanen SEK. Træk og slip de reducerede datafiler (*.dat) ind i vinduet "Slip data nedenfor". Angiv outputmappen "Out Dir ::" ved at klikke på knappen Output Dir med blå etiket.
3. Deconvolution af data
- Åbn deconvolution-programmet (f.eks.
- I deconvolution-programmet skal du indlæse datasættet under fanen Filer i Kontrolpanel, bruge foldether-symbolet til at finde dataene eller kopiere og indsætte placeringen i adresselinjen.
BEMÆRK: Sørg for, at mappen kun indeholder de rå *.dat filer og ingen behandlede eller gennemsnitlige datafiler. - Fremhæv alle de * .dat filer, ramte Plot Series knappen, et plot af integreret intensitet versus ramme nummer vil blive trukket i "Series Plot".
- Vælg fanen Serie i Kontrolpanel, og klik derefter for at fremhæve kurven. Åbn pop op-vinduet LC Analysis ved hjælp af knappen i bunden af kontrolpanelet. Dette vindue giver adgang til flere muligheder, såsom at vælge forskellige molekyletyper (protein eller RNA). Det giver også brugeren mulighed for at vælge bufferområdet for plottet. I første omgang skal du klikke på Auto.
BEMÆRK: Hvis dette mislykkes, muligvis på grund af en ustabil oprindelig plan, skal du "Tilføj område" for at optimere bufferområdet. Dette udfylder boksen Buffer med en mindre boks, hvor man manuelt kan tilføje de rammenumre, der skal bruges til bufferen. Du kan også klikke på "Vælg" for at give mulighed for at vælge et område på plottet. Find området, venstre-klik én gang for startpositionen, flytte markøren til næste position og venstre-klik igen. Det kan være nødvendigt at tilføje mere end én bufferplacering. Klik på Angiv buffer, og kurverne trækkes fra, og Rg beregnes over SEC-toppen. Hvis der vises en pop op-boks, skal du klikke på OK. - Hvis du vil starte EFA (Evolving Factor Analysis), skal du højreklikke på den fremhævede fil nederst i Kontrolpanel og derefter vælge Efa fra menuen.
- Kontroller, at der åbnes et pop op-vindue, som viser svd-datasættets enhedsdygning (SVD). Markér afkrydsningsfeltet Brug rammer i kontrolelementerne, så hele det topområde, der skal deconvolutere, er dækket af intensitetsplottet. Plottet "Entalværdier" øverst til højre viser intensiteten af entalsværdierne (separate toppe/arter) over basislinjen.
BEMÆRK: Antallet af punkter, der er anført over basislinjen, repræsenterer antallet af tilstedeværende spredningsarter. Med det forbehold, at det er den relative størrelse af ental værdi til det flade område / baseline, der betyder noget. - Brug det nederste autokorrelationsplot for at hjælpe med at validere antallet af enkelte værdier. Dette viser højre og venstre enkelt korrelation vektorer. Klik på Næste.
BEMÆRK: Disse repræsenterer hovedsagelig sprednings- eller koncentrationsprofiler for vektoren i opløsningen. Hvor den absolutte størrelse repræsenterer vektorens betydning. En væsentlig komponent vil have en autokorrelation nær 1 (en tommelfingerregel cutoff er >0.6\u20120.7). RAW beregner dette og vises i feltet #Significant nederst til venstre, selvom du kan ændre dette, hvis det er nødvendigt. Hvis der er flere enkeltværdier (f.eks. 4+), kan det være nødvendigt kun at se på 2 eller 3 af komponenterne og ændre rækkevidden af de anvendte data. Jo lavere antal komponenter, jo lettere er det, at efa-analysen bliver, men på bekostning af at bruge færre data. I komplekse situationer, hvor venstre og højre ental vektorer, som bør være ens, ikke passer reducere den betydelige SV antal og mindske antallet af rammer, der anvendes, indtil venstre og højre ental vektorer er ens. - Kontroller, at miljømæssige fokusområder beregnes ved at generere observationsområder i frem- og tilbageadgående retninger for hver vektor. Disse plots viser, hvornår komponenter starter (fremadplott) og afslutter (baglæns plot) løsningsprofilen for de valgte SEC-SAXS-data. RAW forsøger at identificere disse intervaller. ændre disse ved hjælp af pilene ved siden af tællerne, så hver cirkel er i starten af et vendepunkt stiger fra eller falder til baseline. Klik på Næste.
BEMÆRK: Den sidste fase af EFA forvandler SVD-vektorerne tilbage til spredningskurver. Til venstre for vinduet afbildes de tidligere definerede områder øverst. Disse områder er de begrænsninger, der skal defineres, hvor entalsvektorerne skal roteres tilbage i spredningskurver. Højre panel viser disse tilsvarende spredning kurve profiler, for hver adskilt top. Et observationsområde for koncentrationen af hver top, der bør være repræsentativ for elueringsprofiler og et plot for den gennemsnitlige fejlvægtede chi2. Chi2-plottet måler deconvolution-datasættet til det oprindelige datasæt. Ideelt set vil dette være fladt, men pigge kan ofte ses. - Prøv at reducere eller eliminere pigge ved at ændre kontrolelementerne i komponentområdet, først identificere, hvilken ramme der svarer til spidsen (fra chi 2-plot), og derefter i områdekontrolelementerne, hvilken komponent der indeholder denne ramme (den kunne være mere end én), ved hjælp af pilene, skal du flytte op eller ned i det tilsvarende område.
BEMÆRK: Dette bør give et respons, der øger eller mindsker stigningen. Hvis spike rammen var til stede i mere end én komponent så en lille trial and error mellem hver komponent kan være nødvendigt. - Når der er opnået et minimum chi2, skal du udføre en valideringskontrol ved atklikke tilbage , det forrige vindue ser ud til at tillade kontrol, hvis de forekomne ændringer har ændret de oprindelige miljømæssige fokusområder drastisk. Hvis de stadig ser gyldige ud, skal du klikke på Næste. Klik på Gem EFA-data for at gemme plots, og klik derefter på Udført. for at lukke miljømæssige fokuseringsvindue.
BEMÆRK: En anden validering er at klikke fra afkrydsningsfeltet ud for hvert komponentområde efter tur. Disse giver en positiv koncentrationsbegrænsning for hver komponent, og hvis du slukker, kontrolleres det, om disse påvirker datasættet væsentligt. Hvis der ikke ses nogen ændring i koncentrationsplottet, er dataene gyldige.
- Kontroller, at der åbnes et pop op-vindue, som viser svd-datasættets enhedsdygning (SVD). Markér afkrydsningsfeltet Brug rammer i kontrolelementerne, så hele det topområde, der skal deconvolutere, er dækket af intensitetsplottet. Plottet "Entalværdier" øverst til højre viser intensiteten af entalsværdierne (separate toppe/arter) over basislinjen.
- Tilbage i RAW-vinduet skal du klikke på fanen Profiler i Kontrolpanel for at få vist kurverne og under fanen Manipulation i Kontrolpanel, manipulere kurverne yderligere eller gemme kurverne som *.dat-filer ved at højreklikke på filen og vælge gem markerede filer i menuen pop op. Gem filen. Brug Scatter IV til yderligere analyse.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger og instruktioner om decentralisering og EFA BioXTAS RAW findes på https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/
4. Bestem Egenskaber for SAXS
BEMÆRK: Der findes en dybdegående vejledning til SAXS-bestemmelse på Bioisis.net. Her viser vi en grundlæggende trin for trin tilgang, fremhæver de mest nyttige knapper i Scatter.
- Under fanen Punktanalyse skal du trykke på G-knappen for det manuelle analyseværktøj til Guinier til højre for hver eksempelfil. Plottet, der åbner viser ln[I (q)] versus q2 i den øverste boks og de tilsvarende rester i den nederste boks. Tilføj eller fjern punkter, således at resterne ikke har en "smil" eller "rynke panden" funktion. De valgte data i Guinier-pasformen må ikke overstige den maksimale q x Rg-grænse på 1,3.
- Tryk på knappen Normaliseret Kratky. plottet, der popper op giver en semi-kvantitativ vurdering af makromolekyle strukturelle tilstand, normaliseret for masse og koncentration.
BEMÆRK: Sigtekornet betegner Guinier-Kratky-punktet ved (√3, 1.1)19. Et kompakt, sfærisk protein vil vise en enkelt top med den maksimale værdi på Guinier-Kratky punkt. En uløseligt uorden eller cylindrisk biopolymer ville have et maksimum større end trådkorset og ville ikke falde. Et protein, der havde både foldede domæner og lange aflange ustrukturerede regioner kan præsentere med en øget maksimum gennem sigtekornet, men ville også vise en indlysende faldende tendens ved højere q x Rg. - Klik på Vc-knappen (Volume-of-korrelation), som bringer op to parceller, den samlede spredte intensitet og et integreret område af den samlede spredte intensitet som en funktion af q. Observationsområdet bruges som en hurtig reference til at validere spredningskurvens kvalitet.
BEMÆRK: Den samlede spredte intensitet er følsom over for I(0), og hvis dette ikke er blevet målt korrekt, vil plottet ikke vise en kontinuerlig linje. Det integrerede område plot, ideelt set, bør vise en sigmoidal linje med en udvidet plateau for hver SAXS kurve. Hvis der er bufferuoverensstemmelse/subtraktion, aggregering eller interpartikelinterferens i stikprøven, vil der blive observeret en skarp hældning ved højere q-værdier. - Tryk på knappen Fleksibilitet for at starte fleksibilitetsanalysen. Dette vil åbne et vindue med fire paneler og en skyder i bunden. Hvert åbnet panel viser et plot udnytte en magt-lov forhold, der eksisterer mellem kompakte og aflange / fleksible biopolymers23. Hvis du vil bruge, skal du flytte skyderen nederst i boksen fra højre mod venstre med venstre museknap trykket. Hold bevæger sig langsomt til venstre, indtil et plateau i en af de parceller er nået.
BEMÆRK: Hvis plateauet ses i Porod-Debye plot, så prøven er kompakt i naturen, som bør være i overensstemmelse med en enkelt top på Guinier-Kratky punkt i en normaliseret Kratky plot. Hvis plateauet nås først i Kratky-Debye plot så prøven er mest sandsynligt aflange eller fleksible. Hvis SIBYLS plot er først til plateau, så prøven sandsynligvis indeholder områder af både kompakthed og fleksibilitet, en partikel med blandede tilstande. Teorien om dette fleksibilitetsforhold til Porod-Debye-loven behandles udsøgt i Rambo, et al.23 - Klik på Lydstyrke. Volumenbestemmelse bør udføres umiddelbart efter fleksibilitetsanalysen ovenfra. Når åbnet efter fleksibilitetsanalysen, genereres der en pop up med yderligere tre grafer. I nederste, venstre hjørne Porod-Debye plot husker, hvor man forlod skyderen fra fleksibilitet plot, der viser plateaued område.
- For at beregne mængden af partiklen skal du flytte start- og slutpunkterne ved hjælp af pileknapperne eller skrive i felterne, så den blå linje på observationsområdet passer til det plateauområde. For et objektivt resultat, bør resterne i øverste højre Porod-Debye eksponent magt-lov passer, bør ikke vise noget mønster.
- Tryk på fanen P(r). Fordelingen i realtid er i venstre panel og spredningskurven for prøven i højre panel. Målet er at skabe en real-space repræsentation af prøven fra det gensidige rum SAXS kurve. Ideelt set vil fordelingen kurven være glat uden bølger til stede og bør bare forsigtigt kysse x-akse.
BEMÆRK: Instrumentets målte q-interval kan muligvis ikke anvendes helt på grund af dårlig buffermatchning, aggregering, strålingsskade, suboptimale eksponeringstider og lave partikelkoncentrationer. P(r)-bestemmelsestrinnet vil grundlæggende bestemme det anvendelige qmin- og qmax-interval for SAXS-datasættet, og det bør være dette dataområde, der anvendes til efterfølgende modellering eller tilpasning.- Højreklik på eksempelnavnet, og klik derefter på Find DMAX for at åbne et nyt vindue. Grænser for dmax er forudindstillet med den foreslåede qmax (maksimale datapunkter), lavere og øvre dmax grænser og en lavere og øvre alfa score. Tre modeller kan vælges (L1-norm, Legendre og Moore) og brugen af baggrund inkluderet. Lad disse forblive uændrede i første omgang.
- Tryk på knappen Start. En sammensat fordeling oprettes i venstre panel med det foreslåede dmax- og alfaniveau skrevet nedenunder. Hvis dette ser acceptabelt, skal du lukke vinduet og vende tilbage til fanen P(r). Det gensidige rumplot vil være beskåret, så det svarer til det foreslåede antalmaks.
- Vælg den model Moore, skal du klikke på Baggrund og derefter indstille alfa niveau og dmax til de foreslåede værdier fra pop-up-boksen. Tryk på knappen Fordyg. En cross-validering plot vil poppe op viser, hvis nogen punkter skulle afvises, markeret med rødt. Hvis der kun er et par punkter afvist, og fordelingen ser godt ud, så modellen er god.
BEMÆRK: Det tværvalideringsplot fremhæver områder af dataene, som ikke er i overensstemmelse med den bestemte P(r)-fordeling. Hvis den afviste region hovedsagelig er i lav-q-regionen, det vil sige regionen nær y-aksen, tyder dette sandsynligvis på en dmax, der er for kort, tilstedeværelse af sammenlægning eller højere orden oligomerer. Den fremhæver en uoverensstemmelse mellem oplysninger om højere og lavere opløsning. Her bør dmax og qmin (stigende startværdi) justeres ved hjælp af en manuel, trial-and-error tilgang. Hvis det afviste område hovedsagelig er i højdr.-regionen, kan dette ligeledes indikere et problem med baggrundens subtraktion, eller at signalet er for svagt til at kunne forklares på en meningsfuld måde ved den bestemte P(r)-fordeling. I dette tilfælde skal qmax afkortes (faldende ende), indtil der ikke afvises yderligere data. Ideelt set bør afviste punkter fordeles tilfældigt og udgør mindre end 5% af de brugbare data. En korrekt defineret qmin,qmax og "dmax"vil producere en jævn fordeling, hvor dmax kysser x-aksen. Men ikke øge denne værdi så meget, at det helt fjerner Guinier regionen. Dette punkt kan nemt findes ved at markere feltet q x l(q) (til venstre for panelet over tabellen). Spredningskurven erstattes af plottet "Total Scattered Intensity", på denne kurve er alle punkter, før den maksimale bøjning er en del af Guinier-regionen. Efter fjernelse punkter forsøge igen at øge / mindske "dmax"og derefter forfine en gang mere. Hvis problemerne fortsætter, især når mange punkter afvises fra starten af valideringskurven, tyder dette stærkt på, at dataene ikke er ideelle til strukturel modellering.
- Hvis du vil udskrive en rapport, skal du gå tilbage til fanen Analyse, venstreklik for at fremhæve eksemplet og derefter højreklikke på eksempelnavnet og flytte til Opret rapport fra et enkelt datasæt i menuen. Der åbnes en tekstboks, der gør det muligt at tilføje kommentarer. Der oprettes et PDF-dokument, der viser alle de genererede tal og værdier.
Representative Results
Fordelen ved at bruge deconvolution over klassisk rammeudvælgelse 13 er at fjerne indflydelsen af arter på hinanden, der producerer en monodisperse spredning signal. Dette følges også ofte med et bedre signal til støjforhold. Når E9 exominus er bundet til DNA og køres ved hjælp af SEC-SAXS, observeres to toppe (Figur 1). Den første, store top (ca. rammer 420\u2012475)er E9 exo minus-DNA-komplekset den anden (ca. rammer 475\u2012540), den ubundne tilstand (se Supplerende data: Figur 2). Mens den klassiske tilgang med at vælge rammer giver en stabil Rg af komplekset i den første top (se supplerende data: Figur 3), er den anden top klart fusioneret, og Rg på tværs af plottet viser, at den anden top af interesse ikke har en stabil Rg, på grund af cross-peak forurening. Der kunne kun anvendes 5 billeder, der viste en semi-stabil Rg, når de blev trukket fra, gav de en Rg = 36,3 Å (Figur 2,grøn). Når toppe blev deconvoluted ved hjælp af MILJØMÆSSIGE Fokusstof den tilsvarende kurve for den anden top (Figur 2, blå) blev overlejret med den oprindelige og viste et klart fald i signal til støj, og en lavere Rg, 34,1 Å blev registreret. Kratky plottet (Figur 3) viser komplekset med deconvoluted peak (blå) er mere kugleformet. Dette bekræftes af P(r)-kurven (Figur 4), som giveren værdi på 108,5 Å for den dekonvoluterede kurve (blå), mens den ikke-dekonvoluterede er mere aflange med en dmax 120 Å (grøn), dette skyldes sandsynligvis heterogenitet som følge af den ubundne E9 exominuso minuso.
Figur 1: Signalplot af E9 exominus alene og med DNA i kompleks.
Det øverste panel viser et plot af det integrerede forhold til baggrunden for hver ramme af en SEC-SAXS-kørsel (lyseblå). De røde punkter viser Rg ved hver ramme over toppen. Det nederste panel viser den tilsvarende varme kort viser resterne for hver ramme farvet i henhold til Durbin-Watson auto-korrelation analyse, regioner med høj lighed er farvet cyan mens forskellige rammer følge mørkere blues til pinks og endelig til rød afhængigt af sværhedsgraden af forskellen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Plot af intensitet versus spredning vektor.
En overlejring af de fratrukketE SAXS-data danner E9 exominus . I grønne 5 billeder (ramme 517\u2012522) i gennemsnit og trukket fra et område med semi-stabil Rg og i blåt den repræsentative spredningskurve afledt af EFA-deconvolutionen af SEC-SAXS-toppen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dimensionless Kratky kurve.
Overlejring af deconvoluted (blå) og ikke-deconvoluted (grøn) Kratky kurve viser E9 exominus er kugleformet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: P(r) kurve.
Overlejringen af de deconvoluterede (blå) og ikke-deconvoluterede (grønne) kurver for E9 exominus. Klik her for at se en større version af dette tal.
supplerende data. Klik her for at downloade denne fil
Discussion
Det ønskes at have en monodisperse prøve, før du starter et SAXS-eksperiment, men i virkeligheden opfylder mange dataindsamlinger ikke dette og skal forbedres ved at kombinere målingen med inline kromatografi - SEC i de fleste tilfælde. Selv manglen på tid mellem rensning og dataindsamling monodispersity af prøven er dog ikke garanteret. Dette gælder oftest for eksperimenter, hvor komponenter er for tæt på størrelse eller i deres fysiske egenskaber til at blive adskilt eller er tilbøjelige til hurtig dynamik. Her har vi givet en protokol, der kombinerer enkelt værdi nedbrydning med udvikling faktor analyse for at fjerne indflydelsen af DNAbound E9 exominus fra sin ubundneform skabe en monodisperse spredning profil, som vi dengang var i stand til at analysere med SAXS pakke Scatter IV.
SVD med EFA af SEC-SAXS data er meget effektive metoder udviklet til at deconvolvolute SAXS data og forbedre analysen, men de har begrænsninger. De kræver, at støj eller afdrift i SEC-SAXS's bufferlinje holdes på et minimum. Dette kan indebære ekstra kolonneeksvilibrering (bedre at bruge mere end 3 kolonnevolumener, afhængigt af bufferen) før prøvebelastning. Men det mest kritiske skridt er valget af antallet af entalværdier og det anvendte dataområde, da dette i høj grad vil påvirke nøjagtigheden af deconvolutionen. Det er grunden til, at resultaterne ikke bør tages på egen hånd, men yderligere analyseres ved hjælp af teknikker såsom analytisk ultracentrifugering (AUC) eller multi-vinkel-laser-lys-spredning (MALLS) for biologisk fortolkning.
Scatter IV er en ny, softwarepakke, gratis til forskning og industriel brug med en intuitiv brugergrænseflade, der giver selv ikke-eksperter til at analysere deres data. Scatter IV har flere nye funktioner, der hjælper med at forbedre analysen af SEC-SAXS data, såsom varme kort knyttet til signalplot, så større nøjagtighed med valg af ramme valg. I primær dataanalyse giver Guinier Peak-analysen og det krydsvalideringsplot, der er knyttet til P(r)-analysen, en integreret fejlfindingsdyrevne i softwaren.
Det skal nævnes, at mange andre programmer kan bruges til primær dataanalyse; disse indeholder de samme grundlæggende funktioner og opdateres også regelmæssigt, såsom BioXTAS RAW17 ATSAS pakke24 og US-SOMO15 for at nævne nogle få.
Men uanset hvilken SAXS-pakke der anvendes til analyse, er de vigtigste begrænsninger almindelige: prøveforberedelsen, før indsamling og analyse. I E9 exominus eksempel vist, er det klart at se en forbedring i signal til støj forhold og med en reduktion i Rg dmax forbundet med en monodisperse prøve. Dette vil i høj grad støtte yderligere behandling af data såsom montering eller modellering med kendte højopløsningsstrukturer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender den finansielle støtte til projektet fra det franske tilskud REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 og af forskningsbevillinger fra Service de Santé des Armées og Délégation Générale pour l'Armement. Vi er taknemmelige for ESRF for SAXS stråletid. Dette arbejde brugte platforme grenoble Instruct-ERIC center (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) inden for Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), støttet af FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) og GRAL, finansieret inden for Grenoble Alpes-kandidatskolen (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS anerkender integration i Det Tværfaglige Forskningsinstitut i Grenoble (IRIG, CEA). Vi takker Wim P. Burmeister og Frédéric Iseni for finansiel og videnskabelig støtte, og vi takker også Dr. Jesse Hopkins fra BioCAT på APS for hans hjælp og for at udvikle BioXTAS RAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |
References
- Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).
- Brosey, C. A., Tainer, J. A. Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).
- Gräwert, M., Svergun, D. A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS). The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).
- Meisburger, S. P., et al. Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).
- Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Scientific reports. 5, (2015).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).
- Ryan, T. M., et al. An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis. Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).
- Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations. Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).
- Maeder, M., Neuhold, Y. M. Practical Data Analysis in Chemistry. , Elsevier. Burlington. http://www.123library.org/book_details/?id=35069 (2007).
- Tarbouriech, N., et al. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).
- Brookes, E., Rocco, M. Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite. European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).
- Malaby, A. W., et al. Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).
- Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).
- Maeder, M. Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).
- Durand, D., et al. NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers. Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).
- Kirby, N., et al. Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law. Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).
- Franke, D., et al. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
