Summary
Præsenteret her er en protokol for isolering og forstærkning af aerob og fakultativ anaerob mus conjunctival commensal bakterier ved hjælp af en unik øjenpind og kultur-baseret berigelse skridt med efterfølgende identifikation af mikrobiologiske baserede metoder og MALDI-TOF massespektrometri.
Abstract
Den okulære overflade blev engang betragtet som immun privilegeret og abiotisk, men for nylig ser det ud til, at der er en lille, men vedvarende commensal tilstedeværelse. Identifikation og overvågning af bakteriearter ved okulær slimhinde har været udfordrende på grund af deres lave forekomst og begrænsede tilgængelighed af passende metoder til commensal vækst og identifikation. Der er to standard tilgange: kultur baseret eller DNA sekventering metoder. Den første metode er problematisk på grund af de begrænsede genindvindbare bakterier, og den anden tilgang identificerer både levende og døde bakterier, der fører til en afvigende repræsentation af det okulære rum. Vi udviklede en robust og følsom metode til bakteriel isolation ved at bygge videre på standard mikrobiologiske dyrkningsteknikker. Dette er en vatpind-baseret teknik, ved hjælp af en "in-lab" lavet tynd vatpind, der er målrettet den nederste bindehinde, efterfulgt af en forstærkning skridt for aerob og fakultet anaerob slægter. Denne protokol har gjort det muligt for os at isolere og identificere konjunktivalarter som Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.osv. Tilgangen er egnet til at definere commensal mangfoldighed hos mus under forskellige sygdomsforhold.
Introduction
Formålet med denne protokol er at forbedre den specifikke isolering af levedygtige og sjældne aerobe og fakultative anaerob mikrober fra den okulære bindehinde for at karakterisere okulært mikrobiom. Omfattende undersøgelser har profileret commensal slimhinde samfund på hud, tarm, luftveje og kønsorganer og viser, at disse samfund påvirker udviklingen af immunsystemet ogrespons 1,2,3. Okulære commensal samfund har vist sig at ændre sig under visse sygdomme patologier, såsom Tør øjensygdom4, Sjögrens syndrom5 og diabetes6. Men evnen til at definere en typisk okulær overflade commensal samfund er hæmmet af deres relativt lave overflod i forhold til de andre slimhinde steder6,7,8. Dette giver anledning til en kontrovers om, hvorvidt der er en hjemmehørende okulær mikrobiom, og hvis det findes, om det adskiller sig fra huden mikrobiom og dermed dens lokale indvirkning på den medfødte immunsystemet udvikling og respons. Denne protokol kan hjælpe med at løse dette problem.
Generelt er metoder til at definere den okulære commensal niche baseret på sekventering og kulturbaserede teknikker4,7,9. 16 S rDNA sekventering og BRISK analyse7 viser en bredere mangfoldighed end kulturbaserede teknikker, men er ude af stand til at skelne mellem levende og døde mikrober. Da den okulære overflade er fjendtligt indstillet over for mange mikrober på grund af at rive filmens antimikrobielle egenskaber4 generere en lang række DNA-fragmenter, vil DNA-baserede tilgange opdage disse artefakter, som kan forvrænge dataene mod identifikation af døde bakterier som bosiddende commensals snarere end forurenende stoffer. Dette resulterer i afvigende commensal identifikation og karakterisering af okulære rum som værende højere i mikrobe overflod og mangfoldighed10. Dette gør det vanskeligt at definere det bosiddende okulære mikrobiom via DNA-baserede metoder. standardkulturbaserede teknikker er ikke i stand til at påvise commensals, fordi belastningen er for lav11. Vores metode forbedrer standardpraksis ved at bruge en tynd vatpind, der kan målrette konjunktivaen og dermed undgå forurening fra nabohud, samt konceptet om, at levedygtige organismer kan beriges af kort kultur i næringsrige tætte medier med det formål at genoplive levedygtige, men ikke-dyrkelige, samt berigelse for sjældne levedygtige mikrober.
Resultaterne, relativ overflod af okulære commensals per øjenpind, karakteriserer bindehinden hjemmehørende mikrobiom og er vigtige for komparative formål. Vores data viser, at der er forskel på hud og konjunktivalmikrobiota samt større diversitet med øget alder og en kønsspecifik forskel i overflod. Desuden har denne tilgang reproducerbart fundet commensale forskelle i knock-out mus12. Denne protokol kan anvendes til at beskrive det okulære mikrobiom, som kan variere på grund af caging praksis, geografi, eller sygdomstilstand, samt de lokale virkninger af commensal metabolitter og produkter på immunsystemet udvikling og respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer mus, følger retningslinjerne fra Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -brug. Følg retningslinjerne for laboratoriesikkerhed (som anvist af din institutionelle miljøsundheds- og sikkerhedsafdeling), når du arbejder med mikroorganismer og potentielt forurenede materialer. Brug passende affaldsbeholdere og dekontamineringsprocedurer forud for bortskaffelse af potentielt biofarlige forurenede materialer.
1. Forberedelse af øjenprøve, opsætning af arbejdsområder, museøjeswabbing og prøveberigelse
- Forbered sterile øjenprøver
BEMÆRK: Sterile øjenprøver er tyndt belagt træ tandstikkere med en fiber tynd lag bomuld pladevat og lavet i huset.- Autoklave passende mængde bomuld pladevat og tandstikkere for antallet af mus, der skal podes.
- Knib et halvt centimeter langt stykke bomuldsvat med tommelfinger og pegefinger. Drille ud batting ved at trække på kanterne med tommelfingre og pegefinger til at danne en flad enkelt porøs lag, stopper lige før batting falder fra hinanden (små bidder af bomuld spredt over hele strakte pladevat er acceptable).
- Svirr batting omkring en af de skarpe ender af tandstikker ved let at holde den strakte ud stykke på tandstikker spids, da det er snoet, se figur 1. Den "færdige" øjenpinne vil have et meget tyndt lag bomuld strakt over spidsen, der strækker sig ca. en halv til en centimeter væk fra spidsen.
- Sæt "færdige" podninger i lille bægerglas, vatpind medsiden nedad og dæksel. Autoklave.
- Konfigurere arbejdsområdet
- Anæstesi, der indeholder 2 ml ketamin (100 mg/mL), 400 μL xylazin (100 mg/ml) og 27,6 ml steril saltvand (0,9% NaCl i dH2O) i et sterilt 50 ml sterilt centrifugerør. Filtersteriliseres og aliquot anæstesi til umiddelbar brug (kan opbevares ved 4 °C i 1 måned; altid tillade ekvilibrere til stuetemperatur før brug).
- Ryd og rengør arbejdsområdet med desinfektionsmiddel for at minimere kontaminering.
- Aliquot 0,5 mL sterile Brain Heart Infusion media (BHI) i mærket 1,5 mL sterile mikrocentrifuge rør (1 rør pr. mus og kontrol); arrangere i mikrocentrifuge rack. Sæt stativet på is.
- Opsæt arbejdsflowet som følger (fra venstre mod højre): musbedøvelsesstation (bur indeholdende eksperimentelle mus, tomt sterilt bur, rumtemperaturbedøvelse, 25 G nål og 1 mL sprøjte), øjenswabbingstation (aliquoted BHI på is, steriliserede øjenprøver, rene papirhåndklæder, 70% isopropanolspray) og plating station (rumtemperatur blod agar plader, 10 μL pipette , 10 μL sterile engangsspidser, biofarlige affaldsbeholdere).
- Øje swabbing
- 10 μL anæstesi pr. 1 g musevægt dosering af henholdsvis ketamin og xylazin intraperitoneally til hver voksen mus og sted i en autoklaveret bur. Test bedøvelse ved at klemme bagfod pad; ingen bevægelse indikerer passende bedøvelse.
- Tildel den ene hånd til kun at håndtere bedøvede mus og den anden hånd til kun at håndtere øjenprøven og kulturen. Til swabbing skal du fjerne den fuldt bedøvede mus fra buret; placere oven på ren arbejdsflade placeret på siden med venstre øje udsat. Spray behandskede hænder med isopropanol, tør med rent køkkenrulle.
- Uncap specifikt mærket BHI mikro-centrifuge rør med dedikeret medier håndtering hånd. Placer røret tilbage i mikrocentrifugeholderen på is. Dyp den bomuldsbelagte spids af øjenprøven i BHI, træk øjenprøven ud af røret, der hvirvler spidsen 2 gange mod slangen for at fjerne overskydende væske.
- Hold forsigtigt musen ved nakken med musens håndteringshånd. Med den anden hånd, placere spidsen af øjet podning mod mediale conjunctival region af venstre øje, se figur 2A. Tryk let på øjeæblet og flyt vatpinden i en vinduesvaskebevægelse (Figur 2B) frem og tilbage, mellem det nederste øjenlåg og øjet, 10 gange. Hold konstant tryk.
- Uden at røre pelsen, forsigtigt fjerne spidsen af vatpind, vinkelret på, hvor det blev indsat, og læg vatpinden bomuld side ned direkte i en mærket mikro-centrifuge rør, der indeholder BHI medier. Påfør et smørende øjendråbe på det podede øje.
- Sæt musen tilbage i buret.
- Lad vatpinden stå i 10 til 15 minutter på is og fjern øjenpinden med den steriliserede behandskede hånd ved at blande spidsen i medierne i 10 rotationer. Rekvirer vatpinden ved at hvirvle spids mod mikrocentrifugerørets indervæg i 5 omdrejninger. Svaberen skal bortskaffes i en biofarlig beholder.
- Gentag trin 1.3.2 til 1.3.7 for hver mus og for kontrolprøver (skindprøve). Steriliser handskerne korrekt mellem hver vatpind.
- berigelse
- Prøven tilføres ved inkubering af røret statisk i 1 time ved 37 °C
- Under inkubation, mærke en stuetemperatur Trypticase Soja med 5% fåreblod agar plade (TSA plade) per mus og opdele i halve.
- Efter øjenprøvekulturinkubation fjernes berigede prøver fra inkubatoren og placeres på is.
- Kort vortex prøver til at blande og plade i henhold til skematiske i figur 3A. Prøven til aliquot 10 μL på TSA-pladen og vippes til en strimmel, gentag 2 gange.
- På den anden side af pladens skillelinje gentages 9 gange, prik 10 μL prøve på agar.
- Inkubatplader ved 37 °C i 18 timer, 2 dage og 4 dage (i et rent kammer, der forhindrer agarplader i at tørre). Tæl kolonier i strimler, noter morfologi og beregn kolonidannende enheder (CFU'er) pr. vatpind for morfologisk lignende isolater. Kig på prikker for unikke organismer, der ikke er fanget i strimler.
2. Master plade, karakterisering, og identifikation af okulære mikrober
-
Master plade
- Tegn gitre på bagsiden af en TSA-plade(Figur 3B). Vælg en koloni med en steril tandstikker fra hver mus øje podning plade og streak master plade pladsen (gitre), etiket gitter med koloni nummer og mus oplysninger. Pick og plade tre forskellige kolonier for hver morfologisk forskellige koloni.
- Pladen inkuberes natten over ved 37 °C. Fortsæt inkubation i 96 timer, kontroller dagligt for udseendet af nye isolater.
BEMÆRK: Den commensal befolkning vil variere baseret på musen alder, ernæring, sygdomstilstand og caging praksis. Isolere karakterisering er baseret på de fremherskende aerobe og fakultets anaerob bakterier findes i vores laboratorium.
-
Karakterisering
- Dupliker13 plademikrober på mannitol salt Agar-plader (MSA) og MacConkey-plader (MAC), der inkuberes natten over ved 37 °C. Bemærk vækst for hver isolere og tilstedeværelse af voksagtige kolonier eller gule kolonier med glorie på MSA.
- For Gram positiv cocci, test med katalase test13,14. Placer en dråbe på 3% brintoverilte på en ren glasrutsjebane. Ved hjælp af en steril tandstikker skal du vælge den tilsvarende mikrobe fra øjenprøvepladen. Ingen bobledannelse indikerer Streptococcus spp., let bobledannelse indikerer Corynebacterium spp. og måske Aerococcus spp. og hurtig bobledannelse indikerer Staphylococcus spp.
-
Identifikation: MALDI-TOF MS-analyse
BEMÆRK: Bakteriel identifikation udføres ved hjælp af MALDI-TOF og softwaredatabasen. Dette system anvender matrixassisteret laserdesorptionsioniseringstid for flyvemassespektrometri (MALDI-TOF MS) til udvikling af spektreprofiler, der sammenlignes med kendte bakteriespektre til identifikation. E.coli, ATCC 8739, anvendes til systemkalibrering.- Pladebakterielle isolater på TSA-plader, der indeholder 5% fåreblod og inkuberes natten over med 5% kuldioxid ved 37 °C.
- Ved hjælp af en 1 μL løkke påføres et tyndt lag af de rene bakterier på MALDI-TOF-måldiaset; 1 μL MALDI-TOF MS CHCA-matrixopløsning (alfacyano-4-hydroxycinnamicsyre) er overlejret og må lufttørres fuldstændigt, inden diaset indlæses i MALDI-TOF-instrumentet.
- Hver isolere er spottet i dubletter.
- Rapporter, der indeholder sandsynlighedsscores på over 80 %, hvilket indikerer en høj diskriminationsværdi, accepteres som pålidelige resultater, og den bakteriel identifikation accepteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater for en øjenprøveplade, der demonstrerer forskellige metoder til plating, er afbilledet i figur 3A, der viser morfologisk forskellige isolater fra C57BL/6-mus. For hver særskilt isolere, kolonierne blev talt i strimlen og den relative overflod, unikke Colony Forming Units (CFUs) per øjenpind, beregnet og plottet til sammenligning formål. Til mikrobiologisk karakterisering blev bakterier plukket fra individuelle museøjepindeplader for at producere en mester TSA-plade (skabt ved at plukke morfologisk forskellige isolater i tre eksemplarer fra hver museøjepindplade). Fra masterpladen, på den efterfølgende dag eller når der vises vækst, blev der kørt yderligere tests for at karakterisere eller identificere mikroberne. Masterpladen blev brugt til at give nok inoculum til at udvide de respektive isolater.
Arten blev karakteriseret ved hjælp af mikrobiologiske teknikker og derefter identificeret ved MALDI-TOF MS-analyse. Hver isolere fra master plade, blev testet af catalase test13,14 og dyrkes på selektive medier. Da de fremherskende mikrober i vores undersøgelser er Streptococcus spp., Staphylococcus spp. og Corneybacterium spp., Mannitol Salt Agar (MSA) og Mac Conkey Agar (MAC) blev brugt som den selektive agar13. Vækst på Mannitol Salt Agar indikerer Staphylococcus spp13,16. Da MSA indeholder phenolrød, angiver en gul glorie omkring kolonien mannitolgæring og klassificering som Staphylococcus aureus (bekræfter med alternative tests som Coagulase-test)13. Vækst på MacConkey agar indikerer Gram negative bakterier, da galdesalte og krystalviolet er i stand til at overskride bakteriemembranen og hæmme Gram positiv bakterievækst13. Voksagtig vækst på MSA indikerer produktion af mykolsyre og kan skyldes organismer som Corneybacterium spp13. Endelig skelner katalasetesten Streptococcus spp. fra Staphylococcus spp13,16, og i nogle tilfælde kan en svag positiv test indikere Aerococcus spp15.
For at identificere isolater blev en TSA-plade stribet og inkuberet natten over i et 5% kuldioxid- og 37 °C miljø, og MALDI-TOF MS blev udført. Figur 4 viser resultaterne S. acidominimus (et medlem af viridanerne Streptococcus spp. 17) og A. viridans. Ofte Aerococcus spp. er fejlidentificeret som viridangruppen af streptokokker18,19, baseret på biokemiske og fænotypiske tests. MALDI-TOF MS var i stand til at identificere isolater med et konfidensniveau på 99,9 uden uidentificerbare arter.
Kønsdiskusterede forskelle kan observeres i figur 5, hvor signifikant forskellige niveauer af commensale organismer blev genvundet fra mandlige og kvindelige C57BL/6 mus. Den relative overflod for hvert isoleret blev bestemt. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans og coagulase negative staphylococcus (CNS) isolerer #1 og E. coli spp. blev fundet i alle mus, med hannerne viser højere relativ overflod og større mangfoldighed.
Figur 1: Intern øjenprøve.
(A) En tynd, ca 1 cm, stykke trukket bomuld batting blev holdt mellem steril tandstikker punkt og pegefinger og tandstikker blev rullet og samtidig opretholde let tryk mod pegefingeren, indtil bomulden var helt rullet på tandstikker spids. (B) Eksempel på en øjenpind. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Placering af øjenprøven på mus.
(a)BHI våde øje podning spids blev indsat, i en 90 ° vinkel, i mediale hjørne af venstre øje af en bedøvet mus, deprimerende øjeæblet. (B) Podepinden blev flyttet langs bindehinden og samtidig opretholde et lille tryk på øjet i en frem og tilbage bevægelse, 10 gange. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater for øjenprøven og masterpladerne.
(A) 10 μL øjenprøve podet beriget medie blev aliquoted på højre side af blod agar plade og vippes 30 til 60 grader for at gøre det muligt for medierne at danne strimler og på venstre side af pladen, ti 10 μL prikker af prøven blev udleveret. Fotografiet af den inkuberede plade viser individuelle kolonier og morfologisk mangfoldighed. (B) En master plade af isolater blev skabt ved at vælge en koloni fra øjet podning plade og striber inden for en af de firkanter (gitre). Tre morfologisk lignende kolonier er stribet i separate gitre. Hvert gitter har tre striber af samme koloni, der blev plukket fra musen øje podning plade. Efter vækst dukkede op på pladerne, var isoleret karakteriseret ved selektiv plating og katalase test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på MALDI-TOF MS-resultater.
Hver isolere blev dyrket på TSA natten, anvendes til MALDI-TOF MS dias og overlejret med MALDI-TOF MS løsning, lufttørret og plettet i to eksemplarer. Resultaterne for Streptococcus acidominimus (A) og Aerococcus viridans (B) blev positivt identificeret med en konfidensværdi på 99,9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kønsdiskonminerende konjunkturvækst.
Aldersmatchede C57BL6/N-mus blev sammenlignet for relativ commensal mangfoldighed. Øjnene blev podet og komensale organismer identificeret. Den mest fremherskende art var Streptococcus acidominimus, som var betydeligt mere rigelig hos hanmus end hunmus (2-vejs ANOVA, p<0.0001). Der blev identificeret 5 forskellige CNS-isolater, Aerococcus viridaner og E.coli. Mens nogle af CNS-isolaterne ikke var til stede i alle mus, blev Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, CNS isolere 1 og E. coli fundet i alle mus med forskellige overfloder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af den okulære overflades paucibakterielle tilstand har mange laboratorier haft svært ved at isolere okulære commensals7,20, hvilket resulterer i lavt antal prøver med vækst, lav overflod og lav mangfoldighed8. Denne metode forbedrer standardkulturpraksissenbetydeligt 4,21 ved at tillægge et berigelsestrin samt en nydesignet øjenpind og identifikation af MALDI-TOF MS. Berigelsestrinnet adresserer lav genindvindingsevne ved at forstærke bakteriebelastningen. Den betydelige stigning i genindvindes bakterier fra mindre end 100 CFUs til den relative overflod af 2.500 CFUs per øjenpind for vilde type mandlige mus tyder på, at inkubation i næringsrige medier puster nyt liv i levedygtige, men ikke-dyrkelige bakterier22,23, hvilket gør det muligt at inddrive sovende mikrober. Nylige kulturbaserede berigelsestrin er blevet indarbejdet i mikrobiota molekylær sekventeringsundersøgelser for at muliggøre forskelsbehandling mellem værts- og mikrobielle udtrykssignaturer24,25,26og for at forstærke sjældne slægter. Vores protokolberigelsestrin er det første, der anvendes på okulære mikrobiomundersøgelser og udnytter berigelse til at vælge levende mikrober, udvide antallet af genanvendelige knappe isolater og måske genoplive levedygtige, men ikke-dyrkelige commensals. Desuden vores i huset lavet øjenpind giver målrettet swabbing af bindehinden, reducere forurening fra omkringliggende hud / pels på grund af sin lille størrelse og tynde spidse tilspidset form. Valget af podning belægning tykkelse og materiale er vigtigt21. Dette laboratorium lavet øjenpind er belagt med et tyndt lag af ikke-toksisk bomuld pladevat, som forhindrer podet commensal fastklemning i vatpinden materiale, samt at foretrække frem for calcium alginat øjenprøver, som kan cytoksiske27. Langsgående tests viser, at vores metode kan reproduceres; med de dominerende bakterier genvundet fra øjenprøver, herunder Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS), og Corynebacterium spp. Disse resultater er i enige med offentliggjorte resultater for de dominerende fakultets anaerob okulære slægter7,9,20 opdaget via kulturbaserede eller billeddannelsesbaserede metoder. Denne metode har fundet et bredere spektrum af isolater i bindehinden, herunder Escherichia coli og Pseudomonas spp. Desuden muliggør MALDI-TOF-medlemsstaternes identifikation en bedre forskelsbehandling af slægter og arter, f.eks. 19,28.
Tre trin er afgørende for at maksimere resultatet: øjenprøve fremstilling, øjensvabe teknik og unikke isolere udvælgelse fra øjet podning plade. Som nævnt ovenfor er et meget tyndt fladt lag bomuld vigtigt for den første indfangning af commensals fra okulær overflade såvel som for deres efterfølgende frigivelse i berigelsesmediet. Tykke eller klumpede svaberprøver kan føre til udvælgelse af forurenende stoffer samt fastholde isolater inden for vatpinden. For det andet er kontinuerlig fordybning af øjeæblet, mens swabbing er nødvendig for at minimere forurening fra de omkringliggende overflader. Den ideelle swabbing teknik indebærer normal (90 grader) indsættelse af vatpinden i mediale ringere conjunctival fornix og stabil swabbing tryk kombineret med langsom kontinuerlig bevægelse. Endelig skal øjenprøvepladen overvåges dagligt for at vælge for nyligt fremkomne isolater eller dem, der vokser i et andet tempo for fuldt ud at fange det repræsentative mikrobiom.
Der er et par protokolbegrænsninger, der kan løses med en klar forståelse af resultaterne eller ændring af protokollen. Resultaterne er et mål for relativt levedygtige commensal overflod, og ikke faktiske bindende bakterielle byrde, med det formål at definere den okulære commensal samfund. Den relative overflod og mangfoldighed er blevet brugt i vores undersøgelser til komparative formål i bakteriel keratitis, samt til at undersøge den medfødte immunrespons i knock-out og vilde type mus12. Desuden afhænger MALDI-TOF MS's identifikation af en omfattende database28, der leverer et resultat af "intet ID" for ukendte isolerende spektreprofiler, hvilket understreger vigtigheden af at bruge en aktuel database. Endelig registrerer denne protokol kun aerobe og fakultets anaerob bakterier, men dens rammer kan tilpasses og kan bygges på for at hjælpe med at definere det okulære mikrobielle rum ved ændring af berigelsesmedier, pladevækstbetingelser og udvælgelsesmedium. Ved at ændre masterpladen og tilsætningsvækstbetingelserne til anaerobkan der påvises en anden almindeligt isoleret okulær commensal, Propionibacterium spp. eller andre anaerober; selv om vi i vores hænder så næsten ingen anaerob vækst.
Måske kan denne ramme bruges sammen med dybe DNA-sekventeringsteknikker. En væsentlig forhindring i mikrobeidentifikation via DNA-sekventering er den manglende evne til at vurderelevedygtigheden 10. Denne protokol kan give en ortogonal metode ved at ændre berigelse medier og plating betingelser for at matche en kandidat isolere's (identificeret ved DNA sekventering) foretrukne vækstkriterier. Dette kan resultere i en værdifuld kulturbaseret tilgang til at fange commensals fra levedygtige, men uforgærdelige bakterier eller nuværende, men lav overflod arter.
Definitionen af det levedygtige okulære samfund er afgørende for at undersøge den okulære kompensal udtryksprofil. Bred forskning tyder på, at kortkædede fedtsyrer og mikrobielle produkter modulerer okulær immunrespons3,29,30,31,32,33, og at deres handling sker lokalt. Dette tyder på, at ikke alene er distal produktion, men lokal produktion af disse faktorer er vigtig. Også, sygdomstilstande som tør øjensygdom og diabetes ændre okulær overflade mikrobiom4,6,33,34. Dette understreger behovet for en metode, der bygger bro mellem DNA-baseret sekventering samt kulturbaserede tilgange, så det levedygtige okulære mikrobiom i sundhed og sygdom kan defineres bedre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra P30 DK034854 støttede VY, LB og undersøgelser i Massachusetts Host-Microbiome Center og finansiering fra NIH/NEI R01 EY022054 støttede MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
