Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra

Summary

Qui presentiamo il protocollo per la coltura tissutale 3D dell'asse del corpo posteriore zebrafish, consentendo lo studio vivo della segmentazione dei vertebrati. Questo modello di espianto fornisce il controllo sull'allungamento dell'asse, l'alterazione delle sorgenti di morfogeno e l'imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare.

Abstract

Gli embrioni di vertebrati modellano il loro asse corporeo principale come somiti ripetitivi, precursori di vertebre, muscoli e pelle. I somiti si segmentano progressivamente dal mesoderma presomitico (PSM) mentre l'estremità posteriore dell'embrione si allunga posteriormente. I somiti si formano con periodicità regolare e dimensioni di scala. Zebrafish è un organismo modello popolare in quanto è geneticamente trattabile e ha embrioni trasparenti che consentono l'imaging dal vivo. Tuttavia, durante la somitogenesi, gli embrioni di pesce sono avvolti attorno a un grande tuorlo rotondo. Questa geometria limita l'imaging vivo del tessuto PSM negli embrioni di zebrafish, in particolare a risoluzioni più elevate che richiedono una distanza di lavoro oggettiva ravvicinata. Qui presentiamo un metodo di coltura tissutale 3D appiattito per l'imaging vivo delle espianto della coda di zebrafish. Gli espianto della coda imitano embrioni intatti mostrando un rallentamento proporzionale dell'allungamento dell'asse e accorciamento delle lunghezze del somite rostrocaudale. Siamo inoltre in grado di bloccare la velocità di allungamento dell'asse attraverso la coltura di espianto. Questo, per la prima volta, ci permette di districare l'ingresso chimico dei gradienti di segnalazione dall'ingresso meccanicistico dell'allungamento assiale. Negli studi futuri, questo metodo può essere combinato con una configurazione microfluidico per consentire perturbazioni farmaceutiche controllate nel tempo o screening della segmentazione dei vertebrati senza problemi di penetrazione del farmaco.

Introduction

La segmentazione metamerica degli organismi è ampiamente utilizzata in natura. Le strutture ripetute sono essenziali per la funzionalità di organi laterale come vertebre, muscoli, nervi, vasi, arti o foglie in un piano corporeo¹. Come risultato di tali vincoli fisiologici e geometrici della simmetria assiale, la maggior parte della phyla della Bilateria- come anellidi, artropodi e cordati-mostrano segmentazione dei loro tessuti embrionali (ad esempio, ectoderma, mesoderma) antero-posteriormente.

Gli embrioni di vertebrati segmentano sequenzialmente il loro mesoderma parassiale lungo l'asse corporeo principale in somiti con intervalli specifici per specie, conteggi e distribuzioni delle dimensioni. Nonostante tale robustezza tra i singoli embrioni all'interno di una specie, la segmentazione del somite è versatile tra le specie di vertebrati. La segmentazione avviene in un vasto regime di intervalli di tempo (da 25 minuti in zebrafish a 5 h nell'uomo), dimensioni (da ~ 20 μm in somiti di coda di zebrafish a ~ 200 μm in somiti tronco di topi) e conti (da 32 in zebrafish a ~ 300 nei serpenti di mais)². Ancora più interessante, gli embrioni di pesce possono svilupparsi in una vasta gamma di temperature (da ~ 20,5 ° C fino a 34 ° C per il pesce zebra) mantenendo intatti i loro somiti con una corretta distribuzione delle dimensioni compensando sia gli intervalli di segmentazione che le velocità di allungamento assiale. Al di là di tali caratteristiche interessanti, zebrafish rimane un organismo modello utile per studiare la segmentazione nei vertebrati a causa dello sviluppo esterno, sincrono e trasparente di una plenitudine di embrioni fratelli e dei loro strumenti genetici accessibili. Negativamente dal punto di vista della microscopia, gli embrioni di teleost si sviluppano su un ingombrante tuorlo sferico, allungando e arrotondando il tessuto gastrulante intorno ad esso (Figura 1A). In questo articolo, presentiamo una coltura appiattita di espianto di tessuti 3D per le code di zebrafish. Questo sistema di espianto aggira i vincoli sferici della massa del tuorlo, consentendo l'accesso all'imaging vivo ad alta risoluzione di embrioni di pesce per il modello somite.

Figura 1: Sistema di espianto a camera di scorrimento per embrioni zebrafish. (A) Gli embrioni di zebrafish hanno vantaggi per l'imaging dal vivo, come la trasparenza del tessuto embrionale gastrulante (blu), ma il tessuto si forma attorno a una massa di tuorlo sferico ingombrante (giallo) che impedisce immagini quasi oggettive e ad alta risoluzione in embrioni intatti. Le esplant di coda possono essere sezionate a partire da un coltello microchirurgico (marrone) tagliato dal tessuto anteriore dei somiti (rosso) e continuando al confine con il tuorlo posteriormente. (B) Le espianto di coda sezionate possono essere posizionate su un dorsoventrally coverslip (azzurro); mantenendo il tessuto neurale (grigio chiaro) in cima e notocordo (grigio scuro) nella parte inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Questo protocollo prevede l'uso di embrioni vertebrati vivi di età inferiore a 1 giorno dopo la fecondazione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida etiche del Cincinnati Children's Hospital Medical Center; protocolli animali sono stati rivisti e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Protocollo # 2017-0048).

1. Raccolta embrionale

1. Imposta coppie di zebrafish nei serbatoi di attraversamento la notte prima del giorno della raccolta degli embrioni. Per un controllo preciso della stadiazione dello sviluppo degli embrioni, utilizzare barriere tra coppie di accoppiamento.
2. Alza le barriere prima del tempo di deposizione delle uova preferito e raccogli le uova entro 15 minuti in una piastra di Petri da 100 mm.
   1. Pulire i detriti dalla piastra di Petri. Se più di 50 embrioni vengono raccolti da una singola frizione, dividere la frizione in più piastre di Petri di conseguenza.
3. Incubare gli embrioni nell'acqua del sistema ittico a 28 °C fino a raggiungere il 50% dello stadio di epiboly (5 ore dopo la fecondazione). Un mezzo standardizzato di crescita dell'embrione come E3 può anche essere utilizzato al posto dell'acqua del sistema dell'acquario fino al passaggio 3.2.
   1. Rimuovere le uova non fecondate sotto uno stereoscopio e spostare gli embrioni in un incubatore di 23,5 °C durante la notte (O /N). Gli embrioni dovrebbero essere in fase di 8-10 somiti la mattina successiva al giorno della raccolta.

2. Preparazione dell'utensile

1. Sterilizzare la lama del coltello in microchirurgia, le punte dell'ago (utilizzate per la dissezione del tessuto) e la pipetta Pasteur in vetro immergendosi in etanolo al 100% (EtOH) e vetri antincendio.
2. Utilizzare due strati di nastro trasparente (~100-120 μm di spessore) su vetrini da microscopio da 25 mm x 75 mm. Tagliare ~18 mm x 18 mm quadrati al centro del rivestimento del nastro di ogni diapositiva con bisturi.
   1. Pulire le camere scorrevoli preparate con 70% EtOH. Questi pozzi recheranno ~40 μL di mezzo.

3. Preparazione del campione

1. Dechorionate embrioni usando la punta di due siringhe ad ago sotto uno stereoscopio. Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri separata con acqua del sistema ittico per risciacquare.
2. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro smaltato dal fuoco, trasferire embrioni in una piastra di Petri di 6 cm contenente mezzo di dissezione (mezzo di coltura cellulare Leibovitz-15 con L-glutammina senza fenolo rosso, 0,8 mM CaCl₂ e 1× soluzione antibiotico-antimicotica).
   NOTA: Continuare a utilizzare una pipetta di vetro sterilizzata per tutti i trasferimenti successivi a questo passaggio.
   1. Utilizzare una piastra di Petri in vetro per la procedura di espianto per evitare trucioli di polistirolo durante la dissezione.
3. Mettere 50 μL di mezzo di crescita tissutale (mezzo di dissezione e 10% FBS) nella camera di scorrimento.
4. Stabilizzare un embrione per la dissezione sotto lo stereoscopio con una punta dell'ago all'intersezione tra vitellino vicino al cervello posteriore.
5. Mantenendo stabile il tessuto embrionale con un ago, utilizzare il coltello microchirurgico con la lama tenuta a 45° per tagliare il tessuto anteriore al cervello posteriore e staccare il tuorlo dal tessuto embrionale partendo dalla parte anteriore e spostandosi verso il bocciolo di coda(Figura 1A).
   NOTA: Fare attenzione a non perdere il tessuto cutaneo durante la pulizia del tuorlo. La pelle si stacca facilmente come tessuto elastico a strato singolo che si affianca intorno all'embrione durante la dissezione, quindi è facile da riconoscere.
6. Una volta che il tuorlo è completamente rimosso dal corpo embrionale, tagliare il tessuto cutaneo di fianco dal coccinella. Mantenendo intatti gli ultimi 3-4 somiti formati, tagliare il tessuto più anteriore (espianto a tutto l'asse).
   1. Il tuorlo dovrebbe staccarsi principalmente intatto da questa procedura. In caso di tuorlo rotto, granuli significativi di tuorlo possono rimanere attaccati alla superficie ventrale del tessuto. In tal caso, utilizzare uno strumento per le ciglia per pulire delicatamente i granuli di tuorlo rimanenti.
      NOTA: Uno squilibrio dei tessuti cutanei sui lati laterali di un'espianto non consentirebbe al tessuto di mantenere una direzione di crescita dritta. L'espianto invece si piegherà verso il lato di una pelle più tesa. Questo squilibrio può essere corretto sotto lo stereoscopio ruttando lo strato cutaneo con l'aiuto di coltello microchirurgico.
   2. Per le espianto senza pelle, premere su una punta dello strato cutaneo con ago e sbucciare il tessuto espulso con il coltello microchirurgico. Queste espianto non allineeranno il loro asse corporeo in coltura.
   3. Oltre agli espianto a tutto l'asse, è possibile fare espianto alternativo in questa fase. Ad esempio, sezionare somiti già segmentati utilizzando il coltello microchirurgico (espianto full-PSM) o sezionare il PSM nel suo mezzo anteroposterior (semi-PSM espianto). Si prega di consultare la sezione 5.1 per l'applicazione di tali espianto alternativi.
7. Trasferire immediatamente l'espianto sezionato su un coverslip da 22 mm x 22 mm su cui verrà eseguita l'imaging.
   1. Disporre l'explant piatto sull'asse dorsoventrale, il lato ventrale toccando il coverslip (Figura 1B). Rimuovere delicatamente il supporto in eccesso intorno all'espianto tissutale utilizzando una pipetta filtrata a punta da 20 μL.
      NOTA: Il trasferimento ritardato delle espianto sezionato al coverslip provoca deformazioni del tessuto, in quanto è alleviato dai vincoli geometrici del tuorlo.
8. Capovolgere rapidamente e con attenzione il coverslip con l'espianto sulla camera di scorrimento riempita di mezzo di crescita.
   1. Per evitare la formazione di bolle, posizionare un lato del coperchio quadrato sulla camera a nastro e rilasciare delicatamente l'altro lato. Fare attenzione a non spostare/deformare l'espianto in questo passaggio.
   2. Rimuovere delicatamente il sanguinamento del supporto in eccesso dalla camera premendo la camera di scorrimento su un tessuto di laboratorio. Il coverslip si siederà stabilmente sulla camera di scorrimento per l'imaging dal vivo, a causa della tensione superficiale del mezzo liquido senza alcuna sigillatura.
   3. Per la ristrutturazione a lungo termine (>6 ore), utilizzare una camera più grande. In questi casi è possibile utilizzare copripazzo rettangolari da 22 mm x 50 mm insieme a due corsie parallele di strati di nastro sui vetrini. Uno spazio largo ~ 1 mm può essere lasciato tra due corsie a nastro per facilitare l'accesso all'aria nel mezzo di crescita.
9. Ripetere i passaggi 3.3-3.8 per preparare più espianto. Le espianto preparate allineeranno il loro asse del corpo A-P con una velocità media di ~ 30 μm / h e segmenteranno i loro somiti con intervalli ~ 40 minuti a 25 °C(Figura 2A, Video 1).
   1. Per le espianto non allunganti, applicare una leggera pressione sui lati dello scivolo tenendo il campione nel passaggio 3.8.2 mentre si succhia il supporto in eccesso su un tessuto di laboratorio. In alternativa, gli espianto possono essere coltivati in camere scorrevoli a strato di nastro singolo. Inoltre, l'attivazione chimica della superficie della camera scorrevole con collagene di tipo I comporterà espianto non allungante(Figura 2B,Video 2).
      1. Eseguire il rivestimento della camera con collagene di tipo I in anticipo coprendo completamente le camere scorrevoli con 15-20 mL di soluzione di collagene prediluto a temperatura ambiente per 1 h. Utilizzare una cappa di flusso laminare per questo protocollo per mantenere la sterilità. Risciacquare accuratamente le camere con mezzo di dissezione alla fine.
   2. Per gli embrioni di età superiore a 15 stadio di somite, montare lateralmente il tessuto di espianto della coda anziché un supporto piatto (dorsoventral) (Video 3). Per prevenire contrazioni muscolari, includere la soluzione di tricaina allo 0,004% nei mezzi di coltura come agente anestetico³.

4. Acquisizione di immagini in diretta

1. Campioni di immagini su un campo di dissezione per l'imaging luminoso trasmesso su vasta scala di dimensioni e periodi di segmentazione somite, o con microscopia strutturata illuminazione/ confocale / foglio luminoso utilizzando linee di pesce reporter transgeniche.
2. Equilibrare la temperatura degli espianto tissutali con la temperatura ambiente di imaging per almeno 15 minuti.
   1. Per un controllo della temperatura più preciso, utilizzare un sistema di controllo della temperatura commerciale montato su un microscopio invertito.
3. Impostare gli intervalli del fotogramma di acquisizione dell'immagine su 2 - 10 minuti a seconda del processo biologico di interesse.
   NOTA: La segmentazione del somite zebrafish è un processo veloce, che va da 20 a 55 minuti per temperature vitali da 30 °C a 21,5 °C in embrioni interi. Le espianto si allineeranno e segmenteranno ~ 30% più lentamente rispetto agli embrioni interi.
   1. Prestare attenzione a lasciare abbastanza ritardo tra i set di acquisizioni di canali per evitare possibili fototossicità per vivere il tessuto. Non esporre il tessuto al fascio di eccitazione per più della metà della durata dell'imaging e abbassare il più possibile l'intensità del fascio.
      NOTA: L'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è generalmente la principale causa di fototossicità nei campioni vivi⁴. L'acido ascorbico come spazzino ROS può essere integrato al mezzo di crescita a concentrazione di 4 mM per tamponare l'attività del ROS e alleviare la fototossicità. Gli effetti avversi della fototossicità potrebbero essere difficili da notare durante l'imaging dal vivo. Le esplant della coda sono vantaggiose in questo aspetto poiché alcuni marcatori visivi di fototossicità come l'arresto mitotico, lo sviluppo dei tessuti ostacolati (cioè la formazione di somiti, l'allungamento della coda) e il tessuto disgregante sono più facili da notare. Si prega di fare riferimento al riferimento^{4 fornito} per una discussione dettagliata.
4. Usa embrioni iniettati di RNA a stadio singolo per acquisire immagini 4D destinate a essere segmentate e analizzate a livello di risoluzione cellulare.
   1. Utilizzare 300 pg di RNA da membrane trascritte in vitro e plasmidi marcatori reporter fluorescenti nucleari come pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) o pCS-memb-mCherry (plasma addgene #53750) in combinazione con pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) o pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) in iniezioni. Per un filmato di esempio con membrana cellulare e marcatori di nuclei, vedere Video 4.
      NOTA: La dimensione media cellulare del tessuto PSM è di circa ~ 5 μm di diametro, di cui i nuclei comprendono ~ 3 - 4 μm. Una dimensione in pixel di ~0,5 μm e una sezione z di ~1 μm devono essere registrate per una corretta segmentazione cellulare.

5. Immunostaining degli espianto della coda

NOTA: I tessuti coltivati dopo vari scenari di dissezione (allungamento, non allungamento, germogli di coda sezionati, metà PSM ecc.) come espianto di coda a parete^{piatta 5 possono} essere recuperati dalle camere di scorrimento per ulteriori quantificazioni immunosottenibili delle proteine di interesse. Qui, presentiamo il protocollo utilizzato per la colorazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare di-fosforilato (ppERK) degli espianto come lettura del gradiente di segnalazione FGF.

1. Dopo la formazione di somiti fino allo stadio desiderato, spostare cautamente il coverslip a metà strada verso l'angolo della camera di scorrimento senza sollevare.
2. Con l'aiuto di ~ 100 μL di mezzo di dissezione supplementare in una pipetta Pasteur in vetro, recuperare le espianto dallo scivolo e trasferirli in una piastra di coltura cellulare da 64 po '.
   NOTA: A partire da questo passaggio, tutte le sostituzioni della soluzione possono essere eseguite sotto un mirino di dissezione con una pipetta di vetro separata per campioni fissi. Ciò garantirà di non perdere tessuti di espianto nei pozzi o trasferirli nel mezzo.
3. Dopo aver trasferito tutte le espianto, succhiare il mezzo eccessivo dai pozzi uno per uno e mettere 100 μL di paraformaldeide al 4% in PBS (PFA) in ogni pozzo.
   ATTENZIONE: La PFA è una soluzione tossica con effetti cancerogeni. Durante la manipolazione devono essere utilizzati DPI adeguati.
4. Fissare gli espianto in una piastra da 64 po po' a temperatura ambiente per 1 h su uno shaker.
   1. Le esplant tissutali sono più sensibili alle deformazioni rispetto agli embrioni interi. Regolare la velocità dello shaker di conseguenza.
5. Lavare il fissatore con 150 μL di PBS-Tw (0,1% Tween20 in PBS) tre volte. Raccogliere il primo lavaggio in uno specifico contenitore "PFA Waste".
6. Disidratare le espianto in 4×5 minuti sostituendo ~40 μL di soluzione ogni volta con il 100% di metanolo (MeOH).
   ATTENZIONE: Il MeOH è una sostanza chimica tossica volatile e infiammabile. Lavorare in uno spazio ben ventilato e utilizzare dPI adeguati per la movimentazione.
7. Come ultimo passaggio di disidratazione, rimuovere tutta la soluzione dai pozzi e sostituirla con 100 μL di MeOH. Incubare a -20 °C per 15 min.
   NOTA: Utilizzare uno specifico contenitore "MeOH Waste" per raccogliere le soluzioni fino al passaggio 5.11.
8. Aggiungere 50 μL di MeOH e agitare a temperatura ambiente per 5 minuti.
9. Reidratare gli espianto in passaggi di 4×5 minuti sostituendo ~40 μL di soluzione ogni volta con PBS-T (0,1% Triton-X 100 in PBS). Utilizzare uno specifico contenitore "MeOH Waste" per raccogliere le soluzioni.
10. Come ultimo passaggio di reidratazione, rimuovere tutta la soluzione dai pozzi e sostituirla con 100 μL di PBS-T.
11. Per la permeabilità tissutale trattare le espianto con 1,5% Triton-X 100 in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente sullo shaker.
12. Lavare i campioni con MAB-D-T (0,1% tritone-X 100 detergente e 1% di solfossido di dimetile (DMSO) in 150 mM NaCl 100 mM tampone di acido maleico pH 7,5) 3×5 min.
    ATTENZIONE: Il DMSO è infiammabile e un mutageno tossico. Durante la manipolazione devono essere utilizzati DPI adeguati.
13. Incubare le espianto in soluzione di blocco del siero 100 μL/pozzo (siero bovino fetale al 2% in MAB-D-T) per 2 ore a temperatura ambiente.
14. Sostituire tutta la soluzione di blocco con soluzione anticorpale primaria da 50-100 μL/pozzo (diluizione 1:1000 di anticorpo monoclonale del topo contro ppERK in blocco siero). Incubare campioni O/N (>16 h) a 4 °C sullo shaker.
15. Lavare la soluzione anticorpale primaria con MAB-D-T 5×5 min.
16. Incubare campioni in soluzione anticorpale secondaria (Alexa Fluor 597 capra anti-topo IgG2b (1:200) e Hoechst 33342 (1:5000) in MAB-D-T) O/N a 4 °C su uno shaker o per 3 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: A partire da questa fase, coprire la piastra da 64 pozzi con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione leggera di campioni trattati con anticorpi secondari.
    ATTENZIONE: Hoechst 33342 è un potenziale cancerogeno. Durante la manipolazione devono essere utilizzati DPI adeguati.
17. Lavare la soluzione anticorpale secondaria con PBS-Tw 3×5 min.
18. Fissare i campioni con PFA per 15 minuti a temperatura ambiente.
19. Lavare il fissatore con campioni di PBS-Tw ed equilibrare i campioni entro il 60% di glicerolo. Montare le espianto su vetrini al microscopio con smalto per unghie e glicerolo al 60% per l'imaging. Per i risultati rappresentativi dell'immunosottenzione si veda la figura 3.

Representative Results

Questo protocollo consente una 155 atura geometrica piatta delle espianto di coda di zebrafish vive. La coltura tissutale presenta tre principali vantaggi rispetto agli embrioni interi: 1) controllo della velocità di allungamento dell'asse, 2) controllo su varie fonti di segnalazione (morfogeno) mediante semplice dissezione e 3) quasi obiettivo, alto ingrandimento e imaging vivo NA elevato.

Le camere di scorrimento chimicamente non trattate consentono all'espianto della coda di allungare il suo asse principale (Figura 2A) dall'ectoderma cutaneo che avvolge il tessuto sottostante. Quando abbiamo coltivato le espianto sulle camere scorrevoli attivate chimicamente (con collagene di tipo I), l'ectoderma cutaneo si è allungato e ha aderito alla camera di scorrimento, che ha fermato l'allungamento dell'asse dell'espianto. Nonostante ciò, i somiti hanno continuato a segmentare(Figura 2B,Film supplementari S1 e S2). Come descritto nel protocollo, l'allungamento dell'asse può anche essere interrotto direttamente applicando pressione fisica durante il processo di montaggio o montando espianto in una camera scorrevole più bassa. La quantificazione della velocità di allungamento dell'asse sotto tali restrizioni fisiche può essere trovata nel nostro lavoro precedentemente^{pubblicato 5}.

Figura 2: Controllo dell'allungamento dell'asse nelle esplant. (A) Le espianto coltivate su una camera di scorrimento regolare (a sinistra) si allungano assialmente mentre continuano a segmentare nuovi meliti. Le istantanee della luce trasmessa (sinistra, scala di grigi) e del marcatore nucleare transgenico (destra, rosso) sono mostrate per 2 ore di durata della coltura. (B) Attivando chimicamente la camera di scorrimento con collagene di tipo I prima di coltivare si blocca l'allungamento assiale ma non influisce sulla velocità di segmentazione del somite. La barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In secondo luogo, gli espianto possono essere coltivati sezionando le fonti di morfogeni per identificare le informazioni istruttive che forniscono per i processi di sviluppo. Qui presentiamo tre immagini esemplari che mostrano l'effetto delle dissezioni sui livelli di segnalazione ppERK (Figura 3). Nel tessuto PSM viene stabilito un gradiente di segnalazione FGF dal posteriore al anteriore (letto dai livelli ppERK). Solo il tessuto del bocciolo di coda trascrive attivamente fgf8⁶ e forma una fonte per questo gradiente con l'aiuto della diffusività del ligando FGF⁵. Gli espianto della coda che mancano della porzione di bocciolo di coda del tessuto dopo la dissezione (Figura 3C) si trae da un gradiente ppERK più breve (Figura 3B,3D). In modo opposto, un gradiente di acido retinoico è stabilito dalla parte anteriore a quella posteriore sia nel PSM che nel tessuto neurale dorsale. I somiti formati di recente e l'estremità anteriore del PSM esprimono enzimi di sintesi dell'acido retinoico (RA) e fungono da fonte per il gradiente RA⁷. Quando abbiamo sezionato il tessuto PSM anteriore negli espianto (Figura 3E), abbiamo ancora osservato un'estensione normale del gradiente ppERK (Figura 3F) come visualizzato dall'immunostaining. Un utilizzo dettagliato di questa forza del metodo di espianto può essere trovato nel nostro recente studio⁵.

In terzo luogo, le espianto di zebrafish montate a piatti sono ottimali per l'osservazione dal vivo ad alta risoluzione della morfogenesi tissutale. Qui presentiamo un film (Video 4) preso con un espianto transgenico che esprime EGFP come marcatore di membrana cellulare (falso colorato di rosso) e macchiato con un marcatore di nuclei a globuli rossi lontani (falso colorato con ciano). Senza ulteriore quantificazione, molti processi come l'ingressione di progenitori neuromesodermici nel bocciolo della coda, la maggiore motilità delle cellule PSM posteriori rispetto alla parte anteriore e l'epitelializzazione delle cellule limite somitiche possono essere osservati direttamente nel film.

Figura 3: Immunostaining of Tail Explants. (A) Full PSM espianta con gradienti di segnalazione intatti lungo il PSM come controllo. (B) Il gradiente ppERK regolare si osserva in espianto PSM completo con immunosottenzione. (C) Le espianto sezionate a boccioli di coda mancano di gran parte della sorgente di segnalazione FGF posteriore. (D) Un segnale ppERK molto limitato a posteriori si osserva nelle espianto sezionate del bocciolo di coda. (E) Il PSM anteriore e il tessuto somitico possono essere sezionati per rimuovere le sorgenti per possibili fattori di segnalazione PSM anteriori come la segnalazione RA. (F) La rimozione anteriore del PSM non modifica l'estensione normale del gradiente ppERK. I tessuti sono stati fissati 2 ore dopo l'espianto per il protocollo di immunosocienza. La barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato 1: Allungamento asse e Segmentazione somite in Espianto 3D. Le immagini time lapse a luce trasmessa widefield (in alto) e nucleare localizzate GFP (rosso falso colorato) (in basso) di un normale espianto a camera scorrevole montata piatta. Il tessuto della coda è stato espulso dall'embrione in 13 fasi di somite. L'acquisizione dell'immagine viene eseguita su un microscopio invertito con intervalli di fotogrammi di 3 minuti. La barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo filmato.

Filmato 2: Allungamento dell'asse in stallo sulla camera scorrevole attivata chimicamente. Widefield ha trasmesso immagini di decappo di tempo di epifluorescenza (in basso) e di epifluorescenza localizzata nucleare (rosso falso colorato) di un'espianto piatto. Un'embriopianta a stadio di 11 somiti è stata montata su una camera scorrevole rivestita con soluzione di collagene della coda di ratto per 30 minuti prima del montaggio. L'acquisizione dell'immagine viene eseguita su un microscopio invertito con intervalli di fotogrammi di 3 minuti. La barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo filmato.

Filmato 3: Montaggio laterale di embriomi in fase avanzata estruse. La luce trasmessa widefield (a sinistra) e la GFP localizzata nucleare (rosso falso colorato) epifluorescenza (destra) time lapse immagini di un normale explant montato lateralmente a camera di scorrimento. Il tessuto della coda è stato espulso dall'embrione in fase di 15 somiti e la soluzione di tricaina è stata utilizzata come anestetica. L'acquisizione dell'immagine viene eseguita su un microscopio invertito con intervalli di fotogrammi di 3 minuti. La barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo filmato.

Filmato 4: Imaging a risoluzione a cella singola delle espianto della coda. Imaging confocale time-lapse di un espianto che esprime EGFP come marcatore di membrana (falso rosso colorato) e rosso lontano macchiato per i nuclei in diretta (ciano falso colorato). La proiezione di intensità media da 5 strati z (10 μm) viene visualizzata nel filmato per più di 1 ora. L'acquisizione dell'immagine viene eseguita su un microscopio confocale invertito rilevatore GaAsP con un obiettivo 40× apocromatico λS DIC-water immersion 1.15 NA, con intervalli di fotogrammi di 4 minuti. La barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo filmato.

Discussion

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di una tecnica di espianto di coltura tissutale che abbiamo sviluppato e^{utilizzato di recente 5} per gli embrioni di zebrafish. La nostra tecnica si basa sui precedenti metodi di espianto negli^{organismi modello chick 8} e zebrafish^9,10,11. Le esplant di coda preparate con questo protocollo possono sopravvivere fino a >12 ore in una semplice camera scorrevole, continuando ad allungare il suo asse corporeo principale e segmentando i somiti, fino alla fine della somitogenesi.

Si dovrebbe fare attenzione a mantenere sano il tessuto esplantante e allungarsi con successo per lunghi durate. In primo luogo, l'espianto tissutale deve essere sezionato senza danneggiare l'intattezza dei tessuti posteriori. Abbiamo osservato che le cellule della pelle stanno fornendo una busta per le cellule progenitrici neuromesodermiche che si ingressino nella coccinella posteriore. Se la pelle delle espianto viene staccata da queste cellule altamente motili, lasciare il tessuto di cocciniglia e migrare posteriormente sopra il copriletto oltre i limiti del tessuto. In secondo luogo, la tensione mediolaterally squilibrata del tessuto cutaneo può causare un allungamento divergente dell'asse, che può piegare l'asse del PSM e del notocordo. Un taglio a fessura corta fatto alle cellule della pelle laterali su entrambi i lati dell'espianto aiuta ad alleviare tale preoccupazione. Oltre alle preoccupazioni rilevanti per la pelle, si dovrebbe prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità dei mezzi di crescita e degli strumenti di dissezione per colture di durata più lunga.

Con la cura adeguata, la cultura delle espianto riassume la crescita sana di embrioni interi. Abbiamo osservato contrazioni muscolari negli espianto a partire da 20 somiti stadio come in embrioni interi¹². Sebbene ci siamo concentrati sul tessuto PSM per lo studio della segmentazione del somite, anche i tessuti adiacenti come l'ectoderma cutaneo, la chiglia neurale (successiva asta neurale e tubo neurale), il mesoderma notocordo, intermedio e laterale rimangono intatti nelle condizioni di coltivazione descritte(Figura 1B). Ciò è particolarmente vantaggioso per i tessuti oscurati dal tuorlo che possono essere immagini in alta risoluzione in espianto montati ventralmente, come il notocordo, la vescicola di Kupffer e altri tessuti che si sviluppano nelle fasi di segmentazione¹². Va sottolineato che il sistema di espianto non cresce velocemente come interi embrioni e non segmenta i somiti allo stesso ritmo degli embrioni interi. Questa limitazione per il sistema di espianto può anche alterare la dinamica temporale di altri eventi non osservati qui.

Qui, abbiamo presentato risultati rappresentativi che evidenziano tre principali vantaggi del sistema di espianto della coda rispetto a interi esperimenti sugli embrioni. Di recente abbiamo utilizzato questo metodo per districare i ruoli istruttivi dell'allungamento dell'asse dai gradienti di morfogeno per la segmentazione somite⁵. I progressi tardivi nella microscopia a fogli di luce hanno reso possibile l'imaging vivo di embrioni^{interi 13} per diversi organismi modello. Ma la maggior parte di questi metodi manca ancora di una corretta risoluzione subcellulare e sono a malapena accessibili alla più ampia comunità di ricerca. Il modello di espianto della coda qui descritto rende accessibile l'imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare con semplici microscopi invertiti o confocali. Oltre ai vantaggi metodologici, tale imaging dal vivo può fornire approfondimenti sulla segmentazione dell'asse del corpo dei vertebrati posteriori. Mantenendo il protocollo il più diretto e accessibile possibile, il sistema di espianto può anche avvantaggiare il più ampio campo della biologia dello sviluppo del pesce zebra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous	Decon Labs	2701	for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder	Sigma-Aldrich	499609	for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel	Integra-Miltex	MIL4-411	for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	A3160601	additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red	GIBCO	21083-027	for tissue dissection media
Methanol	Sigma-Aldrich	179337	for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade	Surgical Specialties	72-2863	for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent	Invitrogen	R37106	(optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127	for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution	Sigma-Aldrich	122-20	(optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator	Tokai Hit	tokai-hit-stxg	(optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4''	Scotch	S-9782	for preparing tape slide wells
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	for immunostaining
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)	Campbell et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	transgenic fish with cell membrane localized EGFP