Summary
SEC-BioSAXS målinger av biologiske makromolekyler er en standard tilnærming for å bestemme løsningsstruktur av makromolekyler og deres komplekser. Her analyserer vi SEC-BioSAXS-data fra to typer vanlige SEC-spor – kromatatogrammer med fullstendig løste og delvis løste topper. Vi demonstrerer analysen og dekonivolution ved hjelp av scatter og BioXTAS RAW.
Abstract
BioSAXS er en populær teknikk som brukes i molekylær og strukturell biologi for å bestemme løsningsstrukturen, partikkelstørrelse og form, overflate-til-volum-forhold og konformasjonsendringer av makromolekyler og makromolekylære komplekser. Et SAXS-datasett av høy kvalitet for strukturell modellering må være fra monodisperse, homogene prøver, og dette nås ofte bare ved en kombinasjon av innebygd kromatografi og umiddelbar SAXS-måling. Oftest brukes størrelsesekskludering kromatografi til å skille prøver og utelukke forurensninger og aggregasjoner fra interessepartikkelen slik at SAXS-målinger kan gjøres fra en godt løst kromatografisk topp av en enkelt proteinart. Likevel, i noen tilfeller, selv inline rensing er ikke en garanti for monodisperse prøver, enten fordi flere komponenter er for nær hverandre i størrelse eller endringer i form indusert gjennom binding endre oppfattet elution tid. I slike tilfeller kan det være mulig å dekonvolutere SAXS-dataene til en blanding for å oppnå de idealiserte SAXS-kurvene til individuelle komponenter. Her viser vi hvordan dette oppnås, og den praktiske analysen av SEC-SAXS-data utføres på ideelle og vanskelige prøver. Spesielt viser vi SEC-SAXS-analysen av vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.
Introduction
Biologiske makromolekyler er for små til å bli sett selv med de beste lette mikroskopene. Nåværende metoder for å bestemme sine strukturer innebærer vanligvis krystallisering av proteinet eller målinger på et stort antall identiske molekyler samtidig. Mens krystallografi gir informasjon om atomnivået, representerer det et kunstig prøvemiljø, gitt at de fleste makromolekyler ikke presenteres i krystallinsk form i cellen. I løpet av de siste par årene har kryoelektronmikroskopi levert lignende høyoppløselige strukturer av store makromolekyler / makromolekylære komplekser, men selv om prøvene er nærmere fysiologisk tilstand, er de fortsatt frosset, derav immobile og statiske. Bio-liten vinkel Røntgensplitting (BioSAXS) gir en strukturell måling av makromolekylet, under forhold som er relevante for biologi. Denne tilstanden kan visualiseres som en lav oppløsning 3D-form bestemt på nanometer skala og fanger hele konformasjonsområdet til makromolekylet i løsningen. BioSAXS eksperimenter effektivt vurdere oligomerisk tilstand, domene og komplekse ordninger samt fleksibilitet mellom domener1,2,3. Metoden er nøyaktig, for det meste ikke-destruktiv og krever vanligvis bare et minimum av prøveforberedelse og tid. Men for den beste tolkningen av dataene må prøvene være monodispere. Dette er utfordrende; biologiske molekyler er ofte utsatt for forurensninger, dårlig rensing og aggregering, for eksempel fra fryse tining4. Utviklingen av inline kromatografi etterfulgt av umiddelbar SAXS-måling bidrar til å redusere disse effektene. Størrelse-ekskludering kromatografi skiller prøvene etter størrelse dermed unntatt de fleste forurensninger og aggregasjoner5,6,7,8,9,10. Men i noen tilfeller er selv SEC-SAXS ikke tilstrekkelig til å produsere en monodisperse prøve, fordi blandingen kan bestå av komponenter som er for nær i størrelse eller deres fysiske egenskaper eller deres raske dynamikk fører til overlappende topper i SEC UV-spor. I slike tilfeller kan et programvarebasert overføringstrinn for de oppnådde SAXS-dataene føre til en idealisert SAXS-kurve for den enkeltekomponenten 5,11,12. Som et eksempel, i protokollseksjon 2, viser vi standard SEC-SAXS-analyse av vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant (E9 exominus) i kompleks med DNA. Vaccinia representerer modellorganismen til Poxviridae, en familie som inneholder flere patogener, for eksempel det menneskelige koppeviruset. Polymerasen ble vist å binde seg tett til DNA i biokjemiske tilnærminger, med strukturen av komplekset nylig løst av røntgenkrystallografi13.
De fleste synchrotron-anlegg vil gi en automatisert databehandlingsrørledning som vil utføre data normalisering og integrering som produserer et sett med ikke-prosenterte rammer. Men tilnærmingen beskrevet i dette manuskriptet kan også brukes med en laboratoriekilde forutsatt at SEC-SAXS utføres. Videre kan ytterligere automatisering være tilgjengelig som vil avvise strålingsskadede rammer og utføre bufferundertraksjon14. Vi vil vise hvordan du utfører primærdataanalyse på forhåndsbearbeidede data og får mest mulig ut av de tilgjengelige dataene i avsnitt 2.
I avsnitt 3 viser vi hvordan vi dekonvoluterer SEC-SAXS-data og analyserer kurvene effektivt. Mens det finnes flere deconvolution metoder som Gaussian peak deconvolution, implementert i USA-SOMO15 og Guinier optimalisert maksimal sannsynlighet metode, implementert i DELA programvare16, disse vanligvis krever en modell for toppform12. Den begrensede størrelsen på individuelle topper vi undersøker tillater bruk av utviklende faktoranalyse (EFA), som en forbedret form for entall verdinedbrytning (SVD) for å dekonvolutere overlappende topper, uten å stole på toppformen eller spredningsprofilen5,11. En SAXS-spesifikk implementering finnes i BioXTAS RAW17. EFA ble først brukt på kromatografidata da 2D-diodematrisedata tillot matriser å bli dannet fra absorbans mot oppbevaringstid og bølgelengdedata18. Der EFA utmerker seg er at den fokuserer på den utviklende karakteren av entallsverdier, hvordan de endres med utseendet på nye komponenter, med forbeholdet om at det er en iboende rekkefølge i oppkjøpet10. Heldigvis gir SEC-SAXS-data alle nødvendige bestilte innhentingsdata i organiserte 2D-dataarrayer, og låner seg pent til EFA-teknikken.
I avsnitt 4 vil vi demonstrere det grunnleggende om modelluavhengig SAXS-analyse fra bufferbakgrunnen trukket SAXS-kurven. Modelluavhengig analyse bestemmer partikkelens radius-of-gyration (Rg), volum-of-correlation (Vc), Porod Volume (Vp) og Porod-Debye Exponent (PE). Analysen gir en semi-kvantitativ vurdering av partikkelens termodynamiske tilstand når det gjelder kompakthet eller fleksibilitet via den dimensjonsløse Kratky-tomten2,4,19.
Til slutt måles SAXS-data i gjensidige plassenheter, og vi vil vise hvordan du forvandler SAXS-dataene til det virkelige rommet for å gjenopprette pardistansen, P(r), distribusjonsfunksjonen. P(r)-fordelingen er settet av alle avstander som finnes i partikkelen og inkluderer partikkelens maksimale dimensjon, dmaks. Siden dette er en termodynamisk måling, representerer P(r)-fordelingen det fysiske rommet som brukes av partiklenes konformasjonsrom. Riktig analyse av et SAXS-datasett kan gi løsningsstatistikk innsikt som utfyller høyoppløselig informasjon fra krystallografi og cryo-EM.
Protocol
1. Proteinuttrykk, rensing og SEC-SAXS-måling er basert på den publiserte protokollen13
- Følg den innebygde SEC-SAXS-datainnsamlingsprotokollen (Brennich et al.6) kort sagt.
- Likevekt SEC-kolonnen med minst 2 kolonnevolumer av SEC kjører buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl).
- Klargjør 50 μL prøve av E9 exominus ved 8\u201210 mg/ml med 20 % molaroverskudd av delvis dsDNA (TCAGGAAGATAACAGGTTTAGCC og GGCTAAACCGCTGTTATCTT). E9 exominus binder seg med en KD på 12 ± 6 nM (se Tilleggsdata).
- Injiser 50 μL av denne blandingen på en SEC-kolonne (S200 Increase) inline med strømningscellen for SAXS-målinger ved 0,3 ml/min.
- Samle 1000 rammer ved 1 s eksponering hver.
MERK: På BioSAXS beamline BM29, ved European Synchrotron Facility (ESRF) behandles de enkelte rammene automatisk og uavhengig innenfor EDNA-rammeverket14. Etter datainnsamlingen åpner du ISPyB-databasen20, og under kategorien Datainnhenting trykker du på Gå-knappen for å få tilgang til datasettet og resultatene av den automatiskeanalysen 21.
- Last ned dataene.
2. Primær dataanalyse
- Åpne det Java-baserte programmet Punkt IV (se Tabell over materialer) og utføre en bakgrunnsundertraksjon for data om størrelsesekskludering chromatography (SEC).
- Åpne kategorien SEC. Dra og slipp de reduserte datafilene (*.dat) inn i "Slipp data nedenfor" -vinduet. Angi utdatakatalogen "Out Dir ::" ved å klikke på den blåmerkede Output Dir-knappen.
MERK: Hvis dataene dine ble samlet inn i nm-1, må det merkes av for en konverteringsboks (nederst til venstre på panelet) når du slipper filer inn i vinduet eller subtraksjonsfanen. - Rediger eksperimentelle detaljer, bruk Rediger detaljer-knappen og fyll ut så mange felt som mulig, disse inkluderer seksjoner der kilde / strålelinje ble brukt til å samle inn data, innsamlingsparametere og eksempeldetaljer. Disse lagres med dataene og gjør det enklere å fylle ut delen "Datainnsamlingsparametere" i fremtidige publikasjoner.
- Skriv inn eksempelnavnet i Lagre som-boksen. Klikk på TRACE.
MERK: Dette har to effekter. For det første vil det opprette en *.sec-fil for dataene. Dette er en enkelt tekstfil som vil sortere alle eksperimentelle observasjoner fra de separate * .dat filene. I tillegg inneholder *.sec-filen det gjennomsnittlige settet med rammer som er bufferbakgrunnen, alle rammene som brukes i snittet, samt bufferbakgrunnsrammer på tvers av hele SEC-SAXS-eksperimentet. For det andre opprettes det et signalplott som plotter rammenummeret kontra Integral-forholdet til bakgrunnen. Dette viser de valgte rammene (grå) som ble i gjennomsnitt for bufferundertraksjonen. Punktene for den gjennomsnittlige bufferen bestemmes fra hele dataområdet. Det anbefales imidlertid å manuelt velge bufferrammene for snitt, da en dårlig definert bakgrunn kan oppstå på grunn av dårlig likevektige eller skitne kolonner eller kapillærbegroing22. - Velg bufferrammer manuelt. Klikk Fjern buffere, og velg deretter et bufferområde på nytt med et venstre klikk-dra i sporingskurven. Ideelt sett bør dette være en flat region før tomrommet til SEC-kolonnen på ca. 100 rammer. Klikk SET BUFFER, og oppdater deretter for å beregne *.sec-filen på nytt, noe som kan ta noen minutter.
- Identifiser et interesseområde (ROI). Velg området for toppen av interesse, med et venstre klikk-dra.
MERK: Dette fyller tre tomter i panelet til høyre. De to øverste plottene er knyttet til trådkors som beveger seg mellom dem, et annet signalplott (øverst til høyre) viser bare avkastningen valgt, med intensiteten av hver ramme i blått og tilsvarende Rg for hver ramme i rødt og et tilsvarende varmekart nedenfor, som viser rester for hver ramme farget i henhold til Durbin-Watson autokorrelasjonsanalyse. Regioner med høy likhet er farget cyan (Durbin-Watson, d = 2) mens ulike rammer vil følge mørkere blues til rosa og til slutt til røde avhengig av alvorlighetsgraden av ulikhet (d > 2). Bunnplottet er en trukket I versus q kurve for den sentrale valgte rammen (også merket med en vertikal linje). Piltastene kan brukes til å navigere gjennom de frasporede rammene. I versus q-plottet vil demonstrere kvaliteten på de fratrrive rammene fra SEC-eksperimentet. - Velg rammer som skal slås sammen. Klikk på trådkorset i varmekartplottet for å velge delsettet av rammer som skal brukes til sammenslåing. Trådkorset vil identifisere et trekantet område av hovedsakelig cyan som faller til nederst til høyre på trådkorset. Bruk et museklikk til å angi disse rammene som valgt, og uthev rammene i det tilsvarende området i Signalplottet ovenfor. Disse rammene bør ideelt sett markere en region med en stabil Rg.
MERK: Etter behov zoomer du inn på varmekartet med et venstreklikk dra og zoome ut med et venstreklikk sveip til høyre. - Når du er fornøyd med de valgte rammene, klikker du SLÅ SAMMEN. Dette vil slå sammen de fratrr.ramme og presentere dem i kategorien ANALYSE.
- Åpne kategorien SEC. Dra og slipp de reduserte datafilene (*.dat) inn i "Slipp data nedenfor" -vinduet. Angi utdatakatalogen "Out Dir ::" ved å klikke på den blåmerkede Output Dir-knappen.
3. Data deconvolution
- Åpne deconvolution-programmet (f.eks. BioXTAS Raw 2.0.0).
- I overføringsprogrammet laster du inn datasettet under Filer-fanen i Kontrollpanel tilå finne dataene eller kopiere og lime inn plasseringen i adresselinjen.
MERK: Kontroller at mappen bare inneholder rå *.dat filer og ingen behandlede eller gjennomsnittlige datafiler. - Fremhev alle * .dat filer, trykk på Plot Series-knappen, et plott med integrert intensitet versus rammenummer vil bli trukket i "Series Plot".
- Velg kategorien Serie i Kontrollpanel, og klikk deretter for å utheve kurven. Åpne popup-vinduet LC Analysis ved hjelp av knappen ved foten av kontrollpanelet. Dette vinduet gir tilgang til flere alternativer, for eksempel valg av ulike molekyltyper (protein eller RNA). Det gjør det også mulig for brukeren å velge bufferområdet for plottet. I første omgang klikker du Auto; dette bør velge et passende bufferområde.
Merk: Hvis dette mislykkes, muligens på grunn av en ustabil opprinnelig plan, deretter "Legg til område" for å optimalisere bufferområdet. Dette fyller ut Buffer-boksen med en mindre boks der man manuelt kan legge til rammenumrene som skal brukes for bufferen. Alternativt klikker du på "Velg" for å gi muligheten til å velge et område på plottet. Finn området, venstreklikk én gang for startposisjonen, flytt markøren til neste posisjon og venstreklikk igjen. Det kan være nødvendig å legge til mer enn én bufferplassering. Klikk Angi buffer og kurvene trekkes fra, og Rg beregnes over SEC-toppen. Hvis det vises en popup-boks, klikker du OK. - For å starte EFA (Developing Factor Analysis), høyreklikk på den uthevede filen nederst i Kontrollpanel , og velg deretter Efa fra menyen.
- Kontroller at et popup-vindu åpnes som viser enkeltverdinedbrytning (SVD) for datasettet. Merk av for Bruk rammer i kontroller-boksen slik at hele toppområdet som skal dekonvoluteres, dekkes i intensitetsplottet. "Singular Values"-plottet, øverst til høyre, viser intensiteten av entallsverdiene (separate topper/arter) over grunnlinjen.
MERK: Antall punkter som finnes over grunnlinjen representerer antall spredningsarter som finnes. Med forbeholdet om at det er den relative størrelsen på entallsverdien til det flate området / grunnlinjen som teller. - Hvis du vil validere antall enkeltverdier, bruker du det nederste Autokorrelasjonsplottet. Dette viser høyre og venstre enkeltkorrelasjonsvektorer. Klikk Neste.
MERK: Disse representerer i hovedsak sprednings- eller konsentrasjonsprofiler for vektoren i løsningen. Hvor den absolutte størrelsen representerer betydningen av vektoren. En betydelig komponent vil ha en autokorrelasjon nær 1 (en tommelavskjæringsregel er > 0,6 \\ u20120,7). RAW beregner dette på en nyttig måte og vises i #Significant SVs-boksen nederst til venstre, selv om du kan endre dette om nødvendig. Hvis det bare finnes flere enkeltverdier (f.eks. 4+), kan det være nødvendig å se bare på 2 eller 3 av komponentene, noe som endrer dataområdet som brukes. Jo lavere antall komponenter jo lettere EFA-analysen vil være, men på bekostning av å bruke mindre data. I komplekse situasjoner, hvor venstre og høyre entall vektorer, som skal være like, ikke samsvarer med redusere det betydelige SV-nummeret og redusere antall rammer som brukes til venstre og høyre entall vektorer er like. - Kontroller at EFA beregnes ved å generere plott i forover- og bakoverretningene for hver vektor. Disse plottene viser når komponenter starter (fremover plot) og exit (bakover plot) løsningsprofilen for de valgte SEC-SAXS-dataene. RAW prøver å identifisere disse områdene; endre disse ved hjelp av pilene ved siden av tellerne slik at hver sirkel er i begynnelsen av et bøyningspunkt stiger fra eller faller til baseline. Klikk Neste.
MERK: Den siste fasen av EFA gjør SVD-vektorene tilbake til spredningskurver. Til venstre for vinduet tegnes de tidligere definerte områdene øverst. Disse områdene er begrensningene for å definere hvor du skal rotere entallsvektorene tilbake til spredningskurver. Høyre panel viser disse tilsvarende spredningskurveprofilene, for hver separert topp. Et plott for konsentrasjonen av hver topp, som bør være representativ for elution profiler og et plott for gjennomsnittlig feil vektet chi2. Chi2-plottet måler overføringsdatasettet til det opprinnelige datasettet. Ideelt sett vil dette være flatt, men pigger kan ofte ses. - Prøv å redusere eller eliminere pigger ved å endre komponentområdekontrollene, først identifisere omtrent hvilken ramme som tilsvarer spissen (fra chi2-plottet), og deretter, i Områdekontrollene, hvilken komponent som inneholder denne rammen (det kan være mer enn én), ved hjelp av pilene, flytte opp eller ned tilsvarende område.
MERK: Dette bør gi et svar, øke eller redusere spissen. Hvis piggrammen var til stede i mer enn én komponent, kan det være nødvendig med litt prøving og feiling mellom hver komponent. - Når et minimum chi 2 er oppnådd, utfører du en valideringskontroll ved å klikke tilbake, det forrige vinduet ser ut til å tillate bekreftelse hvisendringene som er gjort, har endret de opprinnelige EFA-plottene drastisk. Hvis de fortsatt ser gyldige ut, klikker du Neste. Klikk Lagre EFA-data for å lagre plottene, og klikk deretter Ferdig. for å lukke EFA-vinduet.
Merk: En ny validering er å klikke av i avmerkingsboksen ved siden av hvert komponentområde, i sin tur. Disse gir en positiv konsentrasjonsbegrensning for hver komponent, og avspark vil kontrollere om disse påvirker datasettet betydelig. Hvis ingen endring er sett i konsentrasjonsplottet, er dataene gyldige.
- Kontroller at et popup-vindu åpnes som viser enkeltverdinedbrytning (SVD) for datasettet. Merk av for Bruk rammer i kontroller-boksen slik at hele toppområdet som skal dekonvoluteres, dekkes i intensitetsplottet. "Singular Values"-plottet, øverst til høyre, viser intensiteten av entallsverdiene (separate topper/arter) over grunnlinjen.
- Tilbake i RAW-vinduet klikker du kategorien Profiler i Kontrollpanel for å vise kurvene og i Manipulering-fanen i Kontrollpanelet,manipulerer kurvene ytterligere eller lagrer kurvene som *.dat-filer ved å høyreklikke på filen og velge lagre valgte filer fra menyen. Lagre filen. Bruk Scatter IV for videre analyse.
MERK: Ytterligere informasjon og instruksjoner om overføring og EFA BioXTAS RAW finnes på https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/
4. Bestem SAXS-egenskaper
MERK: En grundig veiledning for SAXS-bestemmelse finnes på Bioisis.net. Her viser vi en grunnleggende trinnvis tilnærming, og fremhever de mest nyttige knappene i Scatter.
- I kategorien Punktanalyse trykker du på G-knappen for det manuelle Guinier-analyseverktøyet til høyre for hver eksempelfil. Plottet som åpnes viser ln[I(q)] versus q2 i den øverste boksen og tilsvarende rester i den nederste boksen. Legg til eller fjern punkter slik at rester ikke har en "smil" eller "rynke" -funksjon. De valgte dataene i Guinier-passformen bør ikke overskride den maksimale q x Rg-grensen på 1,3.
- Trykk på normalisert Kratky-knappen; plottet som dukker opp gir en semi-kvantitativ vurdering av makromolekylets strukturelle tilstand, normalisert for masse og konsentrasjon.
MERK: Trådkorset utpeker Guinier-Kratky-punktet på (√3, 1.1)19. Et kompakt, sfærisk protein vil vise en enkelt topp med maksimal verdi på Guinier-Kratky-punktet. En egenforstyrrelse eller sylindrisk biopolymer ville ha maksimalt større enn trådkorset og ville ikke redusere. Et protein som hadde både brettede domener og lange langstrakte ustrukturerte regioner kan presentere med økt maksimum gjennom trådkorset, men vil også vise en åpenbar avtagende trend ved høyere q x Rg. - Klikk på Vc-knappen (Volum-of-correlation), som bringer opp to tomter, den totale spredte intensiteten og et integrert område av den totale spredte intensiteten som en funksjon av q. Plottene brukes som en hurtigreferanse for å validere kvaliteten på spredningskurven.
MERK: Den totale spredte intensiteten er følsom for I(0), og hvis dette ikke er målt riktig, vil plottet ikke vise en kontinuerlig linje. Den integrerte arealtomten skal ideelt sett vise en sigmoidal linje med et utvidet platå for hver SAXS-kurve. Hvis det er bufferkonflikt/subtraksjon, aggregering eller interpartikkelinterferens i prøven, vil en skarp skråning bli observert ved høyere q-verdier. - Trykk på Fleksibilitet-knappen for å starte fleksibilitetsanalysen. Dette åpner et vindu med fire paneler og en glidebryter nederst. Hvert åpnede panel viser et plott som utnytter et makt-lovforhold som eksisterer mellom kompakte og langstrakte/ fleksible biopolymerer23. Hvis du vil bruke, flytter du glidebryteren nederst i boksen fra høyre mot venstre med venstre museknapp trykket. Fortsett å bevege seg sakte til venstre til et platå i en av tomtene er nådd.
MERK: Hvis platået er sett i Porod-Debye tomten, så prøven er kompakt i naturen, som bør være i samsvar med en enkelt topp på Guinier-Kratky punkt i en normalisert Kratky tomt. Hvis platået nås først i Kratky-Debye-tomten, er prøven mest sannsynlig langstrakt eller fleksibel. Hvis SIBYLS-plottet først er til platå, inneholder prøven mest sannsynlig områder med både kompakthet og fleksibilitet, en partikkel med blandede tilstander. Teorien for dette fleksibilitetsforholdet til Porod-Debye-loven er utsøkt adressert i Rambo, et al.23 - Klikk på Volum. Volumbestemmelse bør utføres umiddelbart etter fleksibilitetsanalysen ovenfra. Når den åpnes etter fleksibilitetsanalysen, genereres det en dukker opp med tre grafer til. I nederste venstre hjørne husker Porod-Debye-tomten hvor man forlot glidebryteren fra fleksibilitetsplottet, som viser det platåede området.
- Hvis du vil beregne volumet av partikkelen, flytter du start- og endepunktene ved hjelp av pilknappene eller skriver inn boksene, slik at den blå linjen på tomten passer til det platåede området. For et objektivt resultat, bør rester øverst til høyre Porod-Debye eksponent makt-lov passform, vise ingen mønster.
- Trykk på P(r)-fanen. Fordelingen av det virkelige rommet er i venstre panel og spredningskurven for prøven i panelet til høyre. Målet er å skape en representasjon av prøven fra den gjensidige SAXS-kurven. Ideelt sett vil distribusjonskurven være glatt uten bølger tilstede og bør bare forsiktig kysse x-aksen.
MERK: Instrumentets målte q-område kan ikke være helt brukbart på grunn av dårlig buffermatching, aggregering, strålingsskade, sub-optimale eksponeringstider og lave partikkelkonsentrasjoner. P(r)-bestemmelsestrinnet vil fundamentalt bestemme det brukbare qmin- og qmax-området til SAXS-datasettet, og det bør være dette dataområdet som brukes til etterfølgende modellering eller montering.- Høyreklikk på eksempelnavnet, og klikk deretter Søk etter DMAX for å åpne et nytt vindu. Grensene for dmax er forhåndsinnstå med den foreslåtte qmax (maksimalt antall datapunkter brukt), nedre og øvre dmaks grenser og en lavere og øvre alfa score. Tre modeller kan velges (L1-norm, Legendre og Moore) og bruk av bakgrunn inkludert. La disse være uendret i første omgang.
- Trykk på Start-knappen. En sammensatt distribusjon opprettes i venstre panel med det foreslåtte dmax- og alfanivået skrevet under. Hvis dette ser akseptabelt ut, lukker du vinduet og går tilbake til P(r)-fanen. Den gjensidige mellomromplottet vil ha blitt beskåret for å matche den foreslåtte qmax.
- Velg modellen Moore, klikk på Bakgrunn og sett deretter alfanivået og d makstil de foreslåtte verdiene fra popup-boksen. Trykk på finjusteringsknappen. Et plott på tvers av validering vises hvis noen punkter måtte avvises, merket med rødt. Hvis det bare er noen få punkter avvist og distribusjonen ser bra ut, er modellen god.
Merk: Kryssvalideringsplottet vil utheve områder av dataene som er uforenlige med den bestemte P(r)-distribusjonen. Hvis den avviste regionen hovedsakelig er i lav-q-regionen, det vil si regionen nær y-aksen, antyder dette sannsynligvis en dmaks som er for kort, tilstedeværelse av aggregering eller høyere rekkefølge oligomers. Det fremhever en inkonsekvens mellom høyere og lavere oppløsning informasjon. Her bør dmax og qmin (økende startverdi) justeres ved hjelp av en manuell, prøvings-og-feil-tilnærming. På samme måte, hvis den avviste regionen hovedsakelig er i high-q-regionen, kan dette indikere et problem med bakgrunnsundertraksjonen eller at signalet er for svakt til å bli meningsfylt forklart av den bestemte P(r)-fordelingen. I dette tilfellet bør qmax avkortes (redusere slutten) til ingen ytterligere data blir avvist. Ideelt sett bør avviste punkter distribueres tilfeldig og utgjør mindre enn 5% av de brukbare dataene. En riktig definert qmin, qmax og "dmax" vil gi en jevn fordeling der dmax kysser x-aksen. Men ikke øk denne verdien så mye at den helt fjerner Guinier-regionen. Dette punktet er lett å finne ved å merke av q x l(q) boksen (til venstre for panelet over tabellen). Spredningskurven erstattes av "Total Scattered Intensity plot", på denne kurven alle punkter før maks bøyning er en del av Guinier-regionen. Etter å ha fjernet punkter prøv igjen å øke / redusere "dmax" og deretter avgrense igjen. Hvis problemene vedvarer, spesielt når mange punkter blir avvist fra starten av valideringskurven, antyder dette sterkt at dataene ikke er ideelle for strukturell modellering.
- Hvis du vil skrive ut en rapport, går du tilbake til analysefanen, høyreklikker for å utheve eksemplet og høyreklikker deretter på eksempelnavnet og flytter til Opprett rapport fra enkeltdatasett på menyen. En tekstboks åpnes for å tillate at kommentarer legges til. Et PDF-dokument produseres som viser alle tallene og verdiene som genereres.
Representative Results
Fordelen med å bruke deconvolution over klassisk rammevalg13 er å fjerne påvirkning av arter på hverandre, og produsere et monodisperse spredningssignal. Dette følges også ofte med et bedre signal-til-støy-forhold. Når E9 exominus er bundet til DNA og kjøre ved hjelp av SEC-SAXS, observeres to topper (figur 1). Den første, store toppen (ca. rammer 420\u2012475) er E9 exominus-DNA-komplekset den andre (ca. rammer 475\u2012540), den ubundne tilstanden (se Tilleggsdata: Figur 2). Mens den klassiske tilnærmingen til å velge rammer gir en stabil Rg av komplekset i den første toppen (se Tilleggsdata: Figur 3),er den andre toppen tydelig slått sammen og Rg over tomten viser at den andre toppen av interesse ikke har en stabil Rg, på grunn av krysstoppforurensning. Bare 5 rammer kunne brukes som viste en semi-stabil Rg, når trukket de ga en Rg = 36,3 Å (Figur 2, grønn). Når toppene ble dekonvolutert ved hjelp av EFA den tilsvarende kurven for den andre toppen (Figur 2, blå) ble lagt med originalen og viste en klar reduksjon i signal til støy, og en lavere Rg, 34.1 Å ble registrert. Kratky-plottet (figur 3) viser at komplekset med den dekonvoluterte toppen (blå) er mer kuleformet. Dette bekreftes av P(r) kurven (Figur 4) som gir en dmax 108,5 Å for den dekonvoluterte kurven (blå) mens den ikke-dekonvoluterte er mer langstrakt med en dmax 120 Å (grønn), dette skyldes mest sannsynlig heterogenitet som oppstår fra den ubundne E9 exominus.
Figur 1: Signalplott av E9 exominus alene og med DNA i kompleks.
Topppanelet viser en tomt av det integrerte forholdet til bakgrunnen for hver ramme av en SEC-SAXS-kjøring (lyseblå). De røde punktene viser Rg på hvert bilde over toppen. Det nederste panelet viser det tilsvarende varmekartet som viser rester for hver ramme farget i henhold til Durbin-Watson auto-korrelasjonsanalyse, regioner med høy likhet er farget cyan mens ulike rammer følger mørkere blues til rosa og til slutt til rødt avhengig av alvorlighetsgraden av ulikheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intensitetsplott kontra spredningsvektor.
Et overlegg av de frasporede SAXS-dataene danner E9 exominus . I grønne 5 rammer (ramme 517\u2012522) i gjennomsnitt og trukket fra et område med semi-stabil Rg og i blått den representative spredningskurven avledet fra EFA-dekonivolution av SEC-SAXS-toppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dimensjonsløs Kratky kurve.
Overlegg av dekonvoluterte (blå) og ikke-dekonvoluterte (grønn) Kratky kurve som viser E9 exominus er kuleformet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: P(r) kurve.
Overlegget av dekonvolverte (blå) og ikke-dekonvoluterte (grønne) kurver for E9 exominus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsdata. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen
Discussion
Det er ønsket å ha en monodisperse prøve før du starter et SAXS-eksperiment, men i virkeligheten tilfredsstiller mange datasamlinger ikke dette og må forbedres ved å kombinere målingen med innebygd kromatografi - SEC i de fleste tilfeller. Men selv mangelen på tid mellom rensing og datainnsamling monodispersity av prøven er ikke garantert. Vanligvis gjelder dette eksperimenter der komponenter er for nær i størrelse eller i deres fysiske egenskaper som skal skilles eller er utsatt for rask dynamikk. Her har vi gitt en protokoll som kombinerer enkeltverdi nedbrytning med utviklende faktoranalyse for å fjerne påvirkningen av DNAbound E9 exominus fra sin ubundet form og skape en monodisperse spredningsprofil som vi da kunne analysere med SAXS-pakken Scatter IV.
SVD med EFA av SEC-SAXS-data er svært kraftige metoder utviklet for å dekonvolutere SAXS-data og forbedre analysen, men de har begrensninger. De krever at støy eller drift i bufferen baseline av SEC-SAXS holdes på et minimum. Dette kan innebære ekstra kolonnelikevekt (bedre å bruke mer enn 3 kolonnevolumer, avhengig av bufferen) før eksempelinnlasting. Det mest kritiske trinnet er imidlertid valget av antall entallsverdier og dataområdet som brukes, da dette i stor grad vil påvirke nøyaktigheten av overføringen. Det er av denne grunn at resultatene ikke bør tas på egen hånd, men videre analysert ved hjelp av teknikker som analytisk ultracentrifugation (AUC) eller multi-vinkel-laser-lys-spredning (MALLS) for biologisk tolkning.
Scatter IV er en ny programvarepakke, gratis for forskning og industriell bruk med et intuitivt brukergrensesnitt som gjør det mulig for selv ikke-eksperter å analysere dataene sine. Scatter IV har flere nye funksjoner som bidrar til å forbedre analysen av SEC-SAXS-data, for eksempel varmekartet knyttet til signalplottet, noe som muliggjør større nøyaktighet med valg av bildevalg. I primær dataanalyse tilbyr Guinier Peak-analysen og kryssvalideringsplottet knyttet til P(r)-analysen en integrert feilsøkingsevne i programvaren.
Det bør nevnes at mange andre programmer kan brukes til primær dataanalyse; disse inneholder de samme grunnleggende funksjonene og oppdateres også regelmessig, for eksempel BioXTAS RAW17 ATSAS-pakke24 og US-SOMO15 for å nevne noen.
Men uansett hvilken SAXS-pakke som brukes til analyse, er de viktigste begrensningene vanlige: prøveforberedelsen, før innsamling og analyse. I E9 exominus eksempel vist, er det klart å se forbedringen i signal til støy forholdet og med en reduksjon i Rg dmax forbundet med en monodisperse prøve. Dette vil i stor grad bidra til videre behandling av data som montering eller modellering med kjente høyoppløselige strukturer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner den økonomiske støtten til prosjektet fra det franske tilskuddet REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 og av forskningsstipender fra Service de Santé des Armées og Délégation Générale pour l'Armement. Vi er takknemlige til ESRF for SAXS-stråletiden. Dette arbeidet brukte plattformene til Grenoble Instruct-ERIC center (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) i Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), støttet av FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) og GRAL, finansiert i University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA). Vi takker Wim P. Burmeister og Frédéric Iseni for økonomisk og vitenskapelig støtte, og vi takker også Dr. Jesse Hopkins fra BioCAT ved APS for hans hjelp og for å utvikle BioXTAS RAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |
References
- Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).
- Brosey, C. A., Tainer, J. A. Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).
- Gräwert, M., Svergun, D. A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS). The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).
- Meisburger, S. P., et al. Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).
- Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Scientific reports. 5, (2015).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).
- Ryan, T. M., et al. An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis. Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).
- Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations. Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).
- Maeder, M., Neuhold, Y. M. Practical Data Analysis in Chemistry. , Elsevier. Burlington. http://www.123library.org/book_details/?id=35069 (2007).
- Tarbouriech, N., et al. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).
- Brookes, E., Rocco, M. Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite. European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).
- Malaby, A. W., et al. Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).
- Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).
- Maeder, M. Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).
- Durand, D., et al. NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers. Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).
- Kirby, N., et al. Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law. Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).
- Franke, D., et al. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
