Summary
Her presenterer vi protokollen for 3D-vevskultur av sebrafisk posterior kroppsaksen, noe som muliggjør live studie av virveldyrsegmentering. Denne explant-modellen gir kontroll over akseforlengelse, endring av morfinkilder og subcellulær oppløsning vevsnivå levende bildebehandling.
Abstract
Virveldyr embryoer mønster deres store kroppsakse som repeterende somitter, forløpere av ryggvirvler, muskler og hud. Somitter segmenterer gradvis fra presomitisk mesoderm (PSM) som haleenden av embryoet forlenger bakre. Somitter dannes med regelmessig periodicitet og skala i størrelse. Sebrafisk er en populær modellorganisme, da den er genetisk gjennomførbar og har gjennomsiktige embryoer som tillater levende avbildning. Likevel, under somitogenese, er fiskeembryoer pakket rundt en stor, avrunding av eggeplomme. Denne geometrien begrenser levende avbildning av PSM-vev i sebrafiskembryoer, spesielt ved høyere oppløsninger som krever en nær objektiv arbeidsavstand. Her presenterer vi en flatt 3D vevskulturmetode for levende avbildning av sebrafiskhaleutløp. Haleutløp etterligner intakte embryoer ved å vise en proporsjonal nedgang i akseforlengelse og forkorting av rostrocaudale somite lengder. Vi er videre i stand til å stoppe akseforlengelseshastighet gjennom utvisningskultur. Dette gjør det for første gang mulig for oss å løsne den kjemiske inngangen til signalgradienter fra den mekanistiske inngangen til aksial forlengelse. I fremtidige studier kan denne metoden kombineres med et mikrofluidisk oppsett for å tillate tidskontrollerte farmasøytiske perturbasjoner eller screening av virveldyrsegmentering uten problemer med legemiddelgjennomtrengning.
Introduction
Metamerisk segmentering av organismer er mye brukt i naturen. Gjentatte strukturer er avgjørende for funksjonalitet av laterale organer som ryggvirvler, muskler, nerver, kar, lemmer eller blader i en kroppsplan1. Som et resultat av slike fysiologiske og geometriske begrensninger i aksialsymmetrien, viser de fleste phyla av Bilateria- som annelider, leddyr og akkordater-utstilling segmentering av deres embryonale vev (f.eks. ektoderm, mesoderm) antero-posteriorly.
Virveldyrembryoer segmenterer sekvensielt deres paraksialmesoderm langs den store kroppsaksen til somitter med artsspesifikke intervaller, tellinger og størrelsesfordelinger. Til tross for slik robusthet blant individuelle embryoer i en art, er somittsegmentering allsidig mellom virveldyrarter. Segmentering skjer i et stort regime med tidsintervaller (fra 25 min i sebrafisk til 5 timer hos mennesker), størrelser (fra ~ 20 μm i hale somitter av sebrafisk til ~ 200 μm i trunk somitter av mus) og teller (fra 32 i sebrafisk til ~ 300 i maisslanger)2. Mer interessant kan fiskeembryoer utvikle seg i et bredt spekter av temperaturer (fra ~ 20,5 ° C opp til 34 ° C for sebrafisk) samtidig som de holder somittene intakte med riktige størrelsesfordelinger ved å kompensere for både segmenteringsintervaller og aksial forlengelseshastigheter. Utover slike interessante egenskaper forblir sebrafisk som en nyttig modellorganisme for å studere segmentering i vertebrater på grunn av den eksterne, synkrone og gjennomsiktige utviklingen av et mangfold av søskenembryoer samt deres tilgjengelige genetiske verktøy. Negativt fra et mikroskopiperspektiv utvikler teleostembryoer på en stor sfærisk eggeplomme, strekker og avrunder gasstrulateringsvevet rundt det (Figur 1A). I denne artikkelen presenterer vi en flatt 3D vev utvise kultur for sebrafisk haler. Dette eklantsystemet omgår de sfæriske begrensningene i eggeplommemasse, noe som gir tilgang til høyoppløselig levende avbildning av fiskeembryoer for somittmønster.
Figur 1: Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Sebrafiskembryoer har fordeler for levende avbildning, for eksempel gjennomsiktigheten av gastrulaterende embryonalt vev (blå), men vevet dannes rundt en klumpete sfærisk eggeplommemasse (gul) som forhindrer nesten objektiv, høyoppløselig avbildning i intakte embryoer. Haleutløp kan dissekeres fra og med en mikrokirurgisk kniv (brun) kuttet fra vevet fremre av somitter (rød) og fortsetter ved grensen med eggeplommen bakre. (B) Dissekerte haleutløp kan plasseres på en deksleslip (lyseblå) dorsoventrally; holde nevralt vev (lysegrå) på toppen og notokord (mørkegrå) nederst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen innebærer bruk av levende vertebratembryoer yngre enn 1 dag etter befruktning. Alle dyreforsøkene ble utført i henhold til de etiske retningslinjene til Cincinnati Children's Hospital Medical Center; dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Institusjonell dyrepleie- og brukskomité (Protokoll # 2017-0048).
1. Embryo samling
- Sett opp par sebrafisk i kryssende tanker kvelden før embryosamlingsdagen. For presis iscenesettelseskontroll av embryoutvikling, bruk barrierer mellom parringspar.
- Hev barrierer før foretrukket gytetid og samle egg innen 15 minutter i en 100 mm Petri-tallerken.
- Rengjør rusk fra Petri-parabolen. Hvis mer enn 50 embryoer samles fra en enkelt kobling, del koblingen i flere Petri-retter tilsvarende.
- Inkuber embryoer i fiskesystemvann ved 28 °C til de når 50 % epibolystadium (5 timer etter befruktning). Et standardisert embryovekstmedium som E3 kan også brukes i stedet for akvariet systemvann til trinn 3.2.
- Fjern unfertilized egg under et stereoskop og flytt embryoene til en 23,5 °C inkubator over natten (O/N). Embryoer skal være på 8-10 somites stadium morgenen etter innsamlingsdagen.
2. Verktøyforberedelse
- Steriliser mikrokirurgiknivbladet, nålespissene (brukes til disseksjon av vevet) og glass Pasteur pipette ved å suge i 100% etanol (EtOH) og brannglass.
- Bruk to lag gjennomsiktig tape (~100-120 μm tykkelse) på 25 mm x 75 mm mikroskop lysbilder. Klipp ~18 mm x 18 mm kvadratbrønner i midten av hvert lysbildes tapebelegg med en skalpell.
- Tørk av de forberedte glidekamrene med 70% EtOH. Disse brønnene vil holde ~ 40 μL medium.
3. Prøvepreparering
- Dechorionate embryoer ved hjelp av spissen av to nåle sprøyter under et stereoskop. Overfør embryoer til en separat Petri-tallerken med fiskesystemvann for å skylle.
- Bruk et brannglasset sterilt glass Pasteur pipette, overfør embryoer i en 6 cm Petri-tallerken som inneholder disseksjonsmedium (Leibovitz-15 cellekulturmedium med L-Glutamin uten Fenol Rød, 0,8 mM CaCl2 og 1× antibiotika-antimykotisk løsning).
MERK: Fortsett å bruke en sterilisert glasspipette for alle overføringer etter dette trinnet.- Bruk en Petri-tallerken i glass til eksplantingsprosedyre for å unngå polystyrenflis under disseksjonen.
- Sett 50 μL vevsvekstmedium (disseksjonsmedium og 10% FBS) i glidekammeret.
- Stabiliser et embryo for disseksjon under stereoskopet med en nålespiss ved eggeplommevevskrysset nær hindbrain.
- Hold det embryonale vevet stabilt med en nål, bruk den mikrokirurgiske kniven med bladet holdt på 45° for å kutte vevet fremre til bakbremsen fra hverandre og skrell eggeplommen av det embryonale vevet fra fremre og bevege seg mot haleknoppen (Figur 1A).
MERK: Pass på at du ikke mister hudvevet mens du rengjør eggeplommen. Huden vil lett skrelle av som et flanke enkeltlags elastisk vev rundt embryoet under disseksjonen, så det er lett å gjenkjenne. - Når eggeplommen er helt fjernet fra den embryonale kroppen, kutt flankehudvevet fra halebudet. Holde de siste dannede 3-4 somittene intakte, kutt det mer fremre vevet ut (fullakseutvisning).
- Eggeplommen skal hovedsakelig komme av intakt fra denne prosedyren. Ved en revnet eggeplomme kan betydelige granulater av eggeplomme forbli festet til vevets ventrale overflate. I så fall bruker du et vippeverktøy til å rengjøre gjenværende eggeplommegranulat forsiktig.
MERK: En ubalanse i hudvev på sidesiden av en utvisning vil ikke tillate vevet å opprettholde en rett vekstretning. Utløpet vil i stedet bøye seg mot siden av mer strukket hud. Denne ubalansen kan korrigeres under stereoskopet ved å rupturere hudlaget ved hjelp av mikrokirurgisk kniv. - For hudløse eksplanter, trykk på en spiss av hudlaget med nål og skrell vevet utvises med den mikrokirurgiske kniven. Disse utvisningene vil ikke forlenge kroppsaksen i kulturen.
- I tillegg til de fulle akseuttene kan alternative uttømmelser gjøres på dette trinnet. For eksempel, dissekere ut allerede segmenterte somitter ved hjelp av mikrokirurgisk kniv (full-PSM explants) eller dissekere PSM i sin halve anteroposterior (halv-PSM explants). Se pkt. 5.1 for anvendelse av slike alternative utvisningsmidler.
- Eggeplommen skal hovedsakelig komme av intakt fra denne prosedyren. Ved en revnet eggeplomme kan betydelige granulater av eggeplomme forbli festet til vevets ventrale overflate. I så fall bruker du et vippeverktøy til å rengjøre gjenværende eggeplommegranulat forsiktig.
- Overfør umiddelbart den dissekerte utløpet til en 22 mm x 22 mm dekslelip som bildet skal utføres på.
- Ordne den utplantede flate på dorsoventralaksen, ventral side som berører dekslene (Figur 1B). Fjern forsiktig overflødig medium rundt vevet ved hjelp av en 20 μL filtrert spisspipette.
MERK: Forsinket overføring av dissekerte utsettinger til dekslene resulterer i deformasjoner av vevet, da det er lettet fra eggeplommens geometriske begrensninger.
- Ordne den utplantede flate på dorsoventralaksen, ventral side som berører dekslene (Figur 1B). Fjern forsiktig overflødig medium rundt vevet ved hjelp av en 20 μL filtrert spisspipette.
- Vend dekslene raskt og forsiktig med utvisningen over det vekstmediumfylte glidekammeret.
- For å forhindre bobledannelse, plasser en side av firkantdekslene på båndkammeret og slipp den andre siden forsiktig. Pass på at du ikke flytter/deformerer utvisning i dette trinnet.
- Fjern forsiktig overflødige medier som blør ut av kammeret ved å trykke glidekammeret på et laboratorievev. Dekslene vil sitte stabilt på glidekammeret for levende bildebehandling, på grunn av overflatespenningen til væskemediet uten tetning.
- For langsiktig culturing (>6 timer), bruk et større kammer. 22 mm x 50 mm rektangulære deksler sammen med to parallelle baner med tapelag på lysbilder kan brukes i slike tilfeller. Et ~1 mm bredt mellomrom kan etterlates mellom to båndbaner for å lette lufttilgangen til vekstmediet.
- Gjenta trinn 3.3-3.8 for å klargjøre flere uttjeninger. Forberedte explants vil forlenge sin A-P kroppsakse med et gjennomsnitt på ~ 30 μm / t hastighet og segmentere sine somitter med ~ 40 min intervaller ved 25 °C (Figur 2A, Video 1).
- For ikke-forlengelsesutløp, bruk forsiktig trykk på sidene av lysbildet som holder prøven i trinn 3.8.2 mens du suger overflødige medier ut på et laboratorievev. Alternativt kan explants dyrkes i enkeltbåndlag lysbildekamre. Hvis glidekammeroverflaten aktiveres kjemisk med Type I Collagen, vil det også resultere i ikke-forlengelsesutløp (Figur 2B, Video 2).
- Utfør belegg av kammeret med Type I Collagen på forhånd ved å dekke glidekamrene fullt ut med 15-20 ml forvannet kollagenoppløsning ved romtemperatur i 1 time. Bruk en laminær strømningshette for denne protokollen for å opprettholde steriliteten. Skyll forsiktig kamrene med disseksjonsmediet på enden.
- For embryoer eldre enn 15 somite stadium, montere halen explant vev lateralt i stedet for en flat (dorsoventral) montering (Video 3). For å forhindre muskelrykninger, inkluder 0,004% trikainløsning i kulturmediene som bedøvelsesmiddel3.
- For ikke-forlengelsesutløp, bruk forsiktig trykk på sidene av lysbildet som holder prøven i trinn 3.8.2 mens du suger overflødige medier ut på et laboratorievev. Alternativt kan explants dyrkes i enkeltbåndlag lysbildekamre. Hvis glidekammeroverflaten aktiveres kjemisk med Type I Collagen, vil det også resultere i ikke-forlengelsesutløp (Figur 2B, Video 2).
4. Live bildeoppkjøp
- Bildeprøver enten på et disseksjonsområde for widefield overført lysavbildning av somite segmenteringsstørrelser og perioder, eller med strukturert belysning / konfokal / lysarkmikroskopi ved hjelp av transgene reporterfisklinjer.
- Likevekt temperaturen på vevet utviser med bilderomstemperaturen i minst 15 min.
- For mer presis temperaturkontroll, bruk et kommersielt temperaturkontrollsystem montert på et invertert mikroskop.
- Sett bildeinnhentingsrammeintervallene til 2 - 10 min avhengig av den biologiske interesseprosessen.
MERK: Sebrafisk somitt segmentering er en rask prosess, som spenner mellom 20 - 55 min for levedyktige temperaturer på 30 °C til 21,5 °C i hele embryoer. Explants vil forlenge og segment ~ 30% langsommere enn hele embryoer.- Vær oppmerksom på å legge igjen nok forsinkelse mellom sett med kanalanskaffelser for å unngå mulig fototoksisitet for levende vev. Ikke utsett vevet for eksitasjonsstrålen i mer enn halvparten av bildebehandlingsvarigheten og senk stråleintensiteten så mye som mulig.
MERK: Akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) er generelt den viktigste årsaken til fototoksisitet i levende prøver4. Askorbinsyre som ROS-scavenger kan suppleres til vekstmedium ved 4 mM konsentrasjon for å buffere ROS-aktivitet og lindre fototoksisitet. Bivirkninger av fototoksisitet kan være vanskelig å legge merke til under levende avbildning. Haleutløp er fordelaktige i dette aspektet siden noen visuelle markører for fototoksisitet som mititotisk arrestasjon, hindret vevsutvikling (dvs. dannelse av somitter, haleforlengelse) og oppløsning av vev er lettere å legge merke til. Se den angitte referanse4 for en detaljert diskusjon.
- Vær oppmerksom på å legge igjen nok forsinkelse mellom sett med kanalanskaffelser for å unngå mulig fototoksisitet for levende vev. Ikke utsett vevet for eksitasjonsstrålen i mer enn halvparten av bildebehandlingsvarigheten og senk stråleintensiteten så mye som mulig.
- Bruk enkeltcelletrinns RNA-injiserte embryoer for å skaffe 4D-bilder som er ment å bli segmentert og analysert i cellulær oppløsningsnivå.
- Bruk 300 pg RNA fra in vitro transkriberte membraner og kjernefysisk fluorescerende reportermarkør plasmider som pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) eller pCS-memb-mCherry (Addgene plasmid #53750) i kombinasjon med pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) eller pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) i injeksjoner. Hvis du vil se en prøvefilm med cellemembran og nukleimarkører, kan du se Video 4.
MERK: Gjennomsnittlig cellestørrelse på PSM vev er ca ~ 5 μm i diameter, hvorav kjerner består av ~ 3 - 4 μm. En pikselstørrelse på ~ 0,5 μm og en z-seksjonering på ~ 1 μm skal registreres for riktig cellesegmentering.
- Bruk 300 pg RNA fra in vitro transkriberte membraner og kjernefysisk fluorescerende reportermarkør plasmider som pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) eller pCS-memb-mCherry (Addgene plasmid #53750) i kombinasjon med pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) eller pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) i injeksjoner. Hvis du vil se en prøvefilm med cellemembran og nukleimarkører, kan du se Video 4.
5. Immunostaining av hale utviser
MERK: Vev dyrket etter ulike disseksjonsscenarier (forlengelse, ikke-forlengelse, hale knopp dissekert, halv PSM etc.) som flatmonterte hale explants5 kan gjenvinnes fra lysbildekamre for ytterligere immunstaining kvantifiseringer av proteiner av interesse. Her presenterer vi protokollen som brukes for di-fosforylatert ekstracellulær signalregulert kinase (ppERK) farging av explants som FGF signal gradient avlesning.
- Etter dannelse av somitter til ønsket stadium, forsiktig skifte dekslene halvveis til hjørnet av glidekammeret uten å løfte.
- Ved hjelp av ~ 100 μL ekstra disseksjonsmedium i en glass Pasteur pipette, gjenopprette utblåsningene fra lysbildet og overføre til en 64-brønns cellekulturplate.
MERK: Fra og med dette trinnet kan alle løsningserstatninger utføres under et disseksjonsomfang med en separat glasspipette for faste prøver. Dette vil sikre at du ikke mister utvisningsvev i brønner eller overfører dem i mellom. - Etter å ha overført alle explants, suge overdreven medium ut av brønnene en etter en og sette 100 μL av 4% paraformaldehyd i PBS (PFA) inn i hver brønn.
FORSIKTIG: PFA er en giftig løsning med kreftfremkallende effekter. Riktig verneutstyr bør brukes under håndtering. - Fest utvisning i en 64-brønnsplate ved romtemperatur i 1 time på en shaker.
- Vevsutløp er mer følsomme for deformasjoner enn hele embryoer. Juster shakerhastigheten tilsvarende.
- Vask fixativet ut med 150 μL PBS-Tw (0,1% Tween20 i PBS) tre ganger. Samle den første vasken i en bestemt "PFA Waste" -beholder.
- Dehydrere utt utviser i trinn på 4×5 minutter ved å erstatte ~ 40 μL oppløsning hver gang med 100% metanol (MeOH).
FORSIKTIG: MeOH er et giftig kjemikalie som er flyktig og brannfarlig. Arbeid i et godt ventilert rom og bruk riktig personlig verneutstyr til håndtering. - Som det siste trinnet i dehydrering, fjern all løsning fra brønner og erstatt med 100 μL MeOH. Inkuber ved -20 °C i 15 minutter.
MERK: Bruk en bestemt "MeOH Waste"-beholder for å samle inn løsningene til trinn 5.11. - Tilsett 50 μL MeOH og rist ved romtemperatur i 5 min.
- Rehydrer utvisning i trinn på 4×5 minutter ved å erstatte ~ 40 μL oppløsning hver gang med PBS-T (0,1% Triton-X 100 i PBS). Bruk en bestemt "MeOH Waste"-beholder for å samle inn løsningene.
- Som det siste trinnet i rehydrering, fjern all løsning fra brønner og erstatt med 100 μL PBS-T.
- For vev permeabilisering behandle explants med 1,5% Triton-X 100 i PBS i 20 min ved romtemperatur på shaker.
- Vask prøver med MAB-D-T (0,1% Triton-X 100 vaskemiddel og 1% dimetylsulfoksid (DMSO) i 150 mM NaCl 100 mM malesyrebuffer pH 7,5) 3×5 min.
FORSIKTIG: DMSO er brannfarlig og giftig mutagen. Riktig verneutstyr bør brukes under håndtering. - Inkuber eksellasjoner i 100 μL/brønns serumblokkeringsløsning (2% foster bovint serum i MAB-D-T) i 2 timer ved romtemperatur.
- Bytt ut alle blokkeringsløsningene med 50-100 μL/brønn primær antistoffløsning (1:1000 fortynning av monoklonal musantistoff mot ppERK i serumblokk). Inkuber prøver O/N (>16 h) ved 4 °C på shaker.
- Vask den primære antistoffløsningen med MAB-D-T 5×5 min.
- Inkuber prøver i sekundær antistoffløsning (Alexa Fluor 597 geit antimus IgG2b (1:200) og Hoechst 33342 (1:5000) i MAB-D-T) O/N ved 4 °C på en shaker eller i 3 timer ved romtemperatur.
MERK: Fra og med dette trinnet dekker du 64-brønnsplaten med aluminiumsfolie for å unngå lyseksponering av sekundære antistoffbehandlede prøver.
FORSIKTIG: Hoechst 33342 er et potensielt kreftfremkallende middel. Riktig verneutstyr bør brukes under håndtering. - Vask den sekundære antistoffløsningen med PBS-Tw 3×5 min.
- Fest prøver med PFA i 15 minutter ved romtemperatur.
- Vask fikseringsmiddelet med PBS-Tw og likevektsprøver innen 60% glyserol. Monter utvisning på mikroskopsklier med neglelakk og 60% glyserol for avbildning. For representative immundempende resultater, se figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen muliggjør flat geometrisk dyrking av levende sebrafisk hale explants. Vevskultur presenterer tre store fordeler i forhold til hele embryoer: 1) kontroll av akseforlengelseshastighet, 2) kontroll over ulike signalkilder (morfogen) ved enkel disseksjon, og 3) nær objektiv, høy forstørrelse og høy NA levende bildebehandling.
Kjemisk ubehandlede glidekamre gjør at halen kan forlenge hovedaksen (figur 2A) ved at hudens ektoderm vikles rundt vevet under. Da vi dyrket utvisningene på de kjemisk aktiverte glidekamrene (med Type I Collagen), strakte hudetodermet seg og festet seg til glidekammeret, som stoppet akseforlengelsen av explanten. Til tross for dette fortsatte somittene å segmentere (Figur 2B, Supplementary Movies S1 og S2). Som beskrevet i protokollen, kan akseforlengelse også stoppes direkte ved å påføre fysisk trykk under monteringsprosessen eller monteringsutløp i et grunnere glidekammer. Kvantifisering av akseforlengelseshastighet under slike fysiske begrensninger finnes i vårt tidligere publiserte arbeid5.
Figur 2: Kontroll av akseforlengelse i explants. (A) Explants dyrket på et vanlig lysbildekammer (venstre) forlenger aksialt når de fortsetter å segmentere nye somitter. Overført lys (venstre, gråtone) og transgene kjernefysiske markør (høyre, røde) øyeblikksbilder vises for 2 timers kulturvarighet. (B) Kjemisk aktivering av glidekammeret med Type I Collagen før culturing stopper den aksiale forlengelsen, men påvirker ikke somite segmenteringshastighet. Skalalinjen er 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For det andre kan explants dyrkes ved å dissekere ut kildene til morfiner for å identifisere lærerik informasjon de gir for utviklingsprosesser. Her presenterer vi tre eksemplariske bilder som viser effekten av disseksjoner på ppERK-signalnivåer (figur 3). I PSM-vevet etableres en FGF-signalgradient fra bakre til fremre (lest opp av ppERK-nivåer). Bare hale knoppvevet transkriberer aktivt fgf86 og danner en kilde for denne gradienten ved hjelp av FGF ligand diffusivitet5. Hale utviser manglende hale knopp delen av vevet etter disseksjon (Figur 3C) resulterer i en kortere ppERK gradient (Figur 3B,3D). Motsatt er en retinoinsyregradient etablert fra fremre til bakre i både PSM og dorsalt nevralt vev. Nylig dannede somitter og den fremre enden av PSM ekspress retinoinsyre (RA) syntetiserer enzymer og fungerer som en kilde for RA gradient7. Da vi dissekerte ut det fremre PSM-vevet i utvisningene (figur 3E), observerte vi fortsatt en normal utstrekning av ppERK-gradienten (figur 3F) som visualisert ved immunstaining. En detaljert utnyttelse av denne styrken av explant metode finnes i vår nylige studie5.
For det tredje er flatmonterte sebrafiskutløp optimale for høyoppløselig levende observasjon av vevsmorfogenese. Her presenterer vi en film (Video 4) tatt med en transgen utvisning som uttrykker EGFP som en cellemembranmarkør (falsk farget med rødt) og farget med en fjernrød cellekjernemarkør (falsk farget med cyan). Uten ytterligere kvantifisering kan mange prosesser som inntrengning av nevromesodermale forfedre inn i haleknoppen, høyere motilitet av bakre PSM-celler sammenlignet med fremre, og epitelialisering av somitiske grenseceller direkte observeres i filmen.
Figur 3: Immunostaining av haleutløp. (A) Full PSM utviser med intakte signalgradienter langs PSM som kontroll. (B) Regelmessig ppERK-gradient observeres i full PSM-utvisning med immunstaining. (C) Hale knopp dissekert explants mangler en stor del av bakre FGF signalkilde. (D) Et svært bakre begrenset ppERK-signal observeres i haleknopp dissekerte utplanter. (E) Fremre PSM og somittisk vev kan dissekeres ut for å fjerne kildene for mulige fremre PSM-signalfaktorer som RA-signalering. (F) Fremre PSM-fjerning endrer ikke den normale sonen for ppERK-gradient. Vev ble fikset 2 timer etter eksplanting for immunstainingsprotokoll. Skalalinjen er 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Akseforlengelse og somittsegmentering i 3D-utvisning. Widefield overført lys (topp) og kjernefysisk lokalisert GFP (falsk farget rød) epifluorescence (bunn) tidsforløp bilder av en vanlig lysbildekammer flatmontert explant. Halevev ble utvist fra embryo på 13 somitter stadium. Bildeanskaffelse utføres på et invertert mikroskop med 3 minutters rammeintervaller. Skalalinjen er 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Stalled akse forlengelse på kjemisk aktivert lysbildekammer. Widefield overført lys (topp) og kjernefysisk lokalisert GFP (falsk farget rød) epifluorescence (bunn) tidsforløp bilder av en flat montert explant. En 11 somites stadium embryo explant ble montert på et glidekammer belagt med rottehale kollagenløsning i 30 minutter før montering. Bildeanskaffelse utføres på et invertert mikroskop med 3 minutters rammeintervaller. Skalalinjen er 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Lateral montering av sen-stage embryo explants. Widefield overførte lys (venstre) og kjernefysisk lokalisert GFP (falsk farget rød) epifluorescens (høyre) tidsforløp bilder av en vanlig lysbildekammer lateral-montert explant. Halevev ble utplantet fra embryo ved 15 somitter stadium og trikainoppløsning ble brukt som anestesi. Bildeanskaffelse utføres på et invertert mikroskop med 3 minutters rammeintervaller. Skalalinjen er 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 4: Bilde av haleutvisning med én celleoppløsning. Tidsforløp konfokal avbildning av en explant som uttrykker EGFP som membranmarkør (falsk farget rød) og langt rød farget for kjerner i live (falsk farget cyan). Gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon fra 5 z-lag (10 μm) vises i filmen over 1 time. Bildeanskaffelse utføres på et GaAsP-detektor invertert konfokalt mikroskop med et 40× apochromatisk λS DIC-vann nedsenking 1,15 NA objektiv linse, med 4 minutters rammeintervaller. Skalalinjen er 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for en vevskultur explant teknikk vi utviklet og brukte nylig5 for sebrafisk embryoer. Vår teknikk bygger på de tidligere explant-metodene i kylling8 og sebrafisk9,10,11 modellorganismer. Hale explants forberedt med denne protokollen kan overleve så lenge >12 h i et enkelt lysbildekammer, fortsetter å forlenge sin store kroppsakse og segmentere somitter, til slutten av somitogenese.
Det bør tas hensyn til å holde explant vev sunt og vellykket forlengelse i lange varigheter. For det første bør vevet utvises uten å skade intaktheten av bakre vev. Vi observerte at hudcellene gir en pose for nevromesodermale stamceller som går inn i bakre halebud. Hvis huden på explants blir skrelt av disse svært motile cellene, la tailbud vev og migrere bakre over dekslenelip utover vevsgrensene. For det andre kan middelmådig ubalansert spenning i hudvevet resultere i divergerende akseforlengelse, som kan bøye PSM-aksen og notokordet. Et snarveissnitt laget til flankehudcellene på begge sider av utløpet bidrar til å lindre denne bekymringen. I tillegg til de hudrelevante bekymringene, bør det tas ekstra hensyn til å opprettholde steriliteten til vekstmediene og disseksjonsverktøyene for kulturer med lengre varighet.
Med riktig omsorg rekapitulerer den eklantkulturen den sunne veksten av hele embryoer. Vi observerte muskulære rykninger i explants som begynner fra 20 somites stadium som i hele embryoer12. Selv om vi fokuserte på PSM-vevet for studier av somittsegmentering, forblir tilstøtende vev som hudetoderm, nevral kjøl (senere nevral stang og nevralrør), notokord, mellomliggende og lateral platemesoderm også intakt under de beskrevne kulturerende forholdene (Figur 1B). Dette er spesielt fordelaktig for vev skjult av eggeplommen som kan avbildes i høy oppløsning ved ventrally monterte ekskursjoner, for eksempel notochord, Kupffers vesicle og andre vev som utvikler seg i segmenteringsstadier12. Det bør understrekes at explant-systemet ikke vokser så fort som hele embryoer, og ikke segmenterer somitter i samme tempo som hele embryoer. Denne begrensningen for explant-systemet kan også endre tidsdynamikken til andre hendelser som ikke betjenes her.
Her presenterte vi representative resultater som fremhever tre store fordeler med haleutvisningssystemet over hele embryoeksperimenter. Vi brukte nylig denne metoden for å løsne lærerike roller av akseforlengelse fra morfogene gradienter for somittsegmentering5. Sene fremskritt i lysarkmikroskopi har gjort hele embryo levende avbildning mulig13 for flere modellorganismer. Men de fleste av disse metodene mangler fortsatt riktig subcellulær oppløsning og er knapt tilgjengelige for det bredere forskningsmiljøet. Halen explant modell beskrevet her gjør subcellulær oppløsning vev-nivå levende bildebehandling tilgjengelig med enkle inverterte eller confocal mikroskoper. Bortsett fra metodologiske fordeler, kan slik levende bildebehandling gi innsikt i segmentering av den bakre virveldyr kroppsaksen. Ved å holde protokollen så direkte og tilgjengelig som mulig, kan explant-systemet også være til nytte for det bredere sebrafiskutviklingsbiologifeltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre og erklære ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker AECOM Zebrafish Core Facility og Cincinnati Children's Veterinary Services for fiskevedlikehold, Cincinnati Children's Imaging Core for teknisk assistanse, Didar Saparov for hjelp med videoproduksjon og Hannah Seawall for redigering av manuskriptet. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under Prisnummer R35GM140805 til E.M.Ö. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M.
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
