Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。
Abstract
脊椎動物の胚は、脊椎、筋肉、および皮膚の前駆体である反復性スマイトとして主体軸をパターン化する。節内皮(PSM)から徐々に胚の尾端が後方に伸びる。スミテは、周期性とサイズの尺度を持つ形をする。ゼブラフィッシュは、遺伝的に難解であり、生きたイメージングを可能にする透明な胚を有するため、人気のあるモデル生物です。それにもかかわらず、ソミト生成の間に、魚の胚は大きな丸い黄身に包まれる。この幾何学は、特に近い目的の作業距離を必要とするより高い解像度で、ゼブラフィッシュ胚におけるPSM組織の生画像を制限する。ここでは、ゼブラフィッシュの尾葉の生画像化のための平坦化された3次元組織培養法を提示する。尾部外植は、軸伸びの比例減速とロストロコーダルスマイト長さの短縮を表示することによって、無傷の胚を模倣する。さらに、外植培養を通じて軸伸び速度を失速させることができる。これにより、信号勾配の化学入力を軸伸長の機械化入力から解き放つ。今後の研究では、この方法をマイクロ流体セットアップと組み合わせて、薬物侵入の懸念なしに、時間制御された医薬品摂動または脊椎動物セグメンテーションのスクリーニングを可能にすることができる。
Introduction
生物のメタメリックセグメンテーションは、自然界で広く使用されています。反復構造は、椎骨、筋肉、神経、血管、手足、またはボディプラン1の葉のような側面器官の機能性に不可欠である。このような軸対称性の生理学的および幾何学的制約の結果として、アネリド、節足動物、およびそれらの胚組織(例えば、外胚、メソダーム)の後方のセグメンテーションのようなビラテリアの大部分のフィラテリアの系統。
脊椎動物胚は、主体軸に沿ってパラキシャル中胚を、種固有の間隔、カウント、およびサイズ分布を持つスマイトに順番にセグメント化します。種内の個々の胚の間でこのような堅牢性にもかかわらず、脊椎動物種の間ではスマイトセグメンテーションが汎用性が高い。セグメンテーションは、時間間隔の広大な管理(ゼブラフィッシュの25分からヒトでは5時間まで)、サイズ(ゼブラフィッシュの尾節からマウスの幹スマイトで〜200μmまで)およびカウント(ゼブラフィッシュの32からトウモロコシヘビの〜300まで)2で起こる。さらに興味深いことに、魚の胚は、セグメンテーション間隔と軸伸び速度の両方を補うことによって、適切なサイズの分布でスマイトをそのまま維持しながら、幅広い温度(ゼブラフィッシュでは約20.5°Cから34°Cまで)で発達することができます。このような興味深い特徴を超えて、ゼブラフィッシュは、兄弟胚の豊かさの外部、同期的、透明な発達だけでなく、そのアクセス可能な遺伝的ツールのために脊椎動物のセグメンテーションを研究するのに有用なモデル生物として残ります。顕微鏡の観点から悪いことに、テレオスト胚はかさばる球状の黄身上で発達し、その周りの胃組織を伸ばし丸める(図1A)。本稿では、ゼブラフィッシュの尾に対する平坦化された3次元組織外植培養を紹介する。この外植体系は、黄身質量の球面制約を回避し、スマイトパターニングのための魚の胚の高解像度のライブイメージングへのアクセスを可能にする。
図1:ゼブラフィッシュ胚用スライドチャンバー外植システム(A)ゼブラフィッシュ胚は、胚組織(青)の透明化などの生画像化に有利であるが、組織は、無傷の胚におけるほぼ客観的で高解像度のイメージングを防ぐ、かさばる球状黄身塊(黄色)の周りに形成される。尾部の外植は、スマイトの組織前部(赤)から切り取られ、後部の黄身との境界で続くマイクロサージカルナイフ(茶色)で解剖することができる。(B)解剖された尾の外植はカバースリップ(水色)のドーソベントラリーに置くことができる。神経組織(明るい灰色)を上に、脊索(濃い灰色)を底に保ちます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
このプロトコルは、1日より若い脊椎動物胚の使用を含む受精後1日未満。すべての動物実験はシンシナティ小児病院医療センターの倫理ガイドラインの下で行われました。動物の議定書は、制度的動物の世話と使用委員会によって見直され、承認された(プロトコル#2017-0048)。
1. 胚コレクション
- 胚採取の日の前夜に交差タンクにゼブラフィッシュのペアを設定します。胚の発達を正確にステージング制御するには、交配ペア間の障壁を使用します。
- 好ましい産卵時間の前に障壁を上げ、100 mmペトリ皿で15分以内に卵を集めます。
- ペトリ皿からきれいな破片。1つのクラッチから50個以上の胚が集められた場合は、それに応じてクラッチを複数のペトリ皿に分割します。
- 28°Cの魚系水中の胚を、50%エピボリー段階(受精後5時間)に達するまでインキュベートする。E3のような標準化された胚成長培地は、ステップ3.2まで水槽系の水の代わりに使用することもできる。
- ステレオスコープの下で未受精卵を取り除き、胚を一晩23.5°Cのインキュベーターに移動させます(O/N)。胚は、コレクションの日の翌朝に8-10スマイトステージでなければなりません。
2. 工具の準備
- マイクロサージャスナイフブレード、針の先端(組織の解剖に使用)、ガラスパスツールピペットを100%エタノール(EtOH)に浸して消火し、ガラスガラスを消毒します。
- 25 mm x 75 mm の顕微鏡スライドに透明テープ (約 100~120 μm) の 2 層を使用します。メスで覆う各スライドのテープの中央に、〜18mm×18mmの正方形の井戸を切ります。
- 準備したスライドチャンバーを70%のEtOHで拭きます。これらのウェルは、培地の約40 μLを保持します。
3. サンプル準備
- ステレオスコープ下で2本の針注射器の先端を用いたデコリオネート胚。胚を魚系の水で別のペトリ皿に移して洗い流します。
- 火ガラス無菌ガラスパスツールピペットを使用して、解剖媒体を含む6cmペトリ皿(フェノールレッドなしL-グルタミンを含むライボヴィッツ-15細胞培養培地、0.8 mM CaCl2 および1×抗生物質抗ミコティック溶液)で胚を移す。
注:このステップに続くすべての転送のために滅菌ガラスピペットを使用し続けます。- 剥離時にポリスチレンチップを避けるために、外植手順のためにガラスペトリ皿を使用してください。
- スライドチャンバに組織成長培地(解剖媒体、および10%FBS)を50μL入れます。
- 後脳近くの黄身組織の交差部に針の先端を使用して、ステレオスコープ下での解剖のために胚を安定させる。
- 針で胚組織を安定に保ち、45°に保持されたブレードを持つマイクロサージカルナイフを使用して、後脳に前部組織を切断し、前部から始まり、尾芽に向かって動く胚組織から黄身を剥がす(図1A)。
注:黄身を洗浄する際に皮膚組織を失わないように注意してください。皮膚は、解剖中に胚の周りの横向きの単層弾性組織として容易に剥がれるので、認識しやすい。 - 卵黄が胚体から完全に取り除かれたら、尾芽から横腹の皮膚組織を切断する。最後に形成された3〜4のスマイトをそのままにして、より前組織を切り取る(全軸外植)。
- 黄身は、この手順から主にそのまま外れるはずです。黄身が破裂した場合、卵黄の重要な顆粒は組織の腹側表面に付着したままであり続けることができる。その場合は、まつげツールを使用して、残りの黄身顆粒を穏やかにきれいにしてください。
注:外植の側面の皮膚組織の不均衡は、組織がまっすぐな成長方向を維持することを許さない。代わりに外植は、より伸びた皮膚の側面に向かって曲がります。この不均衡は、マイクロ外科用ナイフの助けを借りて皮膚層を破裂させることによって、立体鏡下で修正することができる。 - 皮膚のない外植の場合は、針で皮膚層の先端を押し、ミクロ外科ナイフで組織の外植を剥がします。これらの外植は、文化の中で自分の体の軸を伸動しません。
- 全軸外植に加えて、このステップで代替外植を作ることができます。例えば、マイクロサージカルナイフ(完全PSM外植)を使用して既にセグメント化されたスマイトを解剖するか、PSMを半分後部(半PSM外植)に解剖します。このような代替外植の適用については、セクション5.1を参照してください。
- 黄身は、この手順から主にそのまま外れるはずです。黄身が破裂した場合、卵黄の重要な顆粒は組織の腹側表面に付着したままであり続けることができる。その場合は、まつげツールを使用して、残りの黄身顆粒を穏やかにきれいにしてください。
- すぐに、除剖した外植を、イメージングが行われる22mm x 22 mmのカバースリップに移します。
- 外植をドーソベントラ軸上に平らに配置し、腹側がカバースリップに触れる(図1B)。20 μLの濾過したチップピペットを使用して、ティッシュ外植の周囲の余分な培地を静かに取り除きます。
注:解剖された外植木のカバースリップへの遅延移動は、黄身の幾何学的拘束から解放されるので、組織の変形をもたらす。
- 外植をドーソベントラ軸上に平らに配置し、腹側がカバースリップに触れる(図1B)。20 μLの濾過したチップピペットを使用して、ティッシュ外植の周囲の余分な培地を静かに取り除きます。
- 成長培地充填スライドチャンバーの上に外植でカバースリップを迅速かつ慎重に反転させます。
- 泡の形成を防ぐために、正方形のカバースリップの側面をテープチャンバーに置き、反対側を穏やかに解放します。このステップでは、外植を移動/変形しないように注意してください。
- 実験室のティッシュのスライドの部屋を押すことによって部屋から余分な媒体の出血を穏やかに取除く。カバースリップは、シールを行わずに液体媒体の表面張力のために、スライドチャンバーに安定して座ってライブイメージングを行います。
- 長期培養(>6時間)には、より大きなチャンバーを使用してください。22 mm x 50 mm の長方形カバーリップと、スライド上のテープ層の 2 つの平行なレーンを、このような場合に利用できます。成長媒体への空気アクセスを容易にするために2つのテープレーンの間に~1mmの広いギャップを残すことができる。
- 手順 3.3 ~ 3.8 を繰り返して、さらに外植を準備します。準備された外植は、平均30μm/hの速度でA-P体軸を伸長し、25°Cで〜40分間隔でスマイトをセグメント化します(図2A、ビデオ1)。
- 伸びずら外植の場合は、ステップ3.8.2でサンプルを保持するスライドの側面に穏やかな圧力をかけ、余分な媒体を実験室組織に吸い出します。あるいは、外植は単一テープ層スライドチャンバで培養することができる。また、I型コラーゲンでスライドチャンバー表面を化学的に活性化すると、非伸びる外植が生じる(図2B、ビデオ2)。
- 1時間室温で15〜20mLの事前希釈コラーゲン溶液でスライドチャンバーを完全に覆い、事前にI型コラーゲンでチャンバーのコーティングを行います。このプロトコルには、無菌性を維持するために層流フードを使用してください。最後に解剖媒体と慎重にチャンバーをすすいします。
- 15以上のスマイト段階の胚の場合、平らな(ドーソベントラル)マウントの代わりに尾部外植組織を横に取り付ける(ビデオ3)。筋けいれんを防ぐために、麻酔薬として培養培地に0.004%トリカイン溶液を含める。
- 伸びずら外植の場合は、ステップ3.8.2でサンプルを保持するスライドの側面に穏やかな圧力をかけ、余分な媒体を実験室組織に吸い出します。あるいは、外植は単一テープ層スライドチャンバで培養することができる。また、I型コラーゲンでスライドチャンバー表面を化学的に活性化すると、非伸びる外植が生じる(図2B、ビデオ2)。
4. ライブ画像の取得
- 画像サンプルは、スマイトセグメンテーションサイズおよび期間の広視野透過光イメージングのための解剖スコープ上、またはトランスジェニックレポーター魚線を使用した構造化された照明/共焦点/光シート顕微鏡検査のいずれかである。
- 組織外植物の温度を、少なくとも15分間イメージング室温と平衡化する。
- より正確な温度制御のために、逆の顕微鏡に取付けられた商業温度制御システムを使用しなさい。
- 目的の生物学的プロセスに応じて、画像取得フレーム間隔を2〜10分に設定します。
注:ゼブラフィッシュのスマイトセグメンテーションは、胚全体で30°C〜21.5°Cの生存可能な温度のために20〜55分の間の速いプロセスです。外植は胚全体よりも約30%遅くなります。- 生きている組織に可能な光毒性を避けるためにチャネル獲得のセットの間に十分な遅延を残すために注意してください。画像化の持続時間の半分以上の励起ビームに組織を露出させ、ビーム強度をできるだけ下げないでください。
注:活性酸素種(ROS)の蓄積は、一般的に、ライブサンプル4における光毒性の主な原因である。ROSスカベンジャーとしてのアスコルビン酸は、ROS活性を緩衝し、光毒性を軽減するために4 mM濃度で増殖培地に添加することができる。光毒性の悪影響は、ライブイメージング中に気づくのが難しい場合があります。尾部外植は、有糸分裂、障害組織の発達(すなわち、スマイトの形成、尾伸長)、および崩壊組織のような光毒性のいくつかの視覚的マーカーが気づきやすいため、この局面で有利である。詳しい説明については、提供されているリファレンス4 を参照してください。
- 生きている組織に可能な光毒性を避けるためにチャネル獲得のセットの間に十分な遅延を残すために注意してください。画像化の持続時間の半分以上の励起ビームに組織を露出させ、ビーム強度をできるだけ下げないでください。
- 単一細胞ステージRNA注入胚を使用して、細胞分解能レベルでセグメント化および分析を意図した4D画像を取得する。
- インビトロ転写膜および核蛍光レポーターマーカープラスミド(pCS-膜-プラスミド#53749)またはpCS-memb-mCherry(Addgene)などの300pgのRNAを使用する プラスミド#53750)を注射においてpCS2+H2B-mTagBFP2(アプゲンプラスミド#99267)またはpCS2+H2B-TagRFP-T(アプジーンプラスミド#99271)と組み合わせた。細胞膜と核マーカーを含むサンプルムービーについては 、ビデオ4を参照してください。
注:PSM組織の平均細胞サイズは直径約5μmで、その核は~3~4μmを含みます。ピクセルサイズは~0.5 μm、z断面は1μm程度と、適切なセルセグメンテーションのために記録する必要があります。
- インビトロ転写膜および核蛍光レポーターマーカープラスミド(pCS-膜-プラスミド#53749)またはpCS-memb-mCherry(Addgene)などの300pgのRNAを使用する プラスミド#53750)を注射においてpCS2+H2B-mTagBFP2(アプゲンプラスミド#99267)またはpCS2+H2B-TagRFP-T(アプジーンプラスミド#99271)と組み合わせた。細胞膜と核マーカーを含むサンプルムービーについては 、ビデオ4を参照してください。
5. 尾部外植の免疫染色
注:平らな取り付けられた尾部外植体5 として様々な解剖シナリオ(伸び、非伸び、尾芽解剖、半分PSMなど)の後に成長した組織は、目的のタンパク質のさらなる免疫染色定量のためにスライドチャンバーから回収することができる。ここでは、FGFシグナル伝達勾配読み出しとして、外植植物のジリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ(ppERK)染色に用いられるプロトコルを提示する。
- 目的の段階までスマイトの形成後、慎重に持ち上げることなくスライドチャンバーの角にカバースリップを途中でシフトします。
- ガラスパスツールピペット中の補助解剖培地の約100 μLの助けを借りて、スライドから外植を回収し、64ウェル細胞培養プレートに移します。
注:このステップから、すべてのソリューションの交換は、固定サンプル用の別のガラスピペットを使用して、解剖スコープの下で行うことができます。これは、井戸内の外植組織を失ったり、その間にそれらを転送しないことを保証します。 - すべての外植を移した後、1つずつ井戸から過剰な媒体を吸い出し、PBS(PFA)の4%パラホルムアルデヒドの100 μLを各ウェルに入れます。
注意: PFAは発がん性の作用を有する有毒な溶液である。処理中は適切なPPEを使用する必要があります。 - シェーカーで室温で64ウェルプレートに外植物を1時間固定します。
- 組織外植物は、胚全体よりも変形に敏感である。それに応じてシェーカーの速度を調整します。
- 150 μLのPBS-Tw(PBSでは0.1%Tween20)で固定液を3回洗い流します。特定の「PFA廃棄物」容器に最初の洗浄を収集します。
- 毎回約40μLの溶液を100%メタノール(MeOH)に置き換えることで、4×5分のステップで外植を脱水します。
注意: MeOHは揮発性で可燃性の有毒な化学物質です。換気の良い空間で働き、取扱いのために適切なPPEを使用してください。 - 脱水の最後のステップとして、ウェルからすべての溶液を取り除き、MeOHの100 μLに置き換えます。-20°Cで15分間インキュベートします。
注: ステップ 5.11 までソリューションを収集するために特定の「MeOH 廃棄物」コンテナを使用してください。 - MeOHを50μL加え、室温で5分間振ります。
- 40 μL の溶液を PBS-T (PBS では 0.1% Triton-X 100) に交換することで、4×5 分のステップで水分補給を行います。特定の「MeOH廃棄物」コンテナを使用してソリューションを収集します。
- 水分補給の最後のステップとして、ウェルからすべての溶液を取り除き、PBS-Tの100 μLに置き換えます。
- 組織透過性のためにシェーカーの室温で20分間PBSで1.5%トリトン-X 100と外植を治療します。
- MAB-D-T(0.1%トリトン-X 100洗剤と1%ジメチルスルホキシド(DMSO)を150 mM NaCl 100 mMマレイン酸緩衝液pH7.5)で3×5分洗浄します。
注意: DMSOは可燃性であり、有毒な変異原である。処理中は適切なPPEを使用する必要があります。 - 100 μL/well 血清遮断液(MAB-D-Tの2%胎児ウシ血清)の外植を室温で2時間インキュベートします。
- すべてのブロッキング溶液を50-100 μL/well一次抗体溶液(血清ブロック中のppERKに対するモノクローナルマウス抗体の1:1000希釈)に置き換えてください。4 °CのO/N(>16h)のサンプルをシェーカーでインキュベートする。
- MAB-D-T 5×5分で一次抗体溶液を洗浄します。
- 二次抗体溶液中のインキュベートサンプル(Alexa Fluor 597ヤギ抗マウスIgG2b(1:200)およびHOEchst 33342(1:5000)を4°Cで4°Cで、または室温で3時間用。
注:このステップから始まり、二次抗体処理サンプルの光暴露を避けるためにアルミニウム箔で64ウェルプレートをカバーします。
注意: Hoechst 33342は潜在的な発がん性物質である。処理中は適切なPPEを使用する必要があります。 - 2次抗体溶液をPBS-Tw 3×5分で洗浄します。
- 室温で15分間PFAでサンプルを固定します。
- PBS-Twで固定剤を洗浄し、60%グリセロール内のサンプルを平衡化します。顕微鏡スライドに外植物をマニキュアで取り付け、イメージング用に60%グリセロールを取り付けます。代表的な免疫染色結果については 、図3を参照してください。
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Representative Results
このプロトコルは生きているゼブラフィッシュ尾の外植の平らな幾何学的培養を可能にする。組織培養は、全胚に対して3つの大きな利点を提示する:1)軸伸長速度の制御、2)単純解剖による様々なシグナル伝達(モルフォゲン)源の制御、および3)ほぼ客観的で高い拡大および高NAライブイメージング。
化学的に未処理のスライドチャンバーは、尾部外植が下の組織の周りに包む皮膚外皮によってその主軸(図2A)を伸長することを可能にする。化学活性スライドチャンバー(I型コラーゲン付き)の外植物を培養すると、皮膚外皮が伸びてスライドチャンバーに付着し、外植の軸伸びが止まりました。それにもかかわらず、スマイトはセグメント化を続けました(図2B、補助映画S1およびS2)。プロトコルに記載されているように、軸伸長は、取り付けプロセス中に物理的な圧力を加えたり、より浅いスライドチャンバに外植を取り付けることによって直接停止することもできる。このような身体拘束の下での軸伸長速度の定量化は、以前に出版された作品5に見られます。
図2:外植の軸伸びの制御.(A)通常のスライドチャンバー上で培養されたエクスプラント(左)は、新しいスマイトをセグメント化し続ける際に軸方向に伸びる。透過光(左、グレースケール)およびトランスジェニック核マーカー(右、赤)のスナップショットは、培養期間の2時間に対して示される。(B)培養前にI型コラーゲンでスライドチャンバーを化学的に活性化させることは、軸方向の伸びを失速させるが、スマイトセグメンテーション速度には影響しない。スケールバーは100 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
第二に、外植は、形態素の供給源を解剖して、発達過程に提供する有益な情報を特定することによって培養することができる。ここでは、ppERK シグナルレベルに対する解剖の影響を示す 3 つの例示的な画像を示します (図 3)。PSM組織では、FGFシグナル伝達勾配が後から前に確立される(ppERKレベルで読み出す)。尾芽組織だけがfgf86を積極的に転写し、FGFリガンド拡散率5の助けを借りてこの勾配の源を形成する。組織の尾芽部分が外皮(図3C)の後に欠けている尾部の外植は、短いppERK勾配をもたらす(図3B、3D)。反対に、PSMと後部の両方の神経組織において、前から後部にレチノイン酸勾配が確立される。最近形成されたスマイトおよびPSMの前端のレチノイン酸(RA)合成酵素を発現し、RA勾配7の源として作用する。外植体(図3E)の前PSM組織を解剖した場合、免疫染色によって視覚化されたppERK勾配(図3F)の正常な範囲を観察した。この外植法の強さの詳細な利用は、最近の研究5で見つけることができます。
第三に、平らに取り付けられたゼブラフィッシュの外植は、組織形態形成の高解像度の生きた観察に最適です。ここでは、EGFPを細胞膜マーカーとして発現するトランスジェニック外植(偽色は赤)で撮影し、遠赤色細胞核マーカー(シアンで偽色)で染色したムービー(ビデオ4)を紹介します。さらなる定量化を行わなければ、尾芽への神経間皮前駆物質の侵入、前部細胞に比べて後部PSM細胞の運動性が高く、また、スミチン境界細胞の上皮化などの多くのプロセスが直接映画で観察できる。
図3:尾部外植の免疫染色(A)PSMに沿った完全なシグナル伝達勾配をコントロールとして用いた完全なPSM外植体。(B)免疫染色を伴う完全なPSM外植において、通常のppERK勾配が観察される。(C)尾芽解剖外植は後FGFシグナリング源の大部分が欠けている。(D) 非常に後に制限されたppERKシグナルが、尾芽解剖外植で観察される。(E)前PSMおよび中等の組織を解剖して、RAシグナル伝達などの可能性のある前PSMシグナル伝達因子のソースを除去することができる。(F) 前 PSM 除去は ppERK グラデーションの正規の範囲を変更しません。組織は、免疫染色プロトコル用の外植後2時間固定した。スケールバーは100 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:3Dエクスプラントにおける軸伸長とスマイトセグメンテーション。 広視野透過光(上)および核局在GFP(偽色の赤)の蛍光(下)の経時経過画像は、通常のスライドチャンバーフラットマウント外植の画像です。尾部組織は、13のスマイト段階で胚から外植した。画像取得は、3分フレーム間隔で反転顕微鏡上で行われる。スケールバーは100μmです。 この映画をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
動画2:化学的に活性化されたスライドチャンバー上の軸伸びを失速。 広視野透過光(上)および核局在GFP(偽色の赤)の蛍光(下)の平らな外植のタイムラプス画像。11のスマイト期胚外植を、ラットテールコラーゲン溶液でコーティングされたスライドチャンバーに30分間装着した。画像取得は、3分フレーム間隔で反転顕微鏡上で行われる。スケールバーは100μmです。 この映画をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
ムービー3:後期胚の外植体の側面取り付け。 広視野透過光(左)および核局在GFP(偽色赤色)の蛍光(右)の経時経過画像は、通常のスライドチャンバー横取り型外植の画像である。尾部組織を15のスマイト段階で胚から外植し、トリカイン溶液を麻酔薬として使用した。画像取得は、3分フレーム間隔で反転顕微鏡上で行われる。スケールバーは100μmです。 この映画をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
動画4:尾部外植の単一細胞分解能イメージング。 EGFPを膜マーカーとして発現する外植物のタイムラプス共焦点イメージング(偽色赤色)と、生きている核に対して遠赤色染色(偽着色シアン)を示す。5 z層(10 μm)からの平均強度投影は、1時間以上の映画で示されています。画像取得は、40×のアポクロマティックλS DIC-水浸漬1.15 NA対物レンズを有するGaAsP検出器反転共焦点顕微鏡上で、4分フレーム間隔で行われる。スケールバーは100μmです。 この映画をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、ゼブラフィッシュ胚のために最近開発し、使用した組織培養外植技術の詳細なプロトコルを提示します。私たちの技術は、ひよこ8とゼブラフィッシュ9、10、11モデル生物の以前の外植方法に基づいています。このプロトコルで調製された尾の外植は、単純なスライドチャンバーで>12hまで生き残ることができ、その主要な体の軸とセグメントスマイトを、ソミト形成の終わりまで伸び続ける。
外植組織を健康に保ち、長期間正常に伸びるように注意する必要があります。まず、組織外植は、後部組織の無傷性を損なうことなく解剖されるべきである。我々は、皮膚細胞が後尾芽に侵入する神経中胚葉前駆細胞のパウチを提供していることを観察した。外植の皮膚がこれらの非常に可動性細胞を剥がれた場合は、尾芽組織を離れ、組織の限界を超えてカバースリップの上に後に移動します。第二に、皮膚組織の平凡に不均衡な張力は、PSMおよび脊索の軸を曲げることができる発散軸伸びをもたらす可能性がある。外植の両側の横向きの皮膚細胞に行われた短いスリットカットは、その懸念を軽減するのに役立ちます。皮膚関連の懸念に加えて、より長い期間の培養のために成長培地および解剖ツールの無菌性を維持するために特別な注意を払う必要があります。
適切な注意を払って、外植培養は胚全体の健全な成長を再現する。我々は、全胚12のように20のスマイト段階から始まる外植体の筋肉のけいれんを観察した。我々は、スマイトセグメンテーションの研究のためにPSM組織に焦点を当てたが、皮膚外膜、神経キール(後の神経棒および神経管)などの隣接組織、節索、中間および横プレートメソダームも記載された培養条件下でそのまま残っている(図1B)。これは、節切段階12で発生する脊索、クプファーの小胞および他の組織のような腹話に取り付けられた外植物で高解像度で画像化することができる黄身によって隠された組織にとって特に有利である。外植体系は胚全体ほど速く成長せず、胚全体と同じペースでスマイトをセグメント化しないことに注意する必要があります。この外植系の制限は、ここで観察されない他の事象の時間的ダイナミクスも変化させる可能性がある。
ここでは、胚全体実験に対する尾翼系の3つの大きな利点を強調した代表的な結果を発表した。我々は最近、この方法を利用して、スマイトセグメンテーション5のモルフォゲン勾配から軸伸びの有益な役割を解き放った。ライトシート顕微鏡の後期進歩により、いくつかのモデル生物に対して胚全体のライブイメージングが可能になりました。 しかし、これらの方法のほとんどは、まだ適切な細胞内解像度を欠っており、より広範な研究コミュニティにほとんどアクセスできません。ここで説明する尾部外植モデルは、単純な反転顕微鏡または共焦点顕微鏡で細胞下解像度組織レベルのライブイメージングを可能にします。方法論的利点とは別に、このようなライブイメージングは、脊椎動物後の体軸のセグメンテーションに関する洞察を提供することができます。プロトコルを可能な限り直接的かつアクセス可能に保つことで、外植システムはより広範なゼブラフィッシュ発生生物学分野にも利益をもたらします。
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Disclosures
著者らは利益相反を開示し、宣言するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、魚のメンテナンスのためのAECOMゼブラフィッシュコア施設とシンシナティ子供獣医サービス、技術的支援のためのシンシナティ子供イメージングコア、ビデオ制作の支援のためのディダルサパロフと原稿を編集するためのハンナシーウォールに感謝します。この出版物で報告された研究は、E.M.Öに賞番号R35GM140805の下で国立衛生研究所の国立一般医学研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
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- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
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- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M.
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