Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הכנת מדגם לניתוח ביואינפורמטיקה של מתילציה DNA: אסטרטגיית האגודה להשמנת יתר ומחקרי תכונות נלוות

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

המחקר הנוכחי מתאר את זרימת העבודה לניהול נתוני מתילציה DNA המתקבלים על ידי טכנולוגיות microarray. הפרוטוקול מדגים שלבים מהכנה מדגמית לניתוח נתונים. כל ההליכים מתוארים בפירוט, והסרטון מציג את השלבים המשמעותיים.

Abstract

השמנת יתר קשורה ישירות לאורח החיים ונקשרה לשינויים במתילציה בדנ"א שעלולים לגרום לשינויים בתהליכי אחסון אדיפוגנזה ושומנים התורמים להתפתחות המחלה. אנו מדגימים פרוטוקול מלא מבחירה לניתוח נתונים אפיגנטיים של חולים עם ובלי השמנת יתר. כל השלבים מהפרוטוקול נבדקו ואומתו במחקר פיילוט. 32 נשים השתתפו במחקר, שבו 15 אנשים סווגו עם השמנת יתר על פי מדד מסת הגוף (BMI) (45.1 ± 5.4 ק"ג / מ"ר); ו -17 אנשים סווגו ללא השמנת יתר על פי BMI (22.6 ± 1.8 ק"ג / מ"ר). בקבוצה עם השמנת יתר, 564 אתרי CpG הקשורים מסת שומן זוהו על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית. אתרי CpG היו באזורי האמרגן. הניתוח הדיפרנציאלי מצא 470 CpGs hypomethylated ו 94 אתרים hypermethylated אצל אנשים עם השמנת יתר. המסלולים המועשרים ההיפותרתיים ביותר היו ב - RUNX, איתות WNT , ותגובה להיפוקסיה. המסלולים hypermethylated היו קשורים הפרשת אינסולין, איתות גלוקגון, ו Ca2 +. אנו מסיקים כי הפרוטוקול זיהה ביעילות דפוסי מתילציה DNA ומתילציה DNA הקשורים לתכונות. דפוסים אלה יכולים להיות קשורים עם ביטוי גנים שונה, המשפיעים על אדיפוגנזה ואחסון שומנים בדם. התוצאות שלנו אישרו שאורח חיים שמנה יכול לקדם שינויים אפיגנטיים בדנ"א האנושי.

Introduction

טכנולוגיות omics בקנה מידה גדול שימשו יותר ויותר במחקרים של מחלות כרוניות. מאפיין מעניין של שיטות אלה הוא הזמינות של כמות גדולה של נתונים שנוצרו לקהילה המדעית. לכן, עלתה דרישה לתקנן את הפרוטוקולים כדי לאפשר השוואה טכנית בין מחקרים. המחקר הנוכחי מציע סטנדרטיזציה של פרוטוקול כדי להשיג ולנתח נתוני מתילציה DNA, באמצעות מחקר פיילוט כדוגמה ישימה.

הוצאה שלילית על אנרגיה שולטת באורח החיים האנושי המודרני, מה שמוביל להצטברות מופרזת של רקמת שומן, וכתוצאה מכך להתפתחות של השמנת יתר¹. גורמים רבים הגבירו את שיעורי ההשמנה, כגון בישיבה, דיאטות עתירות קלוריות ושגרות מלחיצות. ארגון הבריאות העולמי (WHO) העריך כי 1.9 מיליארד מבוגרים סבלו מהשמנת יתר בשנת 2016, כלומר יותר מ -20% מאוכלוסיית העולם יש מעל 30 ק"ג / מ "ר2 BMI2. העדכון האחרון של 2018 גילה כי השכיחות של השמנת יתר בארצות הברית של אמריקה (ארה"ב) היה גבוה מ 42%3.

אפיגנטיקה היא הסתגלות מבנית של אזורים כרומוזומליים לרישום, איתות או הנצחת מצבי פעילות שהשתנו4. מתילציה DNA הוא שינוי כימי הפיך באתרי ציטוזין-גואנוסין dinucleotides (אתרי CpG), יצירת 5-מתילציטוצין-pG (5mCpG). זה יכול לווסת את ביטוי הגנים על ידי ויסות הגישה של מכונות שעתוק ל- DNA5,6,7,8. בהקשר זה, זה חיוני כדי להבין אילו אתרי CpG קשורים עם תכונות הקשורות להשמנת יתר9. גורמים רבים יכולים לתמוך או למנוע מתילציה DNA ספציפית לאתר. אנזימים נחוצים לתהליך זה, כגון מתיל-טרנספראזס DNA10 (DNTMs) ו-10-11 טרנסלוקציות (TETs), יכולים לקדם מתילציה או דמתילציה של דנ"א תחת חשיפות סביבתיות11.

בהתחשב בהתעניינות הגוברת במחקרי מתילציה DNA בשנים האחרונות, בחירת אסטרטגיית הניתוח המתאימה ביותר כדי לענות במדויק על כל שאלה הייתה דאגה חיונית של חוקרים 12,13,14. מערך מתילציה DNA 450K הוא השיטה הפופולרית ביותר, בשימוש ביותר מ 360 פרסומים14 לקביעת פרופיל מתילציה DNA. זה יכול לקבוע את המתילציה של עד 485,000 CpGs הממוקם ב 99% של הגנים הידועים15. עם זאת, מערך זה הופסק והוחלף ב- EPIC, המכסה 850,000 אתרי CpG. ניתן להחיל את הפרוטוקול הנוכחי הן עבור 450K והן עבור EPIC16,17,18.

הפרוטוקול מוצג צעד אחר צעד באיור 1 וכולל את השלבים הבאים: בחירת אוכלוסיה, דגימה, הכנת ניסויים, צינור מתילציה של דנ"א וניתוח ביואינפורמטיקה. מחקר פיילוט המבוצע במעבדה שלנו מוצג כאן כדי להמחיש את שלבי הפרוטוקול המוצע.

Figure 1
איור 1: סכמטי של הפרוטוקול המוצג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי של בית הספר לרפואה Ribeirão Preto של אוניברסיטת סאו פאולו (HCRP-USP) אישרה את המחקר (CAAE:14275319.7.0000.5440). המשתתפים חתמו על טופס ההסכמה, וכל ההליכים נערכו בעקבות הצהרת הלסינקי.

1. אוכלוסיה ודגימה

  1. גייסו משתתפים עם BMI >30 ק"ג/מ"ר למחקר. במחקר הנוכחי גויסו 32 נשים מאוכלוסיית תערובת19 בגילאי 18 עד 60.
    הערה: ב HCRP-USP, שיעורים גבוהים יותר של השמנת יתר נצפו בעיקר אצל נשים20. משתתפים עם השמנת יתר, עם BMI ≥30 ק"ג /m2 (n = 15), גויסו ממרפאת החוץ למחלות מטבוליות ב- HCRP-USP. המשתתפים ללא השמנת יתר, עם BMI בין 18.5 ק"ג /m2 ו 24.9 ק"ג / מ " מ"ר (n = 17), גויסו ממרפאות אחרות ולא היו מחלות קשות; נתונים קליניים מוצגים בטבלה 1.
  2. אל תכלול נשים בהריון, אמהות מניקות, מעשנות וצורכות אלכוהול.

2. אנתרופומטריה והרכב גוף

  1. מדוד את משקל המשתתפים באמצעות סולם אנתרופומטרי דיגיטלי של 200 ק"ג. הקפד להסיר נעליים ובגדים עודפים.
  2. להעריך גובה באמצעות stadiometer עם סיום 0.5 ס"מ. המשתתפים הונחו לעמוד יחפים, רגליים יחד וזרועות לצידם21.
  3. לאסוף את מסת השומן (FM) מידע באמצעות bioimpedance חשמלי. לאחר 12 שעות של צום, להעריך עם שלפוחית שתן ריקה. מניחים את המשתתפים בתנוחה סופית, עם רגליים בנפרד וזרועות מקבילות מבלי לגעת בגוף. הורה למשתתפים להסיר את כל אביזרי המתכת22.
  4. השג את היקף המותניים (WC) באמצעות סרט מדידה בלתי ניתן להעברה עם סיום לימודים של 0.1 מ"מ. הקלטת הונחה אופקית סביב המותניים האמצעיות, ממש מעל עצמות הירך. המדידה התרחשה מיד לאחר נשימה החוצה. על פי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), הניתוק WC לנשים הוא 88 cm23.

טבלה 1: מאפייני האוכלוסייה. כל המשתנים היו פרמטריים (p > 0.05, שפירו וילק), וההבדלים הוערכו באמצעות מבחן t עצמאי, שבו p < 0.05 נחשב משמעותי. *p < 0.0001. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

3. איסוף חומר ביולוגי

  1. לאסוף דם היקפי לאחר 12 שעות של צום, כפי שתואר בעבר24.
  2. לאסוף 4 מ"ל של כל דגימות הדם בצינורות איסוף עם נוגד קרישה (למשל, EDTA) ולאחסן אותם על קרח להובלה.

4. מיצוי דנ"א

  1. צנטריפוגה כל צינור המכיל את הדם ב 2,000 x גרם במשך 10 דקות. לאסוף סביב 300 μL של מעיל באפי (אינטרפאזה לבנה).
  2. לחלץ DNA מהדם ההיקפי באמצעות מכשיר זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), כפי שתואר בעבר25. לרומם את ה-DNA ב 480 μL של H2O אולטרה-pure.
  3. להעריך את ריכוז ה- DNA ואיכות באמצעות פלואורומטר. היושרה הוערכה באמצעות ניתוח ג'ל agarose 1%25. יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

5. הכנה לפני ניתוח מתילציה

  1. ודא כי הדגימות יש את ריכוז ה- DNA המינימלי (500 ng הוא הקלט הראשוני האידיאלי להתחיל), אבל דילול עשוי להשתנות בין דגימות בשלב זה.
  2. כמה ריאגנטים אינם כלולים בערכת microarray26, אז לרכוש אותם בנפרד27.
  3. בדוק אם הערכה מכילה את כל הריאגנטים המשמשים במהלך ההליך; אין להם תחליף. בדוק את תאריך התפוגה של כל הריאגנטים. ודא ריאגנטים אחרים ופתרונות שאינם מסופקים בערכה זמינים גם (95% פורממיד/ 1 מ"מ EDTA, 0.1 N NaOH, אתנול מוחלט, 2-propanol).
    זהירות: פורממיד הוא ריאגנט הפכפך; ניתן לשפר את איכות התוצאות אם המוצר טרי. היושרה והאיכות של פורממיד ואתנול מוחלט נחשבים קריטיים כי הם יכולים להשפיע על תהליך הכתמה המוצע על ידי היצרן. האלכוהול שנבחר חייב להיות מוצרים אולטרה-רפואיים ספציפיים לניתוח ביולוגיה מולקולרית.
  4. לאחר רכישת ערכת microarray, הורד את מפות פענוח השבבים (DMAPs). קבצים אלה זמינים באתר האינטרנט של היצרן 24-48 שעות לאחר הערכה נשלחת ואינם נכללים בתאריך התפוגה28. כדי להוריד את הקבצים שהוזכרו, בצע את השלבים שלהלן.
    1. ודא שמחשב עם גישה לאינטרנט זמין. בצע את ההורדה באמצעות לקוח קובץ פענוח התוכנה.
    2. לפני התקנת התוכנית, ודא שלמחשב יש גישה יוצאת ונכנסת שניתנה על-ידי המוסד; ללקוח קובץ הפענוח אין הגבלות אבטחה.
    3. היכנס לתוכנת לקוח קובץ פענוח באמצעות האפשרות Access by BeadChip. כניסה זו מתבצעת באמצעות מזהה המשתמש והסיסמה של MyIllumina. נדרשת הרשמה בדף זה28.
    4. לאחר הכניסה ללקוח קובץ פענוח, הזן את המידע המפורט להלן בשדות המתאימים שלהם בדף הבית של התוכנה28: רשימת ברקודים; רשימה של מזהי תיבות; מספר הזמנת רכש (PO); ומספר הזמנת מכירה (זכור לא לכלול את האותיות המופיעות אחרי המספרים).
    5. בחר את ה- DMAPs להורדה בהתאם למספר הברקוד בתיבת הרכישה וציין את היעד בתיבת הדו-שיח לשמירת ה- DMAPs.
    6. לחץ על הלחצן כדי להתחיל בהורדה.
      הערה: בסוף ההורדה, ודא שהתיקיות שהורדו אינן ריקות ואחסן את הקבצים בבטחה, מכיוון שהם יהיו נחוצים לשלב האחרון כדי להמיר את הניסויים לקבצי נתונים אינטנסיביים (קבצי IDAT). לאחר תאריך התפוגה, Illumina עשויה להסיר את נתוני DMAPs ממסד הנתונים המקוון שלה.

6. צינור מתילציה DNA

הערה: ניסוי המתילציה של הדנ"א מחולק לארבעה ימים (איור 1). פעל בהתאם להמלצות היצרן ולמפרטים כדי להשיג תוצאות מדויקות.

  1. יום 1: טיפול ביסולפיט
    1. התחל על ידי denaturing 500 ng של DNA גנומי, ולאחר מכן להוסיף את ריאגנטים ההמרה. כדי לבצע שלב זה, בצע את ההמלצות של ערכות bisulfite ו microarray29.
    2. לטפל בדנ"א הפגום עם 130 μL של ריאגנט המרה bisulfite בריכוז הסטנדרטי המסופק על ידי היצרן.
    3. דגירה את הצינור בתרמוציקלר במשך 16 מחזורים ב 95 °C (95 °F) עבור 30 s ו 50 °C (50 °F) עבור 1 שעות. רמפה את התרמוציקלר ל 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
    4. בצע את שלב הכביסה על ידי הוספת 100 μL של מאגר הכביסה ולאחר מכן צנטריפוגה במלוא המהירות במשך 30 שניות. הריכוז אינו מסופק במדריך למשתמש, והיצרן מתקן את אמצעי האחסון.
      הערה: ריאגנט זה מגיע עם הערכה ואינו צריך להיות מדולל או מוכן.
  2. יום 2: הגברה - בדיקת מתילציה, פרוטוקול ידני
    1. מחממים את תנור ההיברידיזציה ל-37 מעלות צלזיוס ומניחים לטמפרטורה להשתוות.
    2. החל תווית ברקוד על לוחית מיקרו-לוחית בגודל 0.8 מ"ל.
    3. הפשירו את ריאגנטים ההגברה (תערובת הגברה רב-מדגמית 1, תערובת פריימר אקראית ותערובת מאסטר אמפר רב-מדגמית) בטמפרטורת החדר (ריאגנטים אלה מגיעים עם הערכה ואינם צריכים להיות מדוללים או מוכנים). לאחר מכן, לבצע היפוך עדין לפחות 10x עד התוכן כולו של הצינורות מעורבבים.
    4. יש לחלק 20 μL של תערובת הגברה רב-מדגמית 1 (MA1) לתוך הבארות של הצלחת.
    5. העבר 4 μL של דגימת ה- DNA מהצלחת המומרת ביסולפיט לבארות המתאימות על צלחת 0.8 מ"ל. בשלב זה, להקליט את מזהה דגימת ה- DNA המקורית בטופס מעקב המעבדה המתאים לבארות הצלחת.
    6. יש לפזר 4 μL של 0.1 N NaOH לכל באר של הצלחת המכילה את תערובת ההגברה הרב-מדגמית 1 (MA1) ואת דגימת ה- DNA.
    7. לאטום את הצלחת עם חותם פלסטיק.
    8. מערבולת את הצלחת לערבב את הריאגנטים עם הדגימות ב 1,600 סל"ד במשך 1 דקות. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר בזהירות את החותם.
    9. פיפטה 68 μL של תערובת פריימר אקראית (סל"ד) לתוך כל באר של הצלחת. Pipette 75 μL של תערובת מאפר מאסטר רב מדגמית (MSM) לתוך כל באר של הצלחת (מבלי להסיר את הפתרון הקודם). השתמש בחותם חדש כדי לכסות את הצלחת.
      הערה: יש להקפיד לשלב את הבארות עם הצלחת ולכוון אותה כראוי.
    10. מערבולת את הצלחת האטומה ב 1,600 סל"ד במשך 1 דקה. דגירה בתנור הכלאה עבור 20-24 שעות ב 37 °C (50 °F).
  3. יום 3: הכלאה - בדיקת מתילציה, פרוטוקול ידני
    1. מחממים את הבלוק ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. להפשיר את התוכן של הצינור בטמפרטורת החדר. בזהירות ובעדינות להפוך את צינורות פתרון הפיצול (FMS) לפחות 10x כדי לערבב ביסודיות את התוכן.
    3. מוציאים בזהירות את הצלחת מתנור ההיברידיות. דופק-צנטריפוגה הצלחת ב 280 x g.
    4. עכשיו להסיר את החותם מהצלחת. בכל באר של הצלחת המכילה מדגם, להוסיף 50 μL של פתרון פיצול (FMS) ולאטום את הצלחת שוב. מערבולת את הצלחת ב 1,600 סל"ד במשך 1 דקה.
    5. צנטריפוגה הצלחת ב 280 x g במשך כמה שניות (לבצע צנטריפוגת דופק). לאחר מכן, מניחים את הצלחת האטומה על בלוק החימום ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעות.
    6. אם הוחלט להשהות את הניסוי ולהקפיא את הצלחת, להפשיר אותו בטמפרטורת החדר, ולצנטריפוגה ב 280 x g. אם הוא אינו קפוא, דלג על שלב זה ועבור לשלב 6.3.7.
    7. יש להשאיר את בלוק החימום לחימום מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
    8. השאירו את מאגר הכביסה להפשיר בטמפרטורת החדר. כאשר מופשר, להפוך אותו לפחות 10x כדי לערבב את התוכן.
    9. מוציאים את החותם מהצלחת.
    10. הוסף 100 μL של פתרון משקעים (PM1) לכל באר של הצלחת המכילה דגימות.
    11. לאטום את הצלחת שוב עם החותם.
    12. מערבולת את הצלחת ב 1,600 סל"ד במשך 1 דקה.
    13. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    14. לאחר מכן, מניחים בצנטריפוגה דופק ב 280 x g במשך 1 דקה.
      הערה: הגדר את הצנטריפוגה ב 4 °C (50 °F) לשלב הבא.
    15. בזהירות להסיר את החותם מהצלחת ולהשליך אותו.
    16. הוסף 300 μL של 2-propanol (100%) לכל באר המכילה את המדגם.
    17. לאטום את הצלחת בזהירות רבה באמצעות חותם חדש. תיזהר לא לנער את הצלחת.
    18. הפוך את הצלחת לפחות 10x, ערבוב התוכן כולו.
    19. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    20. צנטריפוגה ב 3,000 x g ב 4 °C (4 °F) במשך 20 דקות.
      הערה: בסוף שלב 6.3.20, הסר מיד את צלחת הצנטריפוגה.
    21. מוציאים את החותם מהצלחת ומשליכים אותו.
    22. במהירות להפוך את הצלחת ולנקז את הנוזל על כרית כדי להשליך את supernatant. לאחר מכן, הכה את הצלחת באזור יבש על מגבת נייר כדי לנקז את הנוזל.
    23. הקש בחוזקה מספר פעמים במשך 1 דקה או עד שכל הבארות חופשיות מכל נוזל.
    24. השאר את הצלחת הפוכה וחשופה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      הערה: הוא צפוי לראות כדורים כחולים בתחתית הבארות.
    25. מחממים את תנור ההיברידיזציה ל-48 מעלות צלזיוס.
    26. הפעילו את בלוק החום כדי לחמם מראש. אפשר 20 דקות לתהליך זה.
    27. הפשרת Resuspension, הכלאה, ופתרון לשטוף בטמפרטורת החדר. הפוך לפחות פי 10. ודא כי אין מלח מושקע בתמיסה.
    28. הוסף 46 μL של Resuspension, Hybridization, ופתרון לשטוף (RA1) לכל באר של הצלחת.
      הערה: כל הריאגנטים הנותרים חייבים להיות שמורים לשלבי ההכתמה וההכלאה.
    29. החל את החותם על הצלחת. השתמש אטם אלומיניום כדי לכסות את הצלחת. החזק חזק כדי לבצע את האיטום באופן שווה.
    30. בדוק אם כל הבארות סגורות בבטחה כדי למנוע אידוי.
    31. מניחים בזהירות את הצלחת האטומה החדשה בתנור ההיברידיזציה ודגורים בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    32. מערבולת את הצלחת ב 1,800 סל"ד במשך 1 דקה.
    33. צנטריפוגת דופק ב 280 x g.
    34. מעבירים את הצלחת לבלוק החום בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    35. הכן את חדרי הכלאה (Hyb) על ידי הצבתם יחד. חלוקת 400 μL של חוצץ לחות (PB2) לתוך המאגרים של חדרי Hyb. שים את המכסה על באופן מיידי.
    36. טען כל דגימה מהצלחת לפתח הכניסה לדוגמה של המיקרו-אריה.
    37. טען את התוספות של חדר Hyb המכילות את המיקרו-אריות לתוך חדר Hyb. סגור את חדר Hyb חוצה כדי למנוע הסטה אפשרית של חדר Hyb.
      הערה: הייב צ'יימברס צריך להיות דגירה ב 48 °C (48 °F) לפחות 16 שעות, אבל לא יותר מ 24 שעות.
  4. יום 4: מכתים - בדיקת מתילציה, פרוטוקול ידני
    1. תוסיפו מחדש את תמיסת הכתמים 4 עם 330 מ"ל של 100% EtOH, ולקבל נפח סופי של 350 מ"ל. יש לנער את בקבוק המכתם 4 במרץ כדי להבטיח התחדשות מלאה. יש לשמור בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לאחסן פתרון מכתים 4 למשך עד שבועיים בטמפרטורה שבין 2 °C (60 °F) ל-8 °C (8 °F).
    2. מוציאים את התאים מתנור ההיברידיזציה ומאפשרים להם להתקרר על הספסל במשך 30 דקות לפני הפתיחה.
    3. בזמן שחדר Hyb מתקרר, מלאו שני מיכלי כביסה ב-Wash Buffer (200 מ"ל לכל מיכל כביסה). זכור לתייג כל מיכל כ"מאגר כביסה" (PB1 ו- PB2).
    4. מלאו את אביזרי היישור של המיקרו-אריה ב-150 מ"ל של מאגר כביסה.
    5. הפרד את מרווחי הפלסטיק, ואם יש צורך, לנקות את הזכוכית.
    6. כדי לשטוף את שקופיות microarray, לחבר את לולאת החוט לרשת ולטבול את הציוד נוטף במיכלים עם 200 מ"ל של לשטוף חוצץ בסך הכל 10x.
    7. הסר את כל התוספות מתא ההיברידיזציה והסר כל מערך מההוספות. הסר את החותם.
      הערה: במהלך ההסרה, אין לגעת במטריצות החשופות.
    8. בעת הסרת שקופיות microarray מתא הכלאה, להיזהר לא לשפוך שום דבר.
    9. לשטוף את microarrays בתמיסת מאגר לשטוף (PB1) לאט ובקלילות, נע למעלה ולמטה 10x. עבור לפתרון PB1 טרי ובצע את הכביסה על ידי הזזה איטית של המיקרו-אריות 10x למעלה ולמטה בתמיסה.
    10. הסר את microarray מן המיכל ולאשר את היעדר שאריות.
    11. השתמש במרווח שקוף בחלק העליון של כל מיקרו-אריה והנחה את המרווחים למיקומים המתאימים.
      הערה: הקפידו להשתמש רק במרווחים השקופים, לא בלבנים.
    12. מקם את סרגל היישור על אביזר היישור.
    13. מניחים לוחית אחורית מזכוכית על החלק העליון של מרווח הברור; היזהר לכסות את כל המיקרו-אריה. לאחר מכן, חבר מהדקי מתכת לתאי הזרימה. במידת הצורך, השתמש במספריים כדי לקצץ את הקצוות של מרווחי תא הזרימה.
    14. לשטוף מיד את מאגרי תא הכלאה באמצעות ddH2O ולשפשף עם מברשת ניקוי קטנה. אין לאפשר למאגר בעל לחות כלשהי להישאר במאגר.
    15. עבור לשלב הבא שאחראי על Microarray הרחבה והכתמה.
      הערה: השאר את כל תאי הזרימה המותקנים אופקית על ספסל המעבדה. לטפל בהם מחדש רק כאשר כל שלב ההכתמה מוכן. מחממים את פתרון Resuspension, Hybridization ו-Wash לטמפרטורה שבין 20 °C (20 °F) ל-25 °C (60 °F). מערבבים בעדינות עד שלא רואים קריסטל בתמיסה.
    16. הנח את הריאגנטים בארון תקשורת ברצף. אם כל קפואים, להשאיר אותם בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להפוך אותם לפחות 10x לערבב את הפתרונות.
    17. מלאו את מחזור המים לרמה המתאימה.
    18. הפעל את המשאבה והגדר את הטמפרטורה ל 44 °C (65 °F).
    19. הסר את כל הבועות המחוברות למתלה התא.
    20. בצע בדיקות על מדף התא באמצעות בדיקת טמפרטורה. כל המיקומים שנבדקו חייבים להיות בין 44 °C (5 °F) ± 0.5 °C (5 °F).
      הערה: יש לבצע את השלבים הבאים ללא הפרעה.
    21. כאשר המתלה מגיע לטמפרטורה של 44 °C (44 °F), למקם במהירות כל הרכבה בתא הזרימה.
      הערה: עבור השלבים הבאים, פיפטה כל הריאגנטים לתוך צלחת הזכוכית האחורית.
    22. פיפטה 150 μL של Resuspension, Hybridization, ופתרון לשטוף (RA1). לאחר מכן, דגירה במשך 30 דקות. חזור על שלב זה בסך הכל 5x.
    23. פיפטה 450 μL של פתרון כתמים 1 (XC1) ודגר במשך 10 דקות.
    24. פיפטה 450 μL של פתרון כתמים 2 (XC2) ודגר במשך 10 דקות.
    25. פיפטה 200 μL של תערובת מאסטר הארכה דו-צבעית (TEM) ודגור במשך 15 דקות.
    26. פיפטה 450 μL של 95% פורממיד/ 1 מ"מM EDTA ודגר במשך 1 דקה.
    27. דגירה במשך 5 דקות.
    28. הפחיתו את הטמפרטורה של ארון התקשורת התאי ל-32 °C (המצוין בתערובת מאסטר סופריור בשני צבעים).
    29. פיפטה 450 μL של כתמים פתרון 3 (XC3) ודגור במשך 1 דקות. חזור על 1x.
    30. המתן למתלה בתא כדי להגיע לטמפרטורה הנכונה.
      הערה: כדי לקרוא את התמונה microarray מיד לאחר תהליך הצביעה, הפעל את הסורק בשלב זה.
    31. עכשיו לוותר 250 μL של מעולה שני צבעים מאסטר לערבב (STM), ואחריו דגירה של 10 דקות.
    32. לאחר מכן, לחלק 450 μL של פתרון כתם 3 (XC3), ואחריו 1 דגירה דקה. חזור על 1x.
    33. המתינו 5 דקות ולאחר מכן הוסיפו 250 μL של תערובת מאסטר נגד כתמים 2 צבעים (כספומט) ודגרו במשך 10 דקות.
    34. עכשיו לוותר 250 μL של מעולה שני צבעים מאסטר לערבב (STM), ואחריו דגירה של 10 דקות.
    35. לאחר מכן, לחלק 450 μL של פתרון כתם 3 (XC3), ואחריו 1 דגירה דקה. חזור על 1x.
    36. המתינו 5 דקות.
    37. הוסיפו 250 μL של תערובת מאסטר (כספומט) נגד כתמים 2 צבעים ודגרו במשך 10 דקות.
    38. מוסיפים 450 μL של פתרון Microarray כתם 3 (XC3) ודגור במשך 1 דקה, ולאחר מכן לחזור שוב.
    39. המתינו 5 דקות.
      הערה: בצע את ערכת החזרות הבאה: שלב 6.4.34., שלב 6.4.35. ושלב 6.4.36;; שלב 6.4.37., 6.4.38., ושלב 6.4.39.; שלב 6.4.34., שלב 6.4.35., ושלב 6.4.36.
    40. עכשיו, מיד להסיר את תאי הזרימה מהמדף ולהניח אותם בזהירות אופקית על ספסל המעבדה. ודא שהטמפרטורה היא הסביבה.
    41. 6.4.41.מניחים 310 מ"ל של פתרון כביסה (PB1) עבור כל microarray במיכל כביסה.
    42. הסר את מלחצי המתכת ואת הזכוכית, ולבסוף, את microarray.
    43. מניחים את microarrays על מתלה כתמים ומניחים אותם במיכל הכביסה המכיל פתרון PB1 10x. ודא כי הברקודים פונים הרחק ממי שמטפל בהם וכי כל microarrays שקועים.
    44. לנוע לאט ובקלילות עם תנועות למעלה ולמטה 10x. יש להסיר את המיקרו-ארי לחלוטין מהפתרון לפני שהוא שקוע שוב. לאחר מכן, תן לו להישאר שקוע במשך 5 דקות.
    45. ניערו במרץ את ריאגנט הכתמים 4 (XC4) כדי להבטיח התחדשות מוחלטת. מניחים 310 מ"ל של XC4 לתוך מיכל כביסה.
      הערה: אל תתנו לפתרון לשבת במיכל הכביסה במשך יותר מ -10 דקות.
    46. הזיזו קלות את מעמד הכתמים למיכל השני עם XC4.
    47. לנוע לאט ובקלילות עם תנועות למעלה ולמטה 10x. ודא שהמיקרו-אריה תוסר לחלוטין מהפתרון לפני שתשקע שוב.
    48. לאחר מכן, תן microarray להישאר שקוע במשך 5 דקות.
    49. הזז את בולט הכתם מתוך הפתרון ומניחים אותו במחזיק צינור עם הברקודים פונים כלפי מעלה.
    50. הסר בזהירות את microarray באמצעות מלקחיים נעילה ומניחים אותם על מדף לייבוש.
    51. ייבשו אותם באמצעות מייבש ואקום במשך 50-55 דקות ב 675 מ"מ כספית (0.9 בר).
    52. נקו את החלק האחורי של כל מיקרו-אריה באמצעות EtOH.
      אזהרה: הימנעו מלגעת בפסים, ואל תאפשרו ל-EtOH לטפטף על הפסים בכל דרך שהיא.
    53. המשך לצלם את המיקרו-ארי.
    54. יש לאחסן בזהירות את המיקרו-ארי בקופסת אחסון בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש לצלם תמונות Microarray בתוך 72 שעות.

7. ניתוח ביואינפורמטיקה

הערה: יש צורך לשנות כמה תכונות של סוג של microarray (למשל, arraytype = "450k" צריך להיות מוחלף על ידי arraytype = "EPIC"). מחבר צינור ChAMP מתאר בפירוט את כל השדות שיש לשנות כדי לנתח מערכים בדף מוליכים ביולוגיים של החבילה30.

  1. גיליון לדוגמה
    1. העבר את קבצי IDAT למחשב כדי להמשיך בניתוח ביואינפורמטיקה31. צור גיליון לדוגמה כדי לבצע את ניתוח הנתונים31.
      הערה: שלוש עמודות חיוניות עבור קובץ גיליון אלקטרוני זה. הראשון הוא Sample_name. עמודה זו חייבת לכלול את השמות או הקודים המשמשים לזיהוי הדגימות. השני הוא Sentrix_position. עמודה זו ממקמת את R01C01 המתאים של הדגימות, כאשר R01 אחראי לשורת השבב ולעמודה המכונה C01. העמודה החיונית השלישית היא Sentrix_ID, והיא אחראית לקבלת המספר המזהה את המיקרו-אריה. הקפד לשים את המספרים הנכונים. ניתן להוסיף מידע נוסף בגיליון לדוגמה כערכים משתנים. בניסוי הנוכחי נכללו נתונים מניתוח המתכת.
  2. צינור ChAMP
    1. התקן RStudio (V.4.0.2) במחשב כדי לבצע את הניתוח30.
      הערה: ודא שלמחשב יש לפחות 8 גר' זיכרון RAM. ניתוח נתונים ייאבק או יקרוס עם כמות נמוכה יותר של זיכרון RAM.
    2. לאחר ההתקנה, פתח את RStudio והתקן את חבילת המוליכים הביולוגיים ChAMP30 באמצעות שורת הפקודה המתאימה (ראה חומר משלים 1).
      הערה: אם יש שגיאה כלשהי בסוף ההתקנה, התקן את ספריות ChAMP הנדרשות באופן ידני, אחת אחרי השנייה.
    3. עכשיו, לייבא את הנתונים הגולמיים ולבצע את הניתוח. ראה חומר משלים 1.
      champ.load() מייבא את הנתונים הגולמיים ועושה את תהליך הסינון, למעט בדיקות עם pval זיהוי נמוך, אתרי multihit, בדיקות שאינן CG, אתרי CpG ליד SNPs, ו CpGs הממוקם בכרומוזומים מיניים.
      champ.impute() מבצע אימפוטנציה של KNN כברירת מחדל.
      אלוף. QC מאחזר גרפים של איכות נתונים (לדוגמה, גרף התוויית צפיפות).
      אלוף. SVD מעריך אפקטי אצווה בהתבסס על מטה-נתונים שסופקו בגיליון לדוגמה.
      champ.refbase() מבצע הערכה ותיקון של סוג התא.
      אלוף. DMP () מאחזר עמדות מתילציה דיפרנציאלית ואסוציאציות תכונה כגון מסת שומן כדי לבדוק את מתילציה DNA בין קבוצות ולשנות את הפרמטרים, כפי שמוצג בחומר משלים 1.
  3. העשרה (מסד נתונים של מחרוזת)
    הערה: העשרה פונקציונלית משמשת להסקת הפונקציות הביולוגיות של קבוצה של גנים.
    1. כדי להעשיר נתונים במחרוזת, בחר את רשימת היעדים להעשרה ולהשתמש בהם כקלט מ: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. עבור אורגניזם, בחר הומו ספיינס ולחץ על כפתור החיפוש.
    3. כדי לנווט דרך ההעשרה, לחץ על לחצן ניתוח.
  4. שליחת GEO
    1. הפקיד את הנתונים למאגר ציבורי כמו GEO של NCBI. לשם כך, הירשם לחשבון השולח.
      הערה: השלם את השליחה GEO (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) על-ידי הורדת גיליון המטה-נתונים עם מידע ופרוטוקולים תיאוריים עבור הניסוי הכולל ודגימות בודדות. ניתן ליצור שליחות ארכיון GEO בכל תוכנת גיליון אלקטרוני. שנית, הוסף את קובץ הנתונים הגולמי שנוצר מקובץ ה- Script של ספירת התאים עבור כל הספריות לספריה. IDAT וקבצים משויכים או גליון עבודה של מטריצה מכילים נתונים שאינם מנורמלים. התיקיה השלישית היא קבצי הנתונים המעובדים. טבלת המטריצה היא גיליון אלקטרוני המכיל את הערכים הסופיים והמנורמלים הדומים בין שורות ודוגמאות ועדיף מעובדים כמתואר בכל כתב יד נלווה.
    2. מקם קבצי נתונים מעובדים שנוצרו מקובץ ה- Script של ספירת שומרי התאים עבור כל הספריות בספריה. השתמש באישורי שרת FTP של שולח GEO כדי להעביר את הספריה המכילה את כל שלושת הרכיבים.

Representative Results

לאחר השימוש בצינור ChAMP, 409,887 בדיקות נחשבו בניתוח לאחר כל המסננים (CpGs לא מסויגים, בדיקות שאינן CG, CpG ליד SNPs, אתרים מרובי הלחמים, ו- CpGs הקשורים ל- XY); ערכה מיוצגת באיור 2.

Figure 2
איור 2: צינור של ניתוח הביו-אינפורמטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

יתר על כן, עלילת הצפיפות גילתה כי כל הדגימות היו צפיפות דומה של התפלגות ביתא הקשורים לשלבי בקרת איכות. ניתוח זה מעריך את ההתפלגות של ערכי ביתא ומציין אם יש דוגמאות שיש לכלול. באצווה זו, לא נכללו דגימות בהתבסס על ניתוח זה.

Figure 3
איור 3: ערכת צפיפות ערכי ביתא המתקבלת באמצעות חבילת ChAMP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח פירוק הערך הייחודי (SVD) שימש לאימות הרכיבים העיקריים שהשפיעו באופן משמעותי על השתנות נתוני מתילציה של DNA. מהנתונים עולה כי ל-BMI, WC (עמ' < 1e10-5) ו-FM (עמ' < 0.05) הייתה השפעה משמעותית על השונות בנתונים (איור 4).

Figure 4
איור 4: ניתוח פירוק ערך יחיד. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הערכת סוג התאים גילתה כי הן תאי הרוצח הטבעיים (NK) והן תאי B היו גבוהים יותר אצל נשים שמנות (איור 5).

Figure 5
איור 5: שברי תאים המוערכים בשיטתו של האוסמן. גראן: גרנולוציט. CD4T: עוזר תא T, לימפוציט. CD8T: תא T ציטוטוקסי, לימפוציט. מונו: מונוציט. תא B: לימפוציט B. תאי רוצח טבעיים, לימפוציטים. *p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רמות מתילציה DNA בין נשים שמנות ולא שמנות היו שונות לפני ואחרי תיקון סוג התא. לפני תיקון נתוני מתילציה DNA עבור סוגי תאים, 43,463 עמדות מתילציה דיפרנציאלית (DMPs) נצפו, ו 3,329 CpGs נשאר משמעותי לאחר. 445 אתרי CpG היו באזורים בין-מגנניים (IGR), ו-2,884 היו באזורים מגנים, כאשר רובם באזור האמרגן (n = 1,438). ההתפלגות לאורך כל האזורים הייתה TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), אקסון ראשון (n = 273), גוף (n = 724) ו- 3'UTR (n = 59). בהתחשב בערכים של Δβ <-0.05 ו->0.05, 162 CPGs היו hypomethylated ו 576 היו hypermethylated בהשמנת יתר בהשוואה לאנשים שאינם שמנים (איור 6). הנתונים זמינים במסד הנתונים GEO תחת קוד הרישום GSE166611.

Figure 6
איור 6: עמדות מתילציה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן להעריך את המתילציה השונה בין קבוצות ולמצוא אתרי CpG הקשורים לתכונות ספציפיות במחקרי מתילציה. עבור מחקרים המוני שומן, 13,222 אתרי CpG נמצאו. 6,159 CPGs באזור האמרגן היו קשורים למסת השומן, עם 470 היפרמתילציה ו-94 היפומתילציה (איור 7), והגנים המתאימים הועשרו (טבלה 2).

Figure 7
איור 7: אזורים מקדמים של גנים היפומתילציה והיפרמתילציה, הקשורים באופן עצמאי למסת השומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 2: העשרה פונקציונלית של הגנים מאתרי CpG המתיללים באופן דיפרנציאלי. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

חומר משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מערכי מתילציה של דנ"א הם השיטות הנפוצות ביותר לגישה למתילציה של דנ"א בשל יחס העלות-תועלת שלהם14. המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול מפורט באמצעות פלטפורמת microarray זמינה מסחרית כדי להעריך מתילציה DNA במחקר פיילוט שבוצע בקבוצה ברזילאית. התוצאות שהתקבלו ממחקר הפיילוט אישרו את האפקטיביות של הפרוטוקול. איור 3 מציג את השוואת המדגם ואת ההמרה המלאה של ביסולפיט32.

כשלב בקרת איכות, אלגוריתם ChAMP המליץ על אי הכללה של אתרי CpGs במהלך תהליך הסינון. המטרה של אי הכללת בדיקות היא לשפר את ניתוח הנתונים ולחסל הטיה. CpGs באיכות נמוכה (p-ערכים נמוכים מ 0.05) הוסרו כדי למנוע רעש ניסיוני בערכת הנתונים. המטרות נותרו מועברות בניתוח עלילת הצפיפות. Zhou33 תיאר את החשיבות של סינון CpGs ליד SNPs כדי למנוע אי התאמות, פרשנות שגויה של מתילציה של ציטוזין פולימורפי, וגרימת צבע מתג מסוג I בדיקה עיצוב34. כמו כן, כמו כרומוזומי XY מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי הטבעה, הייס ו Just35 חיזק את החשיבות של סינון בדיקות אלה כי, אצל נקבות, הבעיות עם הכלאה עשויות להיות גורמים מבלבלים35.

תאריך התפוגה של DMAPs, תאריך הפתיחה של פורממיד, האיכות האנליטית של האתנול המוחלט, וספירת הלאוקוציטים הכוללת נחשבים לשלבים קריטיים בפרוטוקול.

יתר על כן, על פי התצפיות שלנו, הערכת סוג התא חיונית בביצוע ניתוח הביו-אינפורמטיקה. שיטת האוסמן מבצעת את הערכת סוג התא כמתואר במחקרו של טיאן30. שיטה זו מבוססת על 473 אתרי CpG ספציפיים שיכולים לחזות את האחוזים של סוגי התאים החשובים ביותר, כגון גרנולוציטים, מונוציטים, תאי B ותאי T36. השתמשנו בפונקציה המומלצת "myRefbase" מחבילת ChAMP. לאחר ההערכה, אלגוריתם ChAMP מתאים את ערכי הביתא ומבטל הטיה זו מקבוצת הנתונים. צעד זה חיוני במחקרים המתמקדים בהשמנת יתר מכיוון שלאוכלוסייה זו יש הבדל ניכר בתאי הדם הלבנים בשל מצבם הדלקתי הכרוני.

שינינו רק את מפת המכסה המקורית עבור חותם ה- PCR המשותף לגבי שינוי שיטה ופתרון בעיות. לאחר כל תהליך צנטריפוגה, החותם השתנה עבור אחד חדש. לא יכולנו להשתמש באיטום החום הסטנדרטי והתאמנו אותו באמצעות רדיד אלומיניום סביב הצלחת.

למרות בדיקות מסחריות נחשבו תקן זהב למחקרים אפיגנטיים, מגבלה אחת של הפרוטוקול יכול להיות הספציפיות של ריאגנטים וציוד ממותג ייחודי37,38,38,39,40. מגבלה נוספת היא היעדר אינדיקטורים המאפשרים זיהוי של ההתקדמות הנכונה של הניסוי41.

התקינה של הפרוטוקול הנוכחי מייצגת מדריך נהדר למחקר אפיגנטי, הפחתת טעויות אנוש במהלך התהליך ומאפשר ניתוח נתונים מוצלח והשוואה בין מחקרים שונים.

על פי התוצאות שלנו, ניסויי מתילציה DNA מתאימים למחקרים השוואת אנשים עם וללא השמנת יתר43. כמו כן, ניתוח הביו-אינפורמטיקה המוצע סיפק נתונים באיכות גבוהה וניתן היה לשקול אותו במחקרים בקנה מידה גדול.

באמצעות ניתוח SVD, זיהינו כי התכונות הקשורות להשמנת יתר (BMI, WC, ו- FM) השפיעו על השונות בנתוני מתילציה DNA. כתוצאה משמעותית, הערכת סוג התא מצביעה על כך שתאי הרג הטבעיים (NK) ותאי B היו גבוהים יותר אצל נשים עם השמנת יתר מאשר אצל נשים ללא השמנת יתר (איור 5). ספירות גבוהות יותר של תאים אלה יכול להיות מוסבר על ידי מצב דלקתי בדרגה נמוכה של אנשים אלה44. ראינו כי חולים עם השמנת יתר יש hypo-ו hypermethylated CPGs באזורי מקדם של גנים הקשורים מסת שומן. רוב האתרים היו hypomethylated, אשר יכול להיות קשור לעלייה הטבעית של מינים חמצן תגובתי (ROS) רמות אצל אנשים אלה. מצב עקה חמצוני זה עשוי לקדם את ההפרעה גואנין באתר dinucleotide, יצירת 8-הידרוקסי-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), וכתוצאה מכך 5mCp-8-OHdG dinucleotide אתר, גרימת גיוס אנזימי TET. כל האירועים האלה יכולים להיות אחראים לקידום hypomethylation DNA היפרמתילציה על ידי מנגנונים שונים של פעולה45.

בנוסף, נראה כי שיעור אדיפוגנזה עולה אצל אנשים עם השמנת יתר, עם כ -10% מהתאים החדשים לתאים ישנים46,47. תרומות אפיגנטיות, המדגישות את הסביבה ההשמנה, יכולות לשנות את שיעורי ההתפשטות וההבחנה של התאים, לטובת התפתחות מסת השומן48. שינויים אפיגנטיים יכולים גם להשפיע על תוכניות אדיפוגניות, להקל או להגביל את התפתחותם. גורמי שעתוק ראשוניים (PPARγ או C / EBPα) או הרכבה של מתחמי מולטי-פרוטאין, הממוקמים באזורי מקדם במורד הזרם המופעלים על ידי הכללה או אי-הכללה של אנזימים לשינוי אפיגנטי, מווסתים את ביטוי הגנים באמצעות היפר-או היפומתילציה45. מסלול PPARγ תואר בעבר כדי לשנות את מסלול WNT, אשר היו גנים מועשרים במחקר זה. למרות שזה עדיין לא ידוע איך איתות WNT מתרחשת במהלך אדיפוגנזה, מחקרים אחרונים דיווחו כי זה יכול להיות תפקידים חיוניים בחילוף החומרים adipocyte, במיוחד תחת תנאים שמנים49.

Disclosures

למחברי מאמר זה אין ניגודי עניינים ואין להם גילוי פיננסי להצהיר.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ליואן טיאן, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) על היותו זמין לענות על כל הספקות לגבי חבילת ChAMP. אנו מודים גם לגילהרמה טלס, Msc. על תרומתו הן לנושאים הטכניים והן לנושאים המדעיים ממאמר זה; הוא עשה שיקולים חשובים לגבי אפיגנטיקה וטכניקות לכידת וידאו ועיצוב (guilherme.telles@usp.br). מימון חומרים מתכלים: קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP) (#2018/24069-3) והמועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq: #408292/2018-0). מימון אישי: (FAPESP: #2014/16740-6) ותוכנית מצוינות אקדמית מהתיאום לפיתוח סגל ההשכלה הגבוהה (CAPES:88882.180020/2018-01). הנתונים יהיו זמינים לציבור ובחופשיות ללא הגבלה. התאמת כתובת ל- NYN (דואר אלקטרוני: nataliayumi@usp.br) או CBN (דואר אלקטרוני: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).

Tags

גנטיקה בעיה 183 מתילציה DNA השמנת יתר ChAMP ביואינפורמטיקה אפיגנטיקה מסת שומן מדד מסת הגוף
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter