Summary
Kült WC'ler, belirli belirteç ifadesini test ederek ve ilaç direncini ve karaciğeri diğer olasılıklar arasında kolonileştirme yeteneğini değerlendirerek kanserin daha derin bir fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Genel olarak, CTC kültürü hasta sonucunu iyileştirmek için kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir klinik araç olabilir.
Abstract
Metastaz kanser ölümlerinin önde gelen bir nedenidir. Tedavi stratejilerindeki gelişmelere rağmen, metastatik kanserin prognozu zayıftır. Bu nedenle metastaz gelişiminin arkasındaki mekanizmaları anlamak ve böylece ileri kanser için verimli tedaviler önermek için acil bir ihtiyaçla karşı karşıyayız. Biyopsiler invaziv ve erişilemez olduğu için metastatik kanserlerin tedavisi zordur. Son zamanlarda, hem hücre içermeyen dolaşımdaki deoksiribonükleik asit (DNA) hem de periferik kandan dolaşımdaki tümör hücreleri de dahil olmak üzere sıvı biyopsilere önemli bir ilgi olmuştur ve metastatik kolorektal kanser hastalarından karakterizasyonlarına katılmak için dolaşan birkaç tümör hücre hattı kurduk. Gerçekten de, bu nadir ve kötü tanımlanmış hücreleri işlevsel olarak karakterize etmek için, önemli adım onları genişletmektir. Kurulduktan sonra, dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) çizgileri süspansiyon veya yapışık koşullarda kültürlenebilir. Moleküler düzeyde, CTC çizgileri immünoforezans veya sitometri analizi ile belirli ilgi belirteçlerinin (farklılaşma, epitel veya kanser kök hücreleri gibi) ekspresyonunu değerlendirmek için daha fazla kullanılabilir. Ek olarak, CTC hatları altın standart kemoterapilere ve hedefe dönük tedavilere karşı ilaç duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir. CTC hatlarının tümörleri başlatma yeteneği, immün yetmezlikli farelerde CTC'lerin deri altı enjeksiyonu ile de test edilebilir.
Son olarak, CTC genlerini düzenleyerek, kısa saç tokası ribonik asit (shRNA) veya Crispr / Cas9 ile kanser yayılmasında rol alabilecek belirli ilgi genlerinin rolünü test etmek mümkündür. Böylece modifiye CTC'ler, metastatikgeliştirme sürecinin bir kısmını deneysel olarak taklit etmek için immün yetmez fare dalaklarına enjekte edilebilir vivo .
Sonuç olarak, CTC hatları gelecekteki araştırmalar ve kişiselleştirilmiş tıp için değerli bir araçtır, burada başlangıçta metastazdan sorumlu hücreleri kullanarak tedavi verimliliğinin tahminine izin vereceklerdir.
Introduction
Erken kanser tanısında ve terapötik stratejide son gelişmelere rağmen, kanser morbiditesinin yüzde doksanından fazlası hala metastaznedeniyle 1. Metastatik süreç, kolorektal kanser (CRC) durumunda, hücrelerin birincil tümörden lokal olarak kopması ve sonunda karaciğer ve akciğerler gibi uzak bölgeleri kolonize etmek için dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC' ler) haline geldikleri kan dolaşımına girmeleri ile başlayan çok adımlı bir basamaktır2. Son zamanlarda, hasta kan örneklerinden CTC'leri tespit etmek ve numaralandırmak için invaziv olmayan bir araç olan sıvı biyopsilerine dikkat artmaktadır. İntratümör genetik heterojenlik ilaç direncinin önemli bir nedenidir; bu nedenle, tümör materyalinden temsili hücreleri izole etmek kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir araç oluşturur3.
Kandaki CPC sıklığının düşüklüğüne rağmen (106 - 107 lökosit başına 1 CTC)4, CTC'lerve kanın diğer bileşenleri arasındaki özellik farklılıklarına dayanarak çeşitli algılama ve izolasyon teknikleri geliştirilmiştir5. Hasta kan örneklerindeki CTC sayısı, tek başına malignite, tedavi yanıtı ve hastalığın ilerleme evresi hakkında bilgi sağlayabilir6,7. Bu nedenle, CTC izolasyonu, genetik heterojenliği değerlendirmek veya ilaç taraması yapmak için çeviri çalışmaları için ve metastatik indüksiyonun temel aktörleri oldukları için bu invaziv hücreleri karakterize etmek için temel çalışmalar için çok önemli bir araçtır8,9. Gerçekten de, zaman içinde binlerce mutasyon biriktiren ticari olarak kurulmuş kanser hücre hatlarıyla karşılaştırıldığında, taze CTC'ler metastaz yapmak için güçlü bir kapasite de dahil olmak üzere orijinal primer tümörün ana özelliklerini paylaşırlar ve bunlar hastalığın daha iyi bir yansımasıdır. Bu özellikler, özellikle metastazda yer alan tahmin edilen anahtar faktörlerin nakavt deneylerinde, temel çalışmalar için sağlam bir araç haline getirir. Bu deneylerin sonucu in vivo, fareler üzerinde, aşağıda açıklandığı gibi.
CTC'ler izole edildikten sonra, yapışmayan kültür koşullarında genişletilebilirler ve daha sonra, mevcut herhangi bir kanser hücresi hattı gibi manipüle edilebilirler, yani bilimsel soruya bağlı olarak, bağlı koşullarda eşit olarak kültürlenebilir veya Matrigel'e gömülebilirler10. Örneğin, ilgi çekici bir proteinin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu test etmek için, CTC küreleri süspansiyon durumunda yetiştirilebilir ve küre bölümlerinde immünofluoresans yapmak için Histogel'e gömülebilir. Ek olarak, protein membranöz ise, canlı hücreler üzerindeki ifadesi sitotemetri ile ölçülebilir.
Fonksiyonel çalışmalar için, karaciğer kolonizasyonunda rol oynayabilecek ilgi çekici bir proteinin rolünü test etmek için, shRNA veya CRISPR / Cas9 tarafından düzenlenmiş genlere sahip CTC'ler, immün yetmez farelerin dalağının içine enjekte edilebilir. Bu ikinci deney karaciğer metastaz kolozizasyonunu taklit etmek için güçlü bir modeldir11.
CTC'lerin tümörleri başlatma yeteneği, immün eksikliği olan farelere çok az sayıda hücre enjekte edilerek değerlendirilebilir. Tümör inisiyonu kanser kök hücrelerinin (CSC) ayırt edici özelliği olduğundan, bu test CTC satırlarındaki CSC'lerin yüzdesini gösterecektir. Bu kök hücre fenotipi dolaşımdaki tümör hücre hatlarını bazı altın standart kanser tedavilerine dirençli hale getirir. Bu nedenle genişletilmiş CTC'ler ilaçları taramak ve hasta için en iyi potansiyel verimli tedaviyi belirlemek için kullanılabilir; Tedaviye BTC yanıtı, örneğin bir lüminesans canlılık testi kullanılarak in vitro olarak test edilebilir.
Uzun vadeli bir perspektifte, yeni izole edilmiş ve güçlendirilmiş CTC'ler üzerinde ilaç taraması, hastalar için en verimli ve uyarlanmış tedavinin seçilmesine yardımcı olmak için kişiselleştirilmiş tıp için yeni bir araç olarak kullanılabilir.
Bu makalede, CTC çizgilerini kültüre etme, immünostainleme ve sitotemetri yoluyla spesifik proteinleri lekeleme, sitotoksiklik tahlillerinin yanı sıra CTC ile in vivo ksinograft deneyleri yapma protokolleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm in vivo protokoller hayvan etik kurumları tarafından onaylandı.
1. 3D Kültür Koşullarında CTC Amplifikasyonu
- Süspansiyondaki CTC'leri kültüre etmek için, ultra düşük ataşman (ULA) kuyularındaki ilk tohum CTC'leri 5 hücre/μL maksimum konsantrasyonda ve 1 mL M12 ortamına (örneğin, gelişmiş DMEM-F12 ile desteklenmiş 2 mM l-glutamin, 100 Birim / mL penisilin ve streptomisin, N2 takviyesi, 20 ng / mL epidermal büyüme faktörü ve 10 ng / mL fibroblast büyüme faktörü10).
- Küre oluşumuna ve hücre genişlemesine izin vermek için, hücreleri 6 ila 10 gün arasında hipoksik koşullarda (%2 O2)kuluçkaya yatırın.
- Küreler yeterince büyük olduğunda (100 μm), nekrozu önlemek için, amplifikasyon için ayrıştırın.
- Hücre süspansiyonu 2 mL'lik bir tüpe veya 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve pelete 500 μL nazik ayrışma reaktifi (örneğin Accumax) ekleyin.
- Girdap hafifçe ve 37 ° C'de 20 ila 30 dakika boyunca nazik ayrışma reaktifi ile hücre süspansiyonunu kuluçkaya yatırın.
NOT: Nazik dissositasyon reaktifinde (Accumax) inkübasyon süresinin aşılması anormal hücre mortalitesinin artmasına neden olabilir. - 1,5 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ekleyin ve tüpü 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- μL başına 1-5 hücre yoğunluğuna ulaşmak için süpernatant dökün ve peleti taze M12 ortamında yeniden biriktirin.
- Hücre süspansiyonunun Ultra Düşük Bağlantı plakasının yeni kuyularında tohum: T75 şişeleri için 10 mL, 6 kuyu plakası için 2 mL ve 96 kuyu plakası için 100 μL
2. CTC Küre Bölümlerinde İmmün Floresan (IF) Boyama
- Santrifüj CTC küreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da 15 mL'lik bir tüpe sokar, süpernatantı aspire eder ve peleti PBS ile iki kez yıkayın.
- Peletin %4 paraformaldehit (PFA) 500 μL ile yeniden ıslatın ve buzda 20 dakika kuluçkaya yatırın. Süspansiyonu 300 x g'da santrifüj edin ve 5 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Peletin (yani 15 ila 20 μL) sıcak ve sıvı Histogel ile yeniden ıslatır. Bir pipetle, tüm süspansiyonu alın ve 4 ° C'de önceden havalandırılmış bir yüzeyde bir damlacık yapın ve 5 ila 10 dakika polimerize olmasını bekleyin.
NOT: Süspansiyonun ucuna polimerizasyonunu önlemek için hızlı çalışın. - Katı damlacığı neşter bıçağıyla ayırın ve bölmeli gömme kasetine yerleştirin.
- Aşağıdaki adımları uygulayın: parafin inklüzyasyonu, parafin kesiti, kesit rehidrasyonu, antijen alımı ve antikor inkübasyonu. Bu adımlar, parafin içine gömülü ve immünoresans lekeleme için işlenmiş herhangi bir tümör veya organ için aynıdır12.
NOT: Kaset, parafin gömülmeye kadar 4 °C'de% 70 etanolde saklanabilir.
3. Sitometri Analizi
- Santrifüj CTC küreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da 15 mL'lik bir tüpe dökün ve peleti PBS ile iki kez yıkayın.
- Süpernatantı aspire edin ve pelete 500 μL nazik ayrışma reaktifi ekleyin.
- Vortex, hücre süspansiyonunu 37 °C'de 20 ila 30 dakika boyunca nazik ayrışma reaktifi ile nazikçe ve kuluçkaya yaslayın.
NOT: Nazik dissositasyon reaktifinde (Accumax) 40 dk inkübasyonun aşılması anormal bir hücre mortalitesinin artmasına neden olabilir. - Hücre süspansiyonu 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatantı ortadan kaldırın ve peleti 5 mL blokaj tamponunda yeniden dirin (örneğin, % 1 sığır serum albüminli PBS (BSA)).
- Kalan küreleri ortadan kaldırmak için hücre süspansiyonunu 40 μm hücre süzgecinden geçirin.
- Saydıktan sonra, üç floresan aktif hücre sıralama (FACS) tüpüne 200.000 hücre koyun, 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Boyama reaktifi almayacak bir kontrol olarak üç FACS tüpünden birini kullanın.
- Veri sayfasına göre, kalan iki FACS tüpüne uygun antikor ekleyin (yani, ilgi proteinine karşı bir konjuge antikor, bir konjuge izotip kontrolü).
- Önerilen kuluçka süresinden sonra, hücreleri yıkamak için 300 μL bloklama tamponu ekleyin, 3 tüpü 300 x g'da santrifüjleyin ve üst kısmı epire edin. Bu adımı iki kez yineleyin. Ardından, peleti blokaj tamponu ile hücre canlılık boyama reaktifi ile yeniden yaşayın (herhangi bir lekelenme olmadan FACS tüp kontrolü hariç).
- FACS analizine kadar tüpleri buzda tutun. Hücre canlılığı ve antikor lekeleme için kapıyı tanımlamak için önce tüpü lekelemeden kullanın. Daha sonra, ilgi proteinini ifade eden CTC yüzdesini ölçmek için FACS tüpünü ilgi proteinine karşı konjuge antikor ile analiz edin. Konjuge izotip kontrolüne sahip FACS tüpü bir kayma göstermemelidir. Bu, kaymanın hedeflenen ilgi proteinine özgü olduğunu doğrular.
NOT: Mümkünse, pozitif kontrol olarak yüksek düzeyde ilgi çekici proteini ifade eden bir hücre hattı ve proteini negatif kontrol olarak ifade etmeyen bir hücre hattı kullanın.
4. Lüminesans Canlılık Tahlil (CellTiter-Glo)
- M12 ortamında ayrışmış CTC'leri (bölüm 1.4.5'te açıklandığı gibi) yeniden kullanılabilir. Hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonu 200.000 hücre/mL'ye uyarlanın.
- ULA 96 kuyu plakasında, kuyu başına 50 μL'de 10.000 ayrışmış CTC tohum ve plakayı 24 saat boyunca hipokside (%2 O2)kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, TEST Edilen ilacın 50 μL'lik kısmını CTC'lere ekleyin. Daha önce, yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) belirlemek için ilaç konsantrasyonunun titrasyonunun yapılması önerilir. Bazal hücre canlılığını belirlemek için bazı kuyuları araçla tedavi edin.
NOT: Tohumlanan hücre sayısı, iki katına çıktıkları süreye bağlı olarak CTC çizgileri arasında farklılık gösterebilir. Ek olarak, sonuçlar değişkenliğini en aza indirmek için hücreler üç taraflı olarak tohumlanmalıdır. - Hipokside tabakları 48 saat daha kuluçkaya yatır.
- 3. günde, üretici protokolüne göre, kültürlü plakaları ve lüminesans hücre canlılık tamponu yerleştirin ve oda sıcaklığında substratı yeniden inşa edin ve substratı uygun bir tampon hacmiyle yeniden inşa edin.
- Her kültürlü plakaya 70 μL lüminesans canlılık karışımını ekleyin. Hücre lizizini indüklemek için 20 dakika boyunca bir yörüngesel çalkalayıcıya plakalar koyun ve ardından karışımın 100 μL'lik kısmını luminometre ile uyumlu opak duvarlı çok kuyulu bir plakaya aktarın.
- Plakanın oda sıcaklığında dinlenmesine izin verin, lüminesan sinyali stabilize etmek için alüminyum folyo ile örtün.
NOT: Parlak sinyal 3 saate kadar stabildir. - Mikro plaka okuyucu (yani Tecan Infinite 200 Pro) kullanarak parlaklığı kaydedin.
- Veri analizi için, durum başına üç taraflı bağıl ışık birimi RLU'nun ortalamasını hesaplayın. Gerekli her ilaç konsantrasyonuna göre canlılık yüzdesini değerlendirmek için: (tedavi edilen hücrelerin RLU'si/tedavi edilmemiş hücrelerin RLU'si) x 100.
5. Deri Altı Enjeksiyonları
- Bir mikrosantrifüj tüpünde, hücreleri 100 μL steril PBS'de yeniden biriktirin. Enjekte edilen hücrelerin sayısı düşükse, hücreleri birlikte konsantre etmek ve tümör başlatmayı teşvik etmek için büyüme faktörlerinde azaltılmış 1:1 PBS / Matrigel'de hücreleri yeniden biriktirin.
NOT: Hücre yoğunluğu, bilimsel soruya ve deneyin amacına bağlı olarak 10 hücreden (tümör başlatma kapasitesine meydan okumak için) 1 milyon hücreye kadar olabilir. - Bir insülin şırındında tüm hacmi yukarı çekin.
- Bağışıklık eksikliği olan bir farede, kanadın derisini işaret ve yüzük parmağı arasında sıkıştırın ve iğneyi cildin tabanına hafifçe yerleştirin.
NOT: Bu işlem ağrılı değildir ve bilinçli fareler üzerinde yapılır. - Hücrelerin yayılmasını önlemek için hacmi yavaşça aynı noktaya enjekte edin. Bu, cildin altında küçük bir bleb yaratacaktır.
- Hacmin geri akışını önlemek için enjeksiyon bölgesine hafif basınç uygulayın.
- Tümör büyümesini iki günde bir kaliper kullanarak izleyin.
- Tümör 1500 mm3'üaşarsa hayvanı kurban edin. Malzeme mevcudiyetina bağlı olarak, fareleri karbondioksit veya anestezik gazların solunması veya servikal çıkık ile ötenazi.
6. İntrasplenik Enjeksiyon
- Başlamadan önce, cerrahi aletleri (makas ve forseps) 124 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın ve çalışma alanının tüm yüzeylerini% 70 etanol ile temizleyin.
- Bir mikrosantrifüj tüpünde, hücreleri 50 μL steril PBS'de yeniden depolayın ve buzda saklayın. Hücre yoğunluğu 0,5 ila 1 milyon hücreye kadar çıkabilir. Daha fazla sayıda hücre kan dolaşımında pıhtı gelişmesine neden olabilir.
- Hücreleri enjekte etmeden önce, ağrı kesici için deri altından 0.015 mg/mL buprenorfin 100 μL enjekte edin.
- Fareyi, izofluranın% 3'te tutulduğu bir indüksiyon odasına 2-3 dakika yerleştirin. Hayvan artık harekete yanıt vermediğinde, sağ tarafına bir ısıtma yastığına koyun ve O2 ve izofluran gaz karışımını sağlayan bir solunum devresi yüz maskesi kullanarak anesteziyi koruyun.
- Ameliyat sırasında göz kurumasını önlemek için her gözün üzerine göz yağı uygulayın. Torasik bölgeyi Povidone-iyot çözeltisi (yani Betadine) ile dezenfekte edin.
- Dorsoventral tarafta, 10.
- Dalağını yavaşça kaldırın ve steril gazlı bez üzerine yatırın. Bir insülin şırıngan kullanarak, dalak ucuna 50 μL CTC enjekte edin. Şırıngayı dik tuttuğundan emin olun ve geri akışı önlemek için 3-5 dakika bekleyin ve ardından iğneyi çıkarın.
- Dalak damarlarını iki taraftan (arterler ve damarlar) bağlayın ve iki ligatürün hemen üzerinde keserek dalağını çıkarın. Bu organda istenmeyen tümör oluşumunu önlemek için dalak çıkarılır.
- 5.0 bozulabilir steril dikiş kullanarak karın peritonum ve ardından cilt dikiş.
- Fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar sıcak tutun.
- Fareyi haftada 3 gün anormal vücut fonksiyonu, anormal hareket ve duruş ve kilo kaybı için izleyin.
- Karaciğer metastazını analiz etmek için insancılı uç noktalarına ulaştığında (ameliyattan yaklaşık 6 hafta sonra) hayvanı kurban edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sırasıyla IF ( Şekil 1A sağ panel) ve FACS (Şekil 1B) tarafından gözlenen epcam ve CD26 ifadeleri, CTC çizgisinin epitel olduğunu gösterir ve CSC ayırt edici özelliklerinden birini görüntüler10. Bu epitel özelliği, diğer epitel ve mezenkimal belirteçlere karşı yönlendirilen antikorlarla lekelenme ile daha da karakterize edilebilir. Böylece, CTC hattının epitel-mezenkimal eksen boyunca nerede olduğunu yaklaşık olarak bilmek mümkün olabilir. Diğer CSC belirteçlerinin ekspresyometrisi hem immünostaining hem de sitometri ile de test edilebilir. Aksi takdirde, ilaç direnci olarak fonksiyonel testler ve in vivo test başlatan tümör bu CSC fenotip10'unudoğrulayabilir. Burada örneğin, lüminesans canlılık tahlilleri, CTC IC50'ye sadece bu hücrelerin yüksek direncini vurgulayan yüksek ilaç konsantrasyonu ile ulaşılmasını göstermektedir (Şekil 2). Ayrıca, deri altı CTC enjeksiyonu bu CTC hattının tümörojenik yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 3A). Bu ikinci sonuçlar, bu CTC hattının CSC fenotipini doğrulamaz. 10 ila 10.000 hücre enjekte ederek tümör başlangıç kapasitesine meydan okumak tümörijenik yeteneğin tahminini iyileştirir. Son olarak, intrasplenik enjeksiyon yoluyla yayılmayı taklit ederek karaciğer metastaz oluşumu, bu CTC hattının uzak bir organda hayatta kalabileceğini ve metastatik bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 3B). Bu metastatik potansiyel diğer hücre hatları ile karşılaştırılabilir veya spesifik gen ekspresyonuna inhibe edilerek veya intrasplenik enjeksiyondan sonra farelerde kemoterapi uygulanarak zorlanabilir.
Şekil 1: CTC kürelerinin mikroskopi ve Akış sitometrisi analizi hem epitel hem de KSS belirteçlerini ifade ettiklerini göstermektedir. (A) Sol panel: CTC küreleri gömülmeden önce 6 gün boyunca kültürlenmiştir. Sağ panel: Histogel'deki gömülü CTC kürelerinin epifluoresans mikroskopi analizi. Gömülü CTC kürelerinin 5 μm bölümü epitel belirteci Epitel hücre yapışma molekülüne (EPCAM) karşı bir antikor ile boyandı ve çekirdek DAPI (mavi) ile etiketlendi. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. (B) Canlı tek CTC'lerin akış sitometri analizi. Sol üst FACS grafiği, boyut ve taneciklerine göre kapı hücrelerine etiketleme yapmadan CPC'leri gösterir. Sağ üst FACS çizimi, yalnızca canlı hücrelerin kapısına canlı bir işaretleyiciye sahip CPC'leri gösterir. Sol alt FACS çizimi, pozitif etiketli hücrelere APC konjuge izotip kontrolü ile etiketlenmiş CTC'leri gösterir. Sağ alt FACS grafiği, bu CSC işaretleyicisini ifade eden hücrelerin yüzdesini değerlendirmek için APC konjuge CD26 antikor tarafından etiketlenmiş CTC'leri gösterir (%67). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lüminesans canlılığı test edilerek hücre büyüme tahlilinin temsili sonucu. IC50'ye x μM'de ulaşılır.
Şekil 3: CPC'ler tümörojenik ve metastatik bir potansiyele sahiptir. (A) Çıplak farelerin sağ kanadına 200.000 CTC deri altı enjeksiyonu. Enjeksiyondan 1 ay sonra fotoğraflar çekildi ve tümör büyüklüğü haftada 3 kez ölçüldü. (B) Karaciğer metastatik kolonizasyonunu taklit etmek için CTC'lerin intrasplenik enjeksiyonu. Sağ panel: 300.000 CTC'nin intrasplenik enjeksiyonundan 4 hafta sonra parçalanan fare karaciğerinin temsili fotoğrafı. Sol panel: FARE Ciğeri PBS'nin intrasplenik enjeksiyonundan 4 hafta sonra parçalandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan protokol başlangıçta kolorektal CTC fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılmıştır, ancak meme kanseri gibi diğer kanser türleri için kullanılabilir ve fare modelleri için uyarlanabilir.
Gerçek sınırlayıcı faktör, kan örneğinde bulunan CTC sayısı ve bunları izole etmek ve genişletmek için kullanılan tekniğin verimliliğidir. Hücre boyutuna ve sıkıştırılabilirliğine göre CTC'lerin izolasyonunu sağlayan mikroakışkan bir cihaz olan Parsortix gibi belirli CTC özelliklerine dayanarak çeşitli CTC izolasyon teknikleritanımlanmıştır. Ek olarak, EpCAM ve sitokeratin 8/18/1914gibi pozitif epitel işaretleyici etiketlemesi ile birlikte kontamine lenfositleri ortadan kaldırmak için negatif bir CD45 etiketlemesine dayanan kan örneklerinde CTC'leri numaralandırmak için FDA onaylı tek yöntem olan immünobür bazlı bir test olan CellSearch vardır. iChip başka bir boyut tabanlı teknolojidir, ancak aynı zamanda EpCAM tabanlı pozitif seçim veya CD45 negatif tükenme15,16kullanarak CTC zenginleştirmesini birleştirir. Son olarak, son zamanlarda kolorektal kanser hasta kan örneklerinden CTC'yi izole etmek ve yükseltmek için hızlı ve kolay immünodensite prosedürü olan Rosette sep kitini kullandık10.
Bir fare modeli üzerinde çalışıyorsanız, CTC sayısını ve kültürde onları büyütme şansını artırmak için aynı kohorttan fare kanı örneklerini birleştirmek de mümkündür. Murine CTC'lerde, karaciğer kolonizasyonunu intrasplenik enjeksiyonla test etmek için immün yetmez farelerin kullanılması zorunlu değildir. Aynı genetik geçmişe sahip kontrol fareleri, bağışıklık yanıtının herhangi bir etkisi olmadan alıcı fareler olarak kullanılabilir.
CPC'ler süspansiyonda yükseltildikten sonra, burada açıklanan her teknik kullanılarak aynı kanser türünden diğer kanser hücre hatlarıyla karşılaştırılabilirler. Bu durumda, farklı kanser hücre hatları aynı koşullarda yetiştirilmelidir. İmmünofluoresans lekelenme ve sitotemetri analizi için doğuştan gelen oto-floresanlara özellikle dikkat edilmelidir. Kullanılan CTC'ler ve kullanılan her kanser hücresi hattı farklı floresan kanallarda herhangi bir lekelenme olmadan test edilmelidir.
Çalışma altındaki CTC'ler herhangi bir klasik hücre hattı gibi yapışan koşullarda yapışabilir ve çoğalabilirse, yukarıda açıklanan teknikler bu koşullarda genişletilen hücreler için uyarlanabilir. Elde edilen okumalar, hücrelerin süspansiyonda daha az farklılaşma eğiliminde olduğu için hücrelerin daha farklılaştırılmış kanser hücresi popülasyonlarından olduğu yerlerde muhtemelen daha alakalı olacaktır.
Sonuç olarak, CTC hatları, kanser öldürücülüğüne yol açan metastatik süreçlerde yer alan mekanizmaları derinlemesine karakterize etmek için çok değerli araçlardır ve gelecekte kültür başarı oranları iyileştikçe, CTC'ler her hastaya uyarlanmış en iyi terapötik stratejiyi önermek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak rakip çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Pannequin laboratuvarındaki bu araştırma projesi SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 » araştırma hibesi ile desteklendi. Guillaume Belthier ve Zeinab Homayed'in doktora tezleri anti-kanser ligi/Ligue contre le Cancer tarafından desteklendi. Céline Bouclier maaşı "bölge Occitanie" tarafından finanse edildi. julian Venables'a İngilizce düzenleme için teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M.
- Eger, A., Mikulits, W.
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
