Summary
जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के एसईसी-बायोएक्सएक्सएस माप मैक्रोमॉलिक्यूल्स और उनके परिसरों की समाधान संरचना का निर्धारण करने के लिए एक मानक दृष्टिकोण हैं। यहां, हम एसईसी-बायोएक्सएक्सएस डेटा का विश्लेषण दो प्रकार के आमतौर पर सामना करने वाले एसईसी निशान-क्रोमोग्राम के साथ पूरी तरह से हल और आंशिक रूप से हल की गई चोटियों से करते हैं। हम स्कैटर और बायोक्सटास रॉ का उपयोग करके विश्लेषण और विखेष को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
BioSAXS एक लोकप्रिय तकनीक है जिसका उपयोग आणविक और संरचनात्मक जीव विज्ञान में समाधान संरचना, कण आकार और आकार, सतह से मात्रा अनुपात और मैक्रोमॉलिक्यूलिक्स और मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों के अनुरूप परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। संरचनात्मक मॉडलिंग के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले एसएक्सएस डेटासेट मोनोडिस्पर्स, सजातीय नमूनों से होना चाहिए और यह अक्सर केवल इनलाइन क्रोमेटोग्राफी और तत्काल एसएक्सएस माप के संयोजन से पहुंच जाता है। सबसे अधिक, आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग नमूनों को अलग करने और संदूषकों और एकत्रीकरण को ब्याज के कण से बाहर करने के लिए किया जाता है, जिससे एसएक्सएस माप एक प्रोटीन प्रजातियों के एक अच्छी तरह से हल क्रोमेट्रोग्राफिक चोटी से बनाया जा सकता है। फिर भी, कुछ मामलों में, यहां तक कि इनलाइन शुद्धिकरण मोनोडिस्पर्स नमूनों की गारंटी नहीं है, या तो क्योंकि कई घटक आकार में एक दूसरे के बहुत करीब हैं या बाध्यकारी परिवर्तन के माध्यम से प्रेरित आकार में परिवर्तन कथित एल्यूशन समय को बदल देते हैं। इन मामलों में, अलग-अलग घटकों के आदर्शीकृत एसेक्स घटता प्राप्त करने के लिए मिश्रण के एसएक्सएस डेटा को विघटित करना संभव हो सकता है। यहां, हम दिखाते हैं कि यह कैसे हासिल किया जाता है और एसईसी-एसएक्सएस डेटा का व्यावहारिक विश्लेषण आदर्श और कठिन नमूनों पर किया जाता है। विशेष रूप से, हम वैक्सिनिया E9 डीएनए पॉलीमरेज एक्सोन्यूलेस माइनस म्यूटेंट का एसईसी-एसएक्सएस विश्लेषण दिखाते हैं।
Introduction
जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स बहुत छोटे होते हैं जिन्हें सबसे अच्छे हल्के माइक्रोस्कोप के साथ भी देखा जाता है। उनकी संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए वर्तमान तरीकों में आम तौर पर एक ही समय में समान अणुओं की विशाल संख्या पर प्रोटीन या माप को क्रिस्टलाइज करना शामिल है। जबकि क्रिस्टलोग्राफी परमाणु स्तर पर जानकारी प्रदान करती है, यह एक कृत्रिम नमूना वातावरण का प्रतिनिधित्व करती है, यह देखते हुए कि अधिकांश मैक्रोमॉलिक्यूल्स को कोशिका में क्रिस्टलीय रूप में प्रस्तुत नहीं किया जाता है। पिछले कुछ वर्षों के दौरान क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने बड़े मैक्रोमॉलिक्यूल्स/मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स के समान उच्च-संकल्प संरचनाओं को वितरित किया, लेकिन हालांकि नमूने शारीरिक स्थिति के करीब हैं, वे अभी भी जमे हुए हैं, इसलिए स्थिर और स्थिर हैं । जैव-छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (BioSAXS) मैक्रोमॉल्यूल का एक संरचनात्मक माप प्रदान करता है, उन स्थितियों में जो जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक हैं। इस राज्य को नैनोमीटर पैमाने पर निर्धारित कम रिज़ॉल्यूशन 3-डी आकार के रूप में कल्पना की जा सकती है और समाधान में मैक्रोमॉल्यूल के पूरे अनुरूप स्थान को कैप्चर करता है। BioSAXS प्रयोग ओलिगोमेरिक स्थिति, डोमेन और जटिल व्यवस्थाओं के साथ-साथ डोमेन1,2,3के बीच लचीलेपन का कुशलतापूर्वक आकलन करते हैं। विधि सटीक है, ज्यादातर गैर विनाशकारी और आमतौर पर नमूना तैयारी और समय की केवल एक न्यूनतम की आवश्यकता होती है। हालांकि, डेटा की सबसे अच्छी व्याख्या के लिए, नमूनों को मोनोडिस्पर्स की आवश्यकता है। यह चुनौतीपूर्ण है; जैविक अणु अक्सर संदूषण, खराब शुद्धि और एकत्रीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, उदाहरण के लिए फ्रीज विगलन4से । तत्काल एसएक्सएस माप के बाद इनलाइन क्रोमेटोग्राफी का विकास इन प्रभावों को कम करने में मदद करता है। आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी नमूनों को आकार से अलग करती है इस प्रकार अधिकांश संदूषकों और एकत्रीकरण5,6, 7,8, 9,10को छोड़कर । हालांकि, कुछ मामलों में एसईसी-एसएक्सएस भी मोनोडिस्पर्स नमूने का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त नहीं है, क्योंकि मिश्रण में ऐसे घटक हो सकते हैं जो आकार में बहुत करीब हैं या उनके भौतिक गुण या उनकी तेज गतिशीलता एसईसी यूवी ट्रेस में अतिव्यापी चोटियों का कारण बनती है। इन मामलों में, प्राप्त एसएक्सएस डेटा के सॉफ्टवेयर आधारित विखेपन कदम से व्यक्तिगतघटक5,11,12का एक आदर्शीकृत सैक्स वक्र हो सकता है। एक उदाहरण के रूप में, प्रोटोकॉल सेक्शन 2 में, हम डीएनए के साथ जटिल में वैक्सिनिया ई9 डीएनए पॉलीमरेज एक्सोन्यूलेस माइनस म्यूटेंट (ई 9 एक्सोमाइनस)के मानक एसईसी-एसएक्सएस विश्लेषण दिखाते हैं। वैक्सिनिया पॉक्सविरिडी के मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है, जो कई रोगजनकों वाला परिवार है, उदाहरण के लिए मानव चेचक वायरस। पॉलीमरेज को जैव रासायनिक दृष्टिकोणों में डीएनए को कसकर बांधने के लिए दिखाया गया था, परिसर की संरचना के साथ हाल ही में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी13द्वारा हल किया गया था।
अधिकांश सिंक्रोट्रॉन सुविधाएं एक स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन प्रदान करेंगी जो डेटा सामान्यीकरण और एकीकरण का प्रदर्शन करेगी जो अनसंट्रैक्टेड फ्रेम का एक सेट का उत्पादन करेगी। लेकिन इस पांडुलिपि में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग प्रयोगशाला स्रोत के साथ भी किया जा सकता है बशर्ते एसईसी-सैक्सएस किया जाए। इसके अलावा, अतिरिक्त स्वचालन उपलब्ध हो सकता है जो विकिरण-क्षतिग्रस्त फ्रेम को अस्वीकार करेगा और बफर घटाव14करेगा। हम बताएंगे कि प्री-प्रोसेस्ड डेटा पर प्राथमिक डेटा विश्लेषण कैसे किया जाए और सेक्शन 2 में सबसे अधिक उपलब्ध डेटा बनाया जाए।
सेक्शन 3 में, हम एसईसी-एसएक्सएस डेटा को डिकोवोल्यूट करने और घटता का कुशलतापूर्वक विश्लेषण करने के तरीके दिखाते हैं। जबकि गॉसियन पीक डिकोवोल्यूशन जैसे कई डिकोवोोल्यूशन विधियां हैं, जिन्हें यूएस-सोमो15 में लागू किया गया है और गिनीयर अनुकूलित अधिकतम संभावना विधि, डेला सॉफ्टवेयर16में लागू की गई है, इन्हें आम तौर पर पीक आकार12के लिए एक मॉडल की आवश्यकता होती है। हम जिन व्यक्तिगत चोटियों की जांच कर रहे हैं, उनका परिमित आकार विकसित कारक विश्लेषण (ईएफए) के उपयोग को एकवचन मूल्य अपघटन (एसवीडी) के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है, जो चरम आकार पर निर्भर किए बिना या प्रोफ़ाइल5,11को बिखरने के बिना ओवरलैपिंग चोटियों को अलग करने के लिए। एक सैक्सएस-विशिष्ट कार्यान्वयन बायोक्सटास रॉ17में पाया जा सकता है। ईएफए का उपयोग सबसे पहले क्रोमेटोग्राफी डेटा पर किया गया था जब 2D डायोड सरणी डेटा ने मैट्रिस को प्रतिधारण समय और तरंगदैर्ध्य डेटा18के खिलाफ अवशोषण से गठन करने की अनुमति दी थी। जहां ईएफए एक्सेल है कि यह विलक्षण मूल्यों के उभरते चरित्र पर केंद्रित है, वे नए घटकों की उपस्थिति के साथ कैसे बदलते हैं, चेतावनी के साथ कि अधिग्रहण10में एक अंतर्निहित आदेश है। सौभाग्य से, एसईसी-एसएक्सएस डेटा संगठित 2D डेटा सरणी में सभी आवश्यक आदेश प्राप्त अधिग्रहण डेटा प्रदान करता है, जो ईएफए तकनीक को अच्छी तरह से उधार देता है।
सेक्शन 4 में, हम बफर-बैकग्राउंड घटाया एसएक्सएस वक्र से मॉडल-स्वतंत्र एसएक्सएस विश्लेषण की मूल बातें प्रदर्शित करेंगे। मॉडल-स्वतंत्र विश्लेषण कण के त्रिज्या--जाइरेशन (आरजी), वॉल्यूम-ऑफ-सहसंबंध (कुलपति), पोरोड वॉल्यूम (वीपी), और पोरोड-डेबी एक्सपोनेंट (पीई) को निर्धारित करता है। विश्लेषण आयामहीन Kratkyसाजिश2,4,19के माध्यम से कॉम्पैक्टनेस या लचीलेपन के मामले में कण की थर्मोडायनामिक स्थिति का अर्ध-मात्रात्मक आकलन प्रदान करता है।
अंत में, एसएक्सएस डेटा को पारस्परिक अंतरिक्ष इकाइयों में मापा जाता है और हम बताएंगे कि जोड़ी-दूरी, पी (आर), वितरण समारोह को ठीक करने के लिए एसएक्सएस डेटा को वास्तविक स्थान पर कैसे बदलना है। पी (आर) वितरण कण के भीतर पाया सभी दूरी का सेट है और कण के अधिकतम आयाम, डीअधिकतमभी शामिल है । चूंकि यह एक थर्मोडायनामिक माप है, इसलिए पी (आर) वितरण कणों के अनुरूप अंतरिक्ष द्वारा कब्जा किए गए भौतिक स्थान का प्रतिनिधित्व करता है। एक एसएक्सएस डेटासेट का उचित विश्लेषण समाधान-राज्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जो क्रिस्टलोग्राफी और क्रायो-ईएम से उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी प्रदान करता है।
Protocol
1. प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धि और एसईसी-एसएक्सएस माप प्रकाशित प्रोटोकॉल13 पर आधारित है
- संक्षेप में इनलाइन एसईसी-एसएक्सएस डेटा संग्रह प्रोटोकॉल (ब्रेनिच एट अल6)का पालन करें।
- एसईसी-कॉलम को एसईसी रनिंग बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 100 एमएमएम एनएसीएल) के कम से कम 2 कॉलम वॉल्यूम के साथ बराबर करें।
- आंशिक डीएसडीएनए (टीपीसीजीएगागाकसीजीटीजीटीसीटीसी और जीजीसीटीएएएसीसीजीसीटी) के 20% मोलर अतिरिक्त के साथ 8\u201210 मिलीग्राम/एमएल पर E9 exoऋण के नमूने के 50 माइक्रोन तैयार करें। E9 exoऋण 12 ± 6 एनएम के एक कश्मीरडी के साथ बांधता है (अनुपूरक डेटादेखें) ।
- 0.3 एमएल/मिनट पर एसएक्सएस माप के लिए प्रवाह सेल के साथ एसईसी-कॉलम (S200 वृद्धि) इनलाइन पर इस मिश्रण के 50 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
- प्रत्येक 1 एस एक्सपोजर पर 1000 फ्रेम ले लीजिए।
नोट: BioSAXS बीमलाइन BM29 पर, यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन सुविधा (ईएसआरएफ) में व्यक्तिगत फ्रेम को ईडीएनए फ्रेमवर्क14के भीतर स्वचालित रूप से और स्वतंत्र रूप से संसाधित किया जाता है। डेटा संग्रह के बाद, आईएसपीबी डेटाबेस20 खोलें और डेटा अधिग्रहण टैब के तहत डेटा सेट और स्वचालित विश्लेषण 21 के परिणामों तक पहुंचने के लिए गो बटनदबाएं।
- डेटा डाउनलोड करें।
2. प्राथमिक डेटा विश्लेषण
- जावा आधारित कार्यक्रम खोलें तितर बितर चतुर्थ (देखें सामग्री की तालिका) और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) डेटा के लिए एक पृष्ठभूमि घटाव करते हैं।
- एसईसी टैब खोलें। कम डेटा फ़ाइलों(*.dat)को "नीचे ड्रॉप डेटा" विंडो में खींचें और छोड़ दें। ब्लू-लेबल आउटपुट डीआईआर बटन पर क्लिक करके आउटपुट निर्देशिका "आउट डीआईआर::" सेट करें।
नोट: यदि आपका डेटाएनएम-1में एकत्र किया गया था, तो विंडो या घटाव टैब में फ़ाइलों को छोड़ते समय एक रूपांतरण बॉक्स (पैनल का नीचे बाएं) की जांच करने की आवश्यकता होगी। - प्रायोगिक विवरणों को संपादित करें, संपादित विवरण बटन का उपयोग करें और यथासंभव अधिक से अधिक क्षेत्रों को भरें, इनमें वे अनुभाग शामिल हैं जिन पर डेटा एकत्र करने के लिए स्रोत/बीमलाइन का उपयोग किया गया था, संग्रह मापदंड और नमूना विवरण । इन्हें डेटा के साथ सहेजा जाएगा और भविष्य के प्रकाशनों में "डेटा संग्रह मापदंडों" अनुभाग को अधिक आसानी से पॉप्युलेट करने की अनुमति देगा।
- बॉक्स के रूप में सेव में नमूना नाम दर्ज करें। ट्रेसपर क्लिक करें ।
नोट: यह दो प्रभाव है। सबसे पहले, यह डेटा के लिए एक *.sec फ़ाइल बनाएगा। यह एक एकल टेक्स्ट फ़ाइल है जो सभी प्रयोगात्मक टिप्पणियों को अलग *.dat फ़ाइलों से मिलान करेगी। इसके अलावा, *.sec फ़ाइल में फ्रेम का औसत सेट होता है जो बफर-बैकग्राउंड है, औसत में उपयोग किए जाने वाले सभी फ्रेम और साथ ही पूरे एसईसी-सैक्सएस प्रयोग में बफर-बैकग्राउंड घटाया फ्रेम। दूसरे, एक सिग्नल प्लॉट बनाया जाता है जो पृष्ठभूमि के लिए फ्रेम नंबर बनाम इंटीग्रल अनुपात को प्लॉट करता है। यह चयनित फ्रेम (ग्रे) दिखाता है जो बफर घटाव के लिए औसत थे। औसत बफर के लिए अंक डेटा की पूरी श्रृंखला से निर्धारित कर रहे हैं । हालांकि, खराब समतुल्य या गंदे कॉलम या केशिका फाउलिंग22के कारण खराब परिभाषित पृष्ठभूमि के रूप में औसत के लिए बफर फ्रेम को मैन्युअल रूप से चुनने की सलाह दी जाती है। - मैन्युअल रूप से बफर फ्रेम का चयन करें। क्लिक करें क्लियर बफर फिर ट्रेस कर्व पर बाएं क्लिक-ड्रैग के साथ एक बफर क्षेत्र को फिर से चुन ें। आदर्श रूप से, यह लगभग 100 फ्रेम के एसईसी कॉलम की शून्य मात्रा से पहले एक सपाट क्षेत्र होना चाहिए। सेट बफर पर क्लिक करें और फिर *.sec फ़ाइल की पुनर्गणना करने के लिए अपडेट करें जिसमें कुछ मिनट लग सकते हैं।
- ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) की पहचान करें। सिग्नल प्लॉट पर, ब्याज के शिखर के क्षेत्र का चयन करें, एक बाएं क्लिक-ड्रैग के साथ।
नोट: यह दाहिने हाथ पैनल में तीन भूखंडों आबाद । शीर्ष दो भूखंडों को उनके बीच जाने वाले क्रॉसहेयर के साथ जोड़ा जाता है, एक दूसरा सिग्नल प्लॉट (शीर्ष दाएं) केवल आरओआई को चयनित दिखाता है, नीले रंग में प्रत्येक फ्रेम की तीव्रता और लाल रंग में प्रत्येक फ्रेम की इसी आरजी और नीचे एक इसी गर्मी मानचित्र के साथ, ड्यूबिन-वाटसन ऑटो-सहसंबंध विश्लेषण के अनुसार रंगीन प्रत्येक फ्रेम के लिए अवशिष्ट दिखाता है। उच्च समानता के क्षेत्र रंगीन सियान (ड्यूबिन-वाटसन, डी = 2) हैं, जबकि अलग-अलग फ्रेम गुलाबी रंग के गहरे नीले रंग के ब्लूज़ का पालन करेंगे और अंत में विघटन की गंभीरता के आधार पर लाल रंग के होंगे (डी और जीटी; 2)। नीचे की साजिश केंद्रीय चयनित फ्रेम के लिए क्यू वक्र बनाम एक घटाया गया है (एक ऊर्ध्वाधर रेखा द्वारा भी चिह्नित)। तीर कुंजी घटाया फ्रेम के माध्यम से नेविगेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मैं बनाम क्यू प्लॉट एसईसी प्रयोग से घटाया फ्रेम की गुणवत्ता का प्रदर्शन करेगा। - विलय करने के लिए फ्रेम का चयन करें। विलय के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्रेम के सबसेट का चयन करने के लिए हीट मैप प्लॉट में क्रॉसहेयर पर क्लिक करें। क्रॉसहेयर मुख्य रूप से सियान के त्रिकोणीय क्षेत्र की पहचान करेंगे जो क्रॉसहेयर के दाएं हाथ की ओर नीचे गिरता है। इन फ़्रेमों को चयनित के रूप में सेट करने और ऊपर दिए गए सिग्नल प्लॉट के संबंधित क्षेत्र में फ़्रेम को हाइलाइट करने के लिए माउस-क्लिक का उपयोग करें। इन फ्रेम आदर्श एक स्थिर आरजी के साथ एक क्षेत्र पर प्रकाश डाला जाना चाहिए ।
नोट: आवश्यकतानुसार, बाएं क्लिक ड्रैग के साथ हीट मैप पर ज़ूम इन करें और दाईं ओर बाएं क्लिक स्वाइप के साथ ज़ूम करें। - चयनित फ्रेम से संतुष्ट होने पर मर्जपर क्लिक करें । यह घटाया फ्रेम विलय और उन्हें विश्लेषण टैब में पेश करेंगे।
- एसईसी टैब खोलें। कम डेटा फ़ाइलों(*.dat)को "नीचे ड्रॉप डेटा" विंडो में खींचें और छोड़ दें। ब्लू-लेबल आउटपुट डीआईआर बटन पर क्लिक करके आउटपुट निर्देशिका "आउट डीआईआर::" सेट करें।
3. डेटा डिक्वोल्यूशन
- डिकोवोल्यूशन प्रोग्राम खोलें (उदाहरण के लिए, बायोक्सटास रॉ 2.0.0)।
- डिकोवोल्यूशन प्रोग्राम में, कंट्रोल पैनलमें फाइल्स टैब के नीचे डेटासेट लोड करें, डेटा का पता लगाने या कॉपी करने और स्थान को पते के बार में चिपकाने के लिए फोल्डेथर सिंबल का उपयोग करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि फ़ोल्डर में केवल कच्ची * .dat फ़ाइलें हैं और कोई प्रोसेस या औसत डेटा फ़ाइलें नहीं हैं। - सभी * .dat फ़ाइलों को हाइलाइट करें, प्लॉट सीरीज बटन को हिट करें, "सीरीज प्लॉट" में एकीकृत तीव्रता बनाम फ्रेम नंबर का एक भूखंड खींचा जाएगा।
- नियंत्रण कक्ष में श्रृंखला टैब का चयन करें और फिर वक्र को हाइलाइट करने के लिए क्लिक करें। नियंत्रण कक्ष के आधार पर बटन का उपयोग करके एलसी विश्लेषण पॉप-अप विंडो खोलें। यह विंडो कई विकल्पों तक पहुंच प्रदान करती है, जैसे अलग-अलग अणु प्रकारों (प्रोटीन या आरएनए) का चयन करना। यह उपयोगकर्ता को साजिश के लिए बफर क्षेत्र का चयन करने की भी अनुमति देता है। पहली बार में क्लिक करें ऑटो; यह एक उपयुक्त बफर क्षेत्र का चयन करना चाहिए ।
नोट: यदि यह विफल रहता है, संभवतः एक अस्थिर आधार रेखा के कारण, तो बफर क्षेत्र को अनुकूलित करने के लिए "क्षेत्र जोड़ें" । यह बफर बॉक्स को एक छोटे बॉक्स के साथ पॉप्युलेट करता है जिसमें कोई भी बफर के लिए उपयोग करने के लिए फ्रेम नंबरों को मैन्युअल रूप से जोड़ सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्लॉट पर किसी क्षेत्र का चयन करने का विकल्प देने के लिए "पिक" पर क्लिक करें। क्षेत्र का पता लगाएं, शुरू की स्थिति के लिए एक बार बाएं क्लिक करें, कर्सर को अगली स्थिति में ले जाएं और फिर से बाएं-क्लिक करें। एक से अधिक बफर स्थान जोड़ना आवश्यक हो सकता है। क्लिक करें बफर सेट और घटता घटाया जाएगा और आरजी एसईसी पीक भर में गणना की । यदि कोई पॉप-अप बॉक्स दिखाई देता है, तो ओकेपर क्लिक करें। - विकसित कारक विश्लेषण (EFA) शुरू करने के लिए, के तल पर हाइलाइट फ़ाइल पर सही क्लिक करें कंट्रोल पैनल और फिर चयन करें ईएफए मेनू से।
- चेक करें कि एक पॉप-अप विंडो खुलती है जो डेटा सेट के एकल मूल्य अपघटन (एसवीडी) को दिखाती है। नियंत्रण बॉक्स में, उपयोग फ्रेम बॉक्स की जांच करें ताकि पूरे चोटी क्षेत्र को डिकोवोल्यूट तीव्रता वाले भूखंड में कवर किया जा सके। "विलक्षण मूल्यों" साजिश, शीर्ष सही, बेसलाइन के ऊपर विलक्षण मूल्यों (अलग चोटियों/प्रजातियों) की तीव्रता से पता चलता है ।
नोट: बेसलाइन के ऊपर मौजूद बिंदुओं की संख्या मौजूद प्रजातियों के बिखरने की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । चेतावनी के साथ कि यह फ्लैट क्षेत्र के लिए विलक्षण मूल्य के सापेक्ष परिमाण है/ - एकल मूल्यों की संख्या को मान्य करने में मदद करने के लिए, नीचे ऑटोकोरिएलेशन प्लॉट का उपयोग करें। यह सही और बाएं एकल सहसंबंध वैक्टर दिखाता है। आगेक्लिक करें ।
नोट: ये अनिवार्य रूप से समाधान में वेक्टर के लिए बिखरने या एकाग्रता प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करते हैं। जहां निरपेक्ष आकार वेक्टर के महत्व को दर्शाता है। एक महत्वपूर्ण घटक में 1 के पास एक ऑटोसंबंध होगा (अंगूठे की कटऑफ का नियम है >0.6\u20120.7)। रॉ सहायक रूप से इसकी गणना करता है और #Significant एसवीएस बॉक्स, नीचे बाएं में दिखाया गया है, हालांकि यदि आवश्यक हो तो आप इसे बदल सकते हैं। यदि कई एकल मान (जैसे 4 +) हैं, तो उपयोग किए गए डेटा की सीमा में फेरबदल करते हुए केवल घटकों में से सिर्फ 2 या 3 को देखना आवश्यक हो सकता है। घटकों की संख्या कम होगी ईएफए विश्लेषण आसान होगा लेकिन कम डेटा का उपयोग करने की कीमत पर। जटिल स्थिति में, जहां बाएं और दाएं विलक्षण वैक्टर, जो समान होने चाहिए, महत्वपूर्ण एसवी संख्या को कम करने से मेल नहीं खाते हैं और बाएं और दाएं विलक्षण वैक्टर के समान होने तक उपयोग किए जाने वाले फ्रेम की संख्या को कम करते हैं। - जांच करें कि ईएफए की गणना प्रत्येक वेक्टर के लिए आगे और पीछे की दिशाओं में भूखंडों को उत्पन्न करके की जाती है। ये भूखंड तब दिखाते हैं जब घटक चयनित एसईसी-सैक्स डेटा के लिए समाधान प्रोफ़ाइल (आगे की साजिश) और निकास (पीछे की साजिश) शुरू होते हैं। रॉ इन श्रेणियों की पहचान करने की कोशिश करता है; काउंटरों के बगल में तीर का उपयोग करके इन्हें बदलें ताकि प्रत्येक सर्कल एक मोड़ बिंदु की शुरुआत में हो, जो बेसलाइन से बढ़ रहा है या गिर रहा है। आगेक्लिक करें ।
नोट: ईएफए के अंतिम चरण में एसवीडी वैक्टर को बिखरने वाले घटता में वापस बदल जाता है। खिड़की के बाईं ओर, पहले परिभाषित श्रेणियों को शीर्ष पर प्लॉट किया जाता है। ये श्रेणियां यह परिभाषित करने की बाधाएं हैं कि विलक्षण वैक्टर को बिखरने वाले घटता में वापस कहां घुमाएं। दाहिने हाथ पैनल प्रत्येक अलग चोटी के लिए, इन इसी बिखरने वक्र प्रोफाइल से पता चलता है । प्रत्येक चोटी की एकाग्रता के लिए एक साजिश है, कि elution प्रोफाइल और मतलब त्रुटि भारित ची2के लिए एक साजिश का प्रतिनिधि होना चाहिए । ची2 प्लॉट मूल डेटा सेट करने के लिए निर्धारित deconvolution डेटा को मापने है । आदर्श रूप से, यह सपाट होगा, हालांकि स्पाइक्स अक्सर देखे जा सकते हैं। - घटक रेंज नियंत्रणमें फेरबदल करके स्पाइक्स को कम करने या खत्म करने की कोशिश करें, पहले लगभग पहचानें जो फ्रेम स्पाइक (ची2 प्लॉट से) से मेल खाती है और फिर, रेंज नियंत्रण में, जिस घटक में यह फ्रेम होता है (यह एक से अधिक हो सकता है), तीर का उपयोग करके, इसी सीमा को ऊपर या नीचे ले जाएं।
नोट: यह एक प्रतिक्रिया का उत्पादन करना चाहिए, बढ़ रही है या स्पाइक कम । यदि स्पाइक फ्रेम एक से अधिक घटक में मौजूद था तो प्रत्येक घटक के बीच थोड़ा परीक्षण और त्रुटि आवश्यक हो सकती है। - जब न्यूनतम ची2 प्राप्त हो जाता है, तो वापसक्लिक करके सत्यापन जांच करें, पिछली विंडो यह सत्यापित करने की अनुमति देती है कि क्या किए गए परिवर्तनों ने मूल ईएफए भूखंडों को काफी बदल दिया है। यदि वे अभी भी वैध दिखते हैं, तो आगेक्लिक करें । क्लिक करें भूखंडों को बचाने के लिए ईएफए डेटा सहेजें और फिर किए गएक्लिक करें ; ईएफए खिड़की बंद करने के लिए।
नोट: एक दूसरा सत्यापन प्रत्येक घटक सीमा के बगल में चेक-बॉक्स पर क्लिक करना है, बदले में। ये प्रत्येक घटक के लिए एक सकारात्मक एकाग्रता बाधा प्रदान करते हैं और बंद करने से यह जांच होगी कि क्या ये डेटा सेट को काफी प्रभावित करते हैं। यदि एकाग्रता भूखंड में कोई परिवर्तन नहीं देखा जाता है तो डेटा मान्य हैं।
- चेक करें कि एक पॉप-अप विंडो खुलती है जो डेटा सेट के एकल मूल्य अपघटन (एसवीडी) को दिखाती है। नियंत्रण बॉक्स में, उपयोग फ्रेम बॉक्स की जांच करें ताकि पूरे चोटी क्षेत्र को डिकोवोल्यूट तीव्रता वाले भूखंड में कवर किया जा सके। "विलक्षण मूल्यों" साजिश, शीर्ष सही, बेसलाइन के ऊपर विलक्षण मूल्यों (अलग चोटियों/प्रजातियों) की तीव्रता से पता चलता है ।
- रॉ विंडो में वापस, घटता देखने के लिए नियंत्रण कक्ष में प्रोफाइल टैब पर क्लिक करें और नियंत्रण कक्षके हेरफेर टैब में, घटता को आगे हेरफेर करें या फ़ाइल पर सही क्लिक करके * .dat फाइलों के रूप में घटता बचाएं और मेनू पॉप अप से सेव चयनित फ़ाइल (एस) का चयन करें। फाइल को सेव करें। आगे के विश्लेषण के लिए स्कैटर IV का उपयोग करें।
नोट: अधिक जानकारी और deconvolution और EFA BioXTAS रॉ पर निर्देश https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ में पाया जाता है
4. एसएक्सएस गुणों का निर्धारण करें
नोट: SAXS निर्धारण के लिए एक में गहराई से ट्यूटोरियल Bioisis.net में पाया जाता है। यहां हम स्कैटर में सबसे उपयोगी बटन को हाइलाइट करते हुए कदम दृष्टिकोण से एक बुनियादी कदम दिखाते हैं।
- स्कैटर विश्लेषण टैब में, प्रत्येक नमूना फ़ाइल के दाईं ओर मैनुअल गिनीयर विश्लेषण टूल के लिए जी बटन दबाएं। जो प्लॉट खुलता है, वह टॉप बॉक्स में एलएन[आई (क्यू)बनाम क्यू2 और बॉटम बॉक्स में इसी अवशेष को दिखाता है । ऐसे बिंदुओं को जोड़ें या हटाएं कि अवशिष्टों में "मुस्कान" या "सिकोड़ी" सुविधा नहीं है। गिनीयर फिट में चयनित डेटा 1.3 की अधिकतम क्यू एक्स आरजी सीमा से अधिक नहीं होना चाहिए।
- सामान्यीकृत क्रायस्की बटन दबाएं; जो कथानक ऊपर चबूतरे पर जाता है, वह मैक्रोमॉल्यूल की संरचनात्मक स्थिति का अर्ध-मात्रात्मक आकलन प्रदान करता है, जो द्रव्यमान और एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत होता है।
नोट: क्रॉसहेयर (√3, १.१)19पर गिनीयर-क्रायकी पॉइंट नामित करते हैं । एक कॉम्पैक्ट, गोलाकार प्रोटीन गिनीयर-क्रायटी पॉइंट पर अधिकतम मूल्य के साथ एक ही चोटी दिखाएगा। एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित या बेलनाकार बायोपॉलिमर क्रॉसहेयर की तुलना में अधिकतम अधिक होगा और कम नहीं होगा। एक प्रोटीन जिसमें दोनों जोड़ डोमेन और लंबे समय तक चलने वाले असंरचित क्षेत्र क्रॉसहेयर के माध्यम से बढ़ी हुई अधिकतम के साथ मौजूद हो सकते हैं, लेकिन उच्च क्यू एक्स आरजी में एक स्पष्ट कमी की प्रवृत्ति भी दिखाएंगे। - कुलपति बटन (वॉल्यूम-ऑफ-सहसंबंध) पर क्लिक करें, जो दो भूखंडों, कुल बिखरे हुए तीव्रता और क्यू के एक समारोह के रूप में कुल बिखरे हुए तीव्रता का एक एकीकृत क्षेत्र लाता है। भूखंडों का उपयोग बिखरने वाले वक्र की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए त्वरित संदर्भ के रूप में किया जाता है।
नोट: कुल बिखरे हुए तीव्रता मैं(0) के प्रति संवेदनशील है और अगर यह सही ढंग से मापा नहीं गया है तो साजिश एक निरंतर लाइन नहीं दिखाएगा । एकीकृत क्षेत्र भूखंड, आदर्श रूप से, प्रत्येक सैक्स वक्र के लिए एक विस्तारित पठार के साथ एक सिग्माइडल लाइन दिखाना चाहिए। यदि नमूने में बफर बेमेल/घटाव, एकत्रीकरण या अंतरकण हस्तक्षेप होता है तो उच्च क्यू-मूल्यों पर तेज ढलान देखी जाएगी । - लचीलापन विश्लेषण शुरू करने के लिए लचीलापन बटन दबाएं। इससे चार पैनल और नीचे एक स्लाइडर के साथ एक विंडो खुलेगी। प्रत्येक खोला पैनल एक शक्ति कानून संबंध है कि कॉम्पैक्ट और लम्बी/लचीला बायोपॉलिमर्स23के बीच मौजूद है शोषण साजिश से पता चलता है । उपयोग करने के लिए, बॉक्स के नीचे स्लाइडर को दाएं से बाएं माउस बटन दबाए गए बाएं से बाएं ले जाएं। धीरे-धीरे बाईं ओर चलते रहें जब तक कि भूखंडों में से एक में एक पठार न पहुंच जाए।
नोट: यदि पठार पोरोड-डेबी प्लॉट में देखा जाता है, तो नमूना प्रकृति में कॉम्पैक्ट है, जो एक सामान्यीकृत Kratky भूखंड में गिनीयर-Kratky बिंदु पर एक चोटी के अनुरूप होना चाहिए। यदि पठार पहले Kratky-Debye साजिश में पहुंच गया है तो नमूना सबसे अधिक संभावना लम्बी या लचीला है । यदि SIBYLS साजिश पठार के लिए पहले है, तो नमूना सबसे अधिक संभावना दोनों कॉम्पैक्टनेस और लचीलापन, मिश्रित राज्यों के साथ एक कण के क्षेत्रों में शामिल हैं । पोरोड-डेबी कानून के साथ इस लचीलेपन के रिश्ते के लिए सिद्धांत को रेम्बो, एट अल23 में अति सुंदर रूप से संबोधित किया जाता है। - वॉल्यूमपर क्लिक करें । ऊपर से लचीलापन विश्लेषण के तुरंत बाद वॉल्यूम निर्धारण किया जाना चाहिए। जब लचीलापन विश्लेषण के बाद खोला जाता है, तो तीन और रेखांकन के साथ एक पॉप अप उत्पन्न होता है। नीचे में, बाएं कोने पोरोड-डेबी प्लॉट याद है, जहां एक लचीलापन साजिश से स्लाइडर छोड़ दिया, पठार क्षेत्र दिखा ।
- कण की मात्रा की गणना करने के लिए, बक्से में तीर बटन या प्रकार का उपयोग करके शुरू और अंत बिंदुओं को स्थानांतरित करें, ताकि साजिश पर नीली रेखा पठार क्षेत्र में फिट हो। एक निष्पक्ष परिणाम के लिए, शीर्ष सही Porod-Debye प्रतिपादक शक्ति कानून फिट में अवशिष्ट, कोई पैटर्न नहीं दिखाना चाहिए ।
- पी (आर) टैब दबाएँ। वास्तविक अंतरिक्ष वितरण बाएं पैनल में है और दाएं हाथ के पैनल में नमूने के लिए बिखरने वाला वक्र है। इसका उद्देश्य पारस्परिक अंतरिक्ष एसेक्स वक्र से नमूने का वास्तविक स्थान प्रतिनिधित्व बनाना है। आदर्श रूप में, वितरण वक्र कोई लहरों मौजूद के साथ चिकनी हो जाएगा और सिर्फ धीरे से एक्स धुरी चुंबन चाहिए ।
नोट: उपकरण की मापा क्यू-रेंज खराब बफर मिलान, एकत्रीकरण, विकिरण क्षति, उप-इष्टतम एक्सपोजर समय और कम कण सांद्रता के कारण पूरी तरह से उपयोग योग्य नहीं हो सकता है। पी (आर) निर्धारण कदम मौलिक रूप से एसएक्सएस डेटासेट की useable क्यूमिनट और क्यूमैक्स रेंज निर्धारित करेगा और यह डेटा की इस श्रेणी होना चाहिए जिसका उपयोग किसी भी बाद के मॉडलिंग या फिटिंग के लिए किया जाता है।- नमूना नाम पर सही क्लिक करें तो एक नई खिड़की खोलने के लिए खोजें DMAX पर क्लिक करें । डीमैक्स के लिए सीमाएं सुझाए गए क्यूमैक्स (उपयोग किए गए अधिकतम डेटा पॉइंट), लोअर और अपर डीअधिकतम सीमा और एक निचले और ऊपरी अल्फा स्कोर के साथ पूर्व-सेट हैं। तीन मॉडलों को चुना जा सकता है (L1-आदर्श, Legendre और मूर) और पृष्ठभूमि का उपयोग शामिल है । पहली बार में इन अपरिवर्तित छोड़ दें ।
- स्टार्ट बटन दबाएं। नीचे लिखे सुझाए गए डीमैक्स और अल्फा लेवल के साथ लेफ्ट पैनल में कंपोजिट डिस्ट्रीब्यूशन बनाया जाता है । यदि यह स्वीकार्य लग रहा है तो खिड़की बंद करो और पी (आर) टैब पर लौट जाओ । सुझाए गए क्यूमैक्ससे मेल खाने के लिए पारस्परिक अंतरिक्ष भूखंड को काटा गया होगा ।
- मॉडल मूरचुनें, पृष्ठभूमि पर क्लिक करें और फिर पॉप-अप बॉक्स से सुझाए गए मूल्यों के लिए अल्फा स्तर और डीमैक्स सेट करें। रिफाइन बटन दबाएं। एक क्रॉस-सत्यापन भूखंड यह दिखा रहा होगा कि किसी भी अंक को अस्वीकार कर दिया जाना था, लाल रंग में चिह्नित किया गया था। यदि केवल कुछ बिंदुओं को अस्वीकार कर दिया जाता है और वितरण अच्छा लगता है तो मॉडल अच्छा है।
नोट: क्रॉस-सत्यापन प्लॉट डेटा के उन क्षेत्रों को उजागर करेगा जो निर्धारित पी (आर) वितरण के साथ असंगत हैं। यदि अस्वीकृत क्षेत्र मुख्य रूप से कम क्यू क्षेत्र में है, तो यह वाई-एक्सिस के पास का क्षेत्र है, यह संभावना एक डीअधिकतम का सुझाव देती है जो बहुत कम है, एकत्रीकरण या उच्च क्रम अल्पाहार की उपस्थिति। यह उच्च और कम संकल्प जानकारी के बीच एक विसंगति पर प्रकाश डाला गया । यहां, डीमैक्स और क्यूमिन (बढ़ते स्टार्ट वैल्यू) को मैनुअल, ट्रायल-एंड-एरर अप्रोच का उपयोग करके समायोजित किया जाना चाहिए। इसी प्रकार, यदि अस्वीकृत क्षेत्र मुख्य रूप से उच्च-क्यू क्षेत्र में है, तो यह पृष्ठभूमि घटाव के साथ एक मुद्दे का संकेत दे सकता है या यह कि निर्धारित पी (आर) वितरण द्वारा संकेत को सार्थक रूप से समझाया जाना बहुत कमजोर है। इस मामले में, क्यूमैक्स को तब तक छोटा किया जाना चाहिए (अंत में कमी) जब तक कि कोई अतिरिक्त डेटा अस्वीकार नहीं किया जाता है। आदर्श रूप से, अस्वीकृत बिंदुओं को बेतरतीब ढंग से वितरित किया जाना चाहिए और उपयोग योग्य डेटा का 5% से कम बनाना चाहिए। एक ठीक से परिभाषित क्यूमिनट,क्यू मैक्स और "डीमैक्स" एक चिकनी वितरण का उत्पादन करेगा जहां डीमैक्स एक्स-एक्सिस को चूमता है। हालांकि, इस मूल्य को इतना न बढ़ाएं कि यह गिनीयर क्षेत्र को पूरी तरह से हटा दे। यह बिंदु आसानी से क्यू एक्स एल (क्यू) बॉक्स (तालिका के ऊपर पैनल के बाईं ओर) की जांच करके पाया जाता है। बिखरने वाले वक्र को "कुल बिखरे हुए तीव्रता भूखंड" द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, इस वक्र पर अधिकतम मोड़ से पहले सभी बिंदु गिनीयर क्षेत्र का हिस्सा हैं। अंक हटाने के बाद फिर से बढ़ाने के लिए प्रयास करें/"डीअधिकतमकम" और फिर एक बार फिर परिष्कृत । यदि समस्याएं बनी रहती हैं, खासकर जब सत्यापन वक्र की शुरुआत से कई बिंदुओं को अस्वीकार किया जा रहा है, तो यह दृढ़ता से पता चलता है कि डेटा संरचनात्मक मॉडलिंग के लिए आदर्श नहीं हैं।
- रिपोर्ट प्रिंट करने के लिए, विश्लेषण टैब पर वापस नेविगेट करें, नमूने को हाइलाइट करने के लिए बाएं-क्लिक करें फिर नमूने के नाम पर दाएं क्लिक करें और मेनू में सेट किए गए एकल डेटा से रिपोर्ट बनाने के लिए आगे बढ़ें। टिप्पणियों को जोड़ने की अनुमति देने के लिए एक टेक्स्ट बॉक्स खुलता है। एक पीडीएफ दस्तावेज सभी आंकड़े और उत्पन्न मूल्यों को दिखाते हुए उत्पादित किया जाता है।
Representative Results
शास्त्रीय फ्रेम चयन13 पर deconvolution का उपयोग करने का लाभ एक दूसरे पर प्रजातियों के प्रभाव को दूर करने के लिए, एक मोनोडिस्पर्स बिखरने संकेत का उत्पादन है । यह भी अक्सर शोर अनुपात के लिए एक बेहतर संकेत के साथ पीछा किया जाता है। जब E9 exoऋण डीएनए के लिए बाध्य है और सेकंड-SAXS का उपयोग कर चलाने के लिए, दो चोटियों(चित्रा 1)मनाया जाता है । पहली, बड़ी चोटी (लगभग फ्रेम 420 \u2012475) E9 exoऋण-डीएनएपरिसर दूसरा (लगभग फ्रेम 475 \ u2012540), अनबाउंड राज्य (अनुपूरक डेटा देखें: चित्रा 2)है । जबकि फ्रेम का चयन करने का शास्त्रीय दृष्टिकोण पहली चोटी में परिसर का एक स्थिर आरजी प्रदान करता है (अनुपूरक डेटा देखें: चित्रा 3), दूसरीचोटी स्पष्ट रूप से विलय हो गई है और भूखंड के पार आरजी से पता चलता है कि क्रॉस-पीक संदूषण के कारण ब्याज की दूसरी चोटी में स्थिर आरजी नहीं है। केवल 5 फ्रेम का उपयोग किया जा सकता है जिसने एक अर्ध-स्थिर आरजी दिखाया, जब घटाया गया तो उन्होंने एक आरजी = 36.3 Å(चित्रा 2,हरे रंग) दिया। जब चोटियों को ईएफए का उपयोग करके दूसरी चोटी(चित्रा 2,नीला) के लिए इसी वक्र का उपयोग करके मूल के साथ मढ़ा गया था और शोर के संकेत में स्पष्ट कमी दिखाई गई थी, और एक कम आरजी, 34.1 Å दर्ज किया गया था। Kratky प्लॉट(चित्रा 3)से पता चलता है कि जटिल को जटिल से पता चलता है कि जटिल है जो कि जटिल (नीला) अधिक गोलाकार है। इसकी पुष्टि पी (आर) वक्र(चित्रा 4)द्वारा की जाती है जो डिकंवोल्टेड कर्व (ब्लू) के लिए डीअधिकतम 108.5 Å देता है, जबकि गैर-डिकंवोल्टेड डीअधिकतम 120 Å (ग्रीन) के साथ अधिक विस्तारित होता है, यह अनबाउंड ई 9 एक्सोमाइनससे उत्पन्न होने वाली विषमता के कारण सबसे अधिक संभावना है।
चित्रा 1: अकेले और जटिल में डीएनए के साथ E9 exoऋण के संकेत साजिश ।
शीर्ष पैनल एक एसईसी-SAXS रन (हल्के नीले) के प्रत्येक फ्रेम के लिए पृष्ठभूमि के लिए अभिन्न अनुपात का एक भूखंड दिखाता है। लाल अंक शिखर पर प्रत्येक फ्रेम पर आरजी दिखाते हैं । नीचे पैनल इसी गर्मी ड्यूबिन-वाटसन ऑटो सहसंबंध विश्लेषण के अनुसार रंगीन प्रत्येक फ्रेम के लिए अवशिष्ट दिखा नक्शा दिखाता है, उच्च समानता के क्षेत्रों सियान रंग का होता है, जबकि अलग फ्रेम गुलाबी करने के लिए गहरे रंग के उदास का पालन करें और अंत में लाल करने के लिए असमानता की गंभीरता के आधार पर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: तीव्रता की साजिश बनाम बिखरने वेक्टर ।
घटाया सैक्स डेटा का एक ओवरले E9 एक्सोमाइनस बनाते हैं । हरे रंग के 5 फ्रेम (फ्रेम 517\u20125222) में अर्ध-स्थिर आरजी के क्षेत्र से औसत और घटाया गया और नीले रंग में एसईसी-सैक्स चोटी के ईएफए डिकोवोल्यूशन से प्राप्त प्रतिनिधि बिखरने वाले वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: आयामरहित Kratky वक्र।
E9 एक्सोमाइनस दिखा deconvoluted (नीला) और गैर-deconvoluted (हरा) Kratky वक्र का ओवरले गोलाकार है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: पी (आर) वक्र।
E9 एक्सोमाइनसके लिए डिकोवोल्यूटेड (नीला) और गैर-डीकंवोल्यूटेड (हरा) घटता का ओवरले। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एसएक्सएस प्रयोग शुरू करने से पहले मोनोडिस्पर्स नमूना होना वांछित है, लेकिन वास्तव में, कई डेटा संग्रह इसे संतुष्ट नहीं करते हैं और ज्यादातर मामलों में इनलाइन क्रोमेटोग्राफी-एसईसी के साथ माप को जोड़कर सुधारा जाना चाहिए। हालांकि, यहां तक कि नमूने की शुद्धि और डेटा अधिग्रहण के बीच समय की कमी की गारंटी नहीं है। सबसे अधिक, यह प्रयोगों पर लागू होता है जहां घटक आकार में बहुत करीब होते हैं या उनके भौतिक गुणों को अलग करने के लिए या तेजी से गतिशीलता से ग्रस्त होते हैं। यहां, हमने एक प्रोटोकॉल प्रदान किया है जो विकसित कारक विश्लेषण के साथ एकल मूल्य अपघटन के साथ अपने अनबाउंडफॉर्म से DNAbound E9 exoऋण के प्रभाव को दूर करने के लिए एक मोनोडिस्पर्स बिखरने वाली प्रोफ़ाइल बना रहा है जिसे हम तब सैक्स पैकेज स्कैटर IV के साथ विश्लेषण करने में सक्षम थे।
एसईसी-एसएक्सएस डेटा के ईएफए के साथ एसवीडी एसएक्सएस डेटा को डिकोवोल्यूट करने और विश्लेषण में सुधार करने के लिए विकसित बहुत शक्तिशाली तरीके हैं, लेकिन उनकी सीमाएं हैं। उन्हें एसईसी-एसएक्सएस के बफर बेसलाइन में शोर या बहाव की आवश्यकता होती है। इसमें नमूना लोड होने से पहले अतिरिक्त कॉलम संतुलन (बफर के आधार पर 3 से अधिक कॉलम वॉल्यूम का उपयोग करना बेहतर) शामिल हो सकता है। हालांकि, सबसे महत्वपूर्ण कदम विलक्षण मूल्यों की संख्या और उपयोग किए गए डेटा की सीमा का विकल्प है, क्योंकि यह बहुत ही सटीकता को प्रभावित करेगा। यही कारण है कि परिणामों को अपने दम पर नहीं लिया जाना चाहिए, लेकिन जैविक व्याख्या के लिए विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन (एयूसी) या बहु-कोण-लेजर-लाइट-स्कैटरिंग (मॉल) जैसी तकनीकों का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया जाना चाहिए।
स्कैटर IV एक नया, सॉफ्टवेयर पैकेज है, जो एक सहज यूजर इंटरफेस के साथ अनुसंधान और औद्योगिक उपयोग के लिए मुफ्त है जो गैर-विशेषज्ञों को भी अपने डेटा का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। स्कैटर IV में कई नई विशेषताएं हैं जो एसईसी-सैक्स डेटा के विश्लेषण को बेहतर बनाने में मदद करती हैं, जैसे सिग्नल प्लॉट से जुड़ा हीट मैप, फ्रेम चयन की पसंद के साथ अधिक सटीकता को सक्षम करता है। प्राथमिक डेटा विश्लेषण में, गिनीयर पीक विश्लेषण और पी (आर) विश्लेषण से जुड़े क्रॉस-सत्यापन भूखंड सॉफ्टवेयर में एक एकीकृत समस्या निवारण क्षमता प्रदान करते हैं।
यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि प्राथमिक डेटा विश्लेषण के लिए कई अन्य कार्यक्रमों का उपयोग किया जा सकता है; इनमें एक ही बुनियादी विशेषताएं होती हैं और बायोक्सटास रॉ17 एटीएसएएस पैकेज24 और यूएस-सोमो15 जैसे नियमित रूप से अपडेट किए जाते हैं।
लेकिन भले ही एसएक्सएस पैकेज का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जाता है, प्रमुख सीमाएं आम हैं: नमूना तैयारी, संग्रह और विश्लेषण से पहले। E9 exoमाइनस उदाहरण में दिखाया गया है, यह शोर अनुपात के लिए संकेत में सुधार देखने के लिए और आरजी डीअधिकतम एक मोनोडिस्पर्स नमूने के साथ जुड़े में कमी के साथ स्पष्ट है । यह ज्ञात उच्च-संकल्प संरचनाओं के साथ फिटिंग या मॉडलिंग जैसे डेटा के आगे प्रसंस्करण में बहुत सहायता करेगा।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम फ्रांसीसी अनुदान REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 से परियोजना के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं और सेवा डी सैंटे डेस आर्मेस और डेलेग्नेशन Générale डालना l'Armement से अनुसंधान अनुदान के द्वारा। हम एसएक्सएस बीम समय के लिए ईएसआरएफ के आभारी हैं। इस काम ने ग्रेनोबल निर्देश-एरिक सेंटर (आईएसबीजी) के प्लेटफार्मों का उपयोग किया; एफआरएसबी (एएनआर-10-आईएनबीएस-05-02) और जीआरएएल द्वारा समर्थित स्ट्रक्चरल बायोलॉजी (पीएसबी) के लिए ग्रेनोबल पार्टनरशिप के भीतर यूएमएस 3518 सीएनआरएस-सीईए-यूगा-ईएमबीएल, विश्वविद्यालय ग्रेनोबल आल्प्स ग्रेजुएट स्कूल (इकोलेस यूनीवर्सिटेयर्स डी रेचेचे) सीबीएच-यूरो-जीएस (एएनआर-17-यूआरई-0003) के भीतर वित्त पोषित। आईबीएस ग्रेनोबल के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान (IRIG, सीईए) में एकीकरण को स्वीकार करता है । हम वित्तीय और वैज्ञानिक समर्थन के लिए Wim पी बर्मीस्टर और फादरएडेरिक इसेनी को धन्यवाद देते हैं और हम उनकी मदद के लिए और बायोक्सटास रॉ के विकास के लिए एपीएस में बायोकैट से डॉ जेसी हॉपकिंस को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |
References
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