Summary
Describimos una técnica de disección que preserva la arquitectura de la unión neuromuscular y permite un estudio inmunocitoquímico detallado de las neuronas motoras en la pierna adulta de Drosophila .
Abstract
Drosophila melanogaster representa un modelo genéticamente tratable para estudiar la estructura y función neuronal, y los cambios posteriores en los estados de enfermedad. La unión neuromuscular larvaria bien caracterizada se utiliza a menudo para tales estudios. Sin embargo, el rápido desarrollo larvario seguido de histólisis muscular y remodelación del sistema nervioso durante la metamorfosis hace que este modelo sea problemático para el estudio de cambios degenerativos lentos dependientes de la edad como los que ocurren en la esclerosis lateral amiotrófica. Alternativamente, las moscas adultas viven durante 90 días y la pata adulta se puede usar para estudiar los cambios en las neuronas motoras en el transcurso de la vida adulta utilizando imágenes fluorescentes in vivo a través de la cutícula. Aquí, describimos una técnica de disección de piernas junto con inmunocitoquímica, que permite el estudio de cambios moleculares en la unión neuromuscular de las neuronas motoras de piernas adultas identificadas. Estas técnicas se pueden combinar con una miríada de anticuerpos que marcan estructuras pre y postsinápticas. Juntos, estos procedimientos permiten una caracterización más completa de los cambios lentos dependientes de la edad en moscas adultas y se pueden aplicar a través de múltiples modelos de enfermedades de neuronas motoras.
Introduction
Las enfermedades de la neurona motora (MN) abarcan un grupo de afecciones heterogéneas que incluyen la degeneración progresiva que conduce al desgaste muscular y la parálisis como fenotipo clínico primario1. Aunque es raro con una prevalencia global de 4,5 por 100.000, se espera que esta prevalencia aumente con el envejecimiento de la población2. La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es la enfermedad MN (EMN) más común y suele ser mortal en un corto período de tiempo desde el diagnóstico sin tratamientos modificadores de la enfermedad disponibles3. Las ETN comparten en común una fase presintomática prolongada con cambios tempranos en los biomarcadores moleculares y cambios en la imagen funcional observados en los pacientes4. La patología celular presintomática temprana también se observa en modelos de enfermedades no humanas5,6,7,8. El estudio de los cambios tempranos en la unión neuromuscular es importante para comprender la patogénesis de la enfermedad de MN y puede ayudar a desarrollar diagnósticos tempranos y posibles terapias.
Existe una gran cantidad de herramientas genéticas y moleculares en Drosophila para diseccionar la estructura y función de la unión neuromuscular (NMJ, ver9 para una revisión de la NMJ larvaria bien caracterizada). Estas herramientas combinadas con una corta vida útil hacen de Drosophila un excelente modelo para estudiar los cambios neurodegenerativos en el NMJ. Específicamente, las NM que inervan los músculos adultos están presentes a lo largo de la vida adulta de ~ 90 días y están sujetas a procesos normales de envejecimiento10,11,12,13. Por lo tanto, las NM adultas brindan la oportunidad de estudiar cambios degenerativos lentos en contraste con las NMJ larvales que existen solo durante un corto período de tiempo de ~ 1 semana antes de la metamorfosis14,15.
Aquí, describimos un procedimiento de disección que nos permite realizar análisis inmunocitoquímicos de las EM en la pierna adulta. Cada pierna adulta está inervada por ~ 50 MNs, que hacen sinapsis en la pierna muscular asociada para impulsar la locomoción. La anatomía de las piernas, la fisiología mecánica y la neurobiología han sido bien descritas16,17,18. Los cenadores axónicos de las MN de las patas se han caracterizado previamente por imágenes a través de la cutícula en poblaciones celulares rellenas o genéticamente marcadas utilizando el sistema bipartito Gal4/UAS y los métodos de imagen se han publicado anteriormente19. Los métodos de disección presentados aquí preservan la morfología de ramificación del axón y nos permiten explotar una amplia gama de anticuerpos para etiquetar diferentes componentes moleculares del NMJ. Nuestro trabajo anterior se ha centrado en las proyecciones de un MN definido en la pierna metatorácica (3ª), que inerva el músculo elevador de la tibia (tilm) y muestra patrones de arborización consistentes y números de bouton. Inicialmente estudiamos los cambios dependientes de la edad en los mutantes de la superóxido dismutasa 1 (dsod1) de Drosophila y encontramos alteraciones consistentes con el desmantelamiento de la NMJ20. Estos métodos de disección ofrecen la oportunidad de caracterizar mejor los cambios degenerativos lentos en el NMJ para otros modelos de ELA, estudios básicos del envejecimiento y otras enfermedades asociadas a la EMN.
Figura 1. Resumen del flujo de trabajo para diseccionar piernas. Consulte el protocolo para conocer los pasos detallados. (A,B) Las moscas son seleccionadas y anestesiadas. (C) Las moscas se transfieren a metanol y se lavan con PBS. (D) Las patas metatorácicas se eliminan en la base de la coxa mientras se visualizan con un microscopio de disección (~ 30x de aumento); barra de escala = 500 μm. (E) Las patas se fijan en una solución de formaldehído/PBS (FA) al 3,7% durante 30 minutos dentro de pocillos de placas de 24 pocillos y luego se elimina la FA mediante lavados con PBS. (F, G, H) Las piernas se transfieren a bandejas de disección de elastómero de silicona y se extrae un trozo de cutícula del fémur proximal utilizando fórceps biselados mientras se visualiza bajo un microscopio de disección a 80x; barra de escala = 50 μm. (I) Las patas se fijan después de la disección en FA y se lavan en PBS y luego en PBT (PBS + 0.1% surfactante no iónico). (J) Las piernas son sometidas a tinción inmunocitoquímica. (K,L) Las patas se transfieren a un portaobjetos de vidrio, se limpian en medios de montaje y se cubren con una funda que contiene espaciadores de arcilla; barras de escala = 2 mm y 500 μm. (M) Las piernas se visualizan mediante microscopía confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Los procedimientos para preparar soluciones de trabajo utilizados junto con este protocolo se describen en la Tabla 1.
| Reactivo | Preparación | Almacenamiento | |||
| PBS | Haga un stock de trabajo de 1x PBS a partir de una solución de stock de PBS 10x diluyendo en agua destilada. El pH de la culata de PBS en funcionamiento debe ser de 7,2 a 7,4 | 4 °C durante más de 1 mes hasta que la contaminación bacteriana sea visible. | |||
| PBT | 1x solución de PBS con surfactante no iónico al 0,1%. | 4 °C durante más de 1 mes hasta que la contaminación bacteriana sea visible. | |||
| FA | Solución de formaldehído al 3,7% hecha de un stock de formaldehído al 37% y diluida en 1x PBS. | Temperatura ambiente. Hacer fresco cada día de disección | |||
| PRECAUCIÓN: El formaldehído suministrado como solución madre al 37% es un carcinógeno potencial y debe diluirse en una campana extractora de humos. | |||||
| 5% NGS | 5% de suero normal de cabra diluido en PBT. El suero utilizado debe coincidir con la especie del anticuerpo secundario que se va a utilizar. | 4 °C durante varias semanas hasta que la contaminación bacteriana sea visible | |||
Tabla 1. Soluciones para la realización de inmunocitoquímica de la pierna adulta de Drosophila .
1. Fijación inicial de los tejidos
- Seleccione aproximadamente 10 moscas para cada genotipo y edad. Anestesiar en una almohadilla de mosca bajo dióxido de carbono (Figura 1A, B).
NOTA: Comience con más moscas de las necesarias para garantizar un tamaño de muestra lo suficientemente grande después de la disección. - Usando un pincel, transfiera las moscas al metanol frío en un pozo o plato de vidrio durante aproximadamente 30 segundos a 1 minuto (Figura 1C). El metanol solubiliza los hidrocarburos cuticulares y las moscas ahora pueden sumergirse en lugar de flotar en soluciones acuosas.
- Con fórceps, transfiera cuidadosamente las moscas a PBS. Enjuague 3x en PBS helado para eliminar el exceso de metanol y mantenga las moscas en PBS en hielo hasta la disección y fijación. En este punto, diseccionar moscas y fijar en el menor tiempo posible (<30 minutos).
- Para aislar las piernas, transfiera las moscas a un plato de disección de elastómero de silicona lleno de PBS frío, retire las patas metatorácicas en la coxa usando dos pares de pinzas Dumont # 5 o corte las piernas con tijeras Vanna (Figura 1D). Transfiera las patas a un pozo en una placa de plástico de 24 pocillos llena de 1 ml de PBS y mantenga la placa en hielo hasta que todas las patas se retiren y se transfieran a los pozos.
NOTA: Cada pozo puede contener al menos 20 patas. - Reemplace la solución de PBS con 1 ml de solución de FA y gire sobre un nutator durante 30 minutos (Figura 1E). El ajuste del nutator debe ajustarse a una velocidad media (17 rpm). Asegúrese de que las patas estén completamente sumergidas en la solución de FA durante este tiempo para una fijación adecuada.
- Para eliminar la solución de FA, lave en 1 ml de PBS 3x rápidamente seguido de 3 lavados adicionales durante 5 minutos cada uno en 1 ml de PBS. Mantenga los tejidos en 1 ml de PBS en hielo antes y durante los pasos de disección que se describen a continuación.
2. Eliminación de la cutícula de la pierna y tinción de anticuerpos
- Extracción de la cutícula de la pierna
- Las pinzas de disección son fundamentales para el éxito. Introduzca ligeras curvas paralelas en ambas puntas al final de las pinzas súper finas # 5 para proporcionar un bisel que permita que la cutícula se agarre superficialmente en lugar de pincharse, lo que puede arruinar el tejido (Figura 1F, G).
NOTA: Las puntas dobladas en paralelo aún deben hacer contacto entre sí a lo largo de la longitud de la punta cuando están cerradas (Figura 2). - Transfiera las piernas a un plato de elastómero de silicona en PBS para la disección. Oriente una pierna de modo que el lado anterior esté hacia arriba (consulte la Figura 3 para obtener información sobre la anatomía y la orientación de la pierna). Usando un par de fórceps, sostenga el segmento de tibia contra el plato de elastómero de silicona. Usando las otras pinzas sostenidas biseladas hacia abajo, agarre un trozo de cutícula en el extremo distal del fémur y tire en la dirección proximal hacia el trocánter.
- Mantenga metódicamente la extirpación de la cutícula hasta que el músculo desnudo sea visible en todo el extremo proximal del fémur (Figura 1F, G, H).
NOTA: Solo haga contacto superficial con las piernas usando el lado biselado de los fórceps para evitar tirar del músculo. - Una vez que todas las piernas estén diseccionadas, reemplace PBS con FA para posfijar las piernas durante 30 minutos con agitación en un nutator a velocidad media (Figura 1I). Lave las muestras en 1 ml de PBS para 3 veces rápido y luego 3 veces durante 5 minutos cada una en PBT (Figura 1J).
NOTA: Si se tiñe con anticuerpo monoclonal NC82 (anti-bruchpilot) para etiquetar zonas activas, posfijar durante 20 minutos, ya que este antígeno es sensible a fijaciones más largas.
- Las pinzas de disección son fundamentales para el éxito. Introduzca ligeras curvas paralelas en ambas puntas al final de las pinzas súper finas # 5 para proporcionar un bisel que permita que la cutícula se agarre superficialmente en lugar de pincharse, lo que puede arruinar el tejido (Figura 1F, G).
Figura 2. Fórceps modificados utilizados para diseccionar piernas adultas. (A) Los extremos de las pinzas se doblan y luego se aplanan en la parte inferior (flecha) creando un bisel mediante la limado sobre una piedra afilada. (B) En contraste, las puntas de los fórceps no modificados no están dobladas. Barra de escala = 1 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Tinción de anticuerpos
- Para bloquear los tejidos para la tinción de anticuerpos, reemplace 1 ml de PBT con una solución de bloqueo que consiste en 1 ml de NGS al 5% diluido en PBT. Incubar las patas diseccionadas durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C mientras se balancea sobre un nutator a velocidad media (17 rpm). Durante todas las incubaciones, cubra los pozos con cinta de sellado además de la cubierta de plástico (Figura 1J).
NOTA: Se utilizan placas de 24 pocillos para inmunocitoquímica en lugar de microcentrífuga de 1,5 ml o 2 ml porque los intentos anteriores de usar tubos de microcentrífuga resultaron en piernas rotas y tejido dañado. - Retire la solución de bloqueo y agregue 300 ml de anticuerpos primarios diluidos en una solución de bloqueo fresca. El pequeño volumen de anticuerpos utilizado debe ser suficiente para cubrir los tejidos. Vuelva a sellar los pozos con cinta de sellado de laboratorio y tapa de plástico e incube durante la noche a 4 °C con agitación en un nutator a velocidad media (Figura 1J). La información y las concentraciones de reactivos de anticuerpos de trabajo utilizadas para estos estudios se describen en la Tabla 2.
- Lave los anticuerpos primarios en 1 ml de PBT durante 3 veces brevemente y luego 3 veces durante 15 minutos cada una (Figura 1J).
NOTA: Los anticuerpos primarios diluidos se pueden guardar y reutilizar si se almacenan a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. - Bloquee los tejidos nuevamente en 1 ml de NGS al 5% durante al menos 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 C (Figura 1J).
- Retire la solución bloqueadora de NGS al 5% y agregue 300 μL de los anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes diluidos apropiados. Además, agregue 1:2000 dilución de faloidina conjugada con fluorescencia para etiquetar el músculo (Figura 1J).
- Para incubaciones secundarias de anticuerpos, selle los pozos con cinta de sellado de laboratorio y tapa. Además, envuelva las placas en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Incubar durante 6-8 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
- Lave los anticuerpos secundarios y la faloidina como se describe en el paso 2.2.3 anterior. Cubra las placas con papel de aluminio entre lavados para proteger los fluoróforos de la luz.
- Para bloquear los tejidos para la tinción de anticuerpos, reemplace 1 ml de PBT con una solución de bloqueo que consiste en 1 ml de NGS al 5% diluido en PBT. Incubar las patas diseccionadas durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C mientras se balancea sobre un nutator a velocidad media (17 rpm). Durante todas las incubaciones, cubra los pozos con cinta de sellado además de la cubierta de plástico (Figura 1J).
3. Patas de montaje
- Transfiera las piernas a un tobogán con fórceps y oriente el lado anterior hacia arriba. Cubra las patas con medios de montaje (Figura 1K, L).
NOTA: Las patas disecadas se pueden aspirar con una punta de pipeta P1000 si el orificio inferior se ensancha cortando con una cuchilla de afeitar. - Agregue espaciadores de arcilla a una cubierta de 22x22 mm2 (espesor # 1.5) raspando las esquinas de la cubierta a través de una pequeña bola de arcilla de modelado. Cada esquina debe tener una pequeña cantidad de arcilla de 1-2 mm de espesor (Figura 1K).
- Para cubrir la diapositiva, agregue la cubierta con los espaciadores de arcilla mirando hacia la diapositiva y empuje cuidadosamente las esquinas hasta que la cubierta toque la superficie del fémur.
- Para evitar la evaporación, selle los bordes de la funda con esmalte de uñas y deje secar en un lugar oscuro (aproximadamente 10 minutos) antes de almacenar a 4 ° C hasta la toma de imágenes.
4. Imágenes
- Imagen por microscopio confocal (Figura 1M). Incluir un canal de luz transmitido para evaluar mejor la calidad de la disección y se deben descartar muestras con fibras musculares visiblemente alteradas en el área de interés.
- Comience a crear imágenes de pilas z con un aumento de 20x con zoom de 2x y una profundidad total de imagen de ~ 40 mm correspondiente al grosor del fémur. Para la detección de señales fluorescentes, capture imágenes a resoluciones consistentes con el muestreo de Nyquist (estamos utilizando 1024 x 1024 píxeles con un ajuste de permanencia de 8-10 μs / píxel). La intensidad de la señal debe estar en el rango lineal que se logra ajustando los ajustes de ganancia de alto voltaje. Una vez que se establecen los ajustes de ganancia para una serie de muestras dentro de un experimento, no deben alterarse para que las intensidades de la señal se puedan comparar entre muestras.
- Para obtener imágenes de boutones sinápticos y otras estructuras subcelulares, capture imágenes confocales a un aumento de ≥60x. La configuración del detector debe estar en el rango lineal, mientras que la densidad de píxeles, la configuración de permanencia y la profundidad z deben ser similares para las imágenes capturadas con un aumento más bajo (paso 4.1).
Representative Results
La Figura 4 muestra un ejemplo representativo de una pierna metatorácica teñida con anti-hrp, anti-dlg y faloidina. Para las disecciones que eliminan la cutícula de la porción proximal del fémur, los cenadores estereotipados serán evidentes cerca del tendón que se detecta fácilmente por autofluorescencia. Tenga en cuenta que la penetración de anticuerpos en la pierna ocurre a una corta distancia más allá de la región en la que se ha eliminado la cutícula (Figura 4A). Estas regiones se pueden visualizar de manera efectiva cuando hay una fuerte señal de fluorescencia. Las imágenes a bajo aumento (20x con un zoom de 2x) permiten una fácil determinación de 1) cuánta cutícula se elimina y 2) si se produjo daño durante la disección. El aumento de la ampliación (60x) muestra proyecciones estereotipadas en la tilm (Figura 4B). Nuestro trabajo se ha centrado en un MN, probablemente derivado del linaje I-MN que inerva la tilm en el fémur proximal (recuadro, Figura 4B y Figura 4C). Aumentar aún más la ampliación (100x con zoom de 2x) permite una visualización efectiva de los boutons sinápticos (Figura 4D).
Para estudiar los cambios morfológicos en el NMJ adulto a lo largo del tiempo, hemos utilizado previamente mutantes dsod1 como modelo de ELA. La hinchazón de Bouton ocurre en mutantes dsod1H71Y envejecidos en relación con dsod1nulland dsod1+ (Figura 5A, B). En la NMJ larval, el anticuerpo monoclonal NC82 se usa a menudo para etiquetar zonas activas y estas estructuras se pueden visualizar fácilmente en la NMJ adulta (Figura 5C). Las ramas de axones HRP débilmente positivas son abundantes en mutantes dsod1H71Y y estas ramas a menudo muestran una localización BRP débil y difusa (flechas).
Importante para la neurodegeneración, los anticuerpos disponibles comercialmente pueden detectar proteínas ubiquitinadas que a menudo se encuentran en agregados, y hemos detectado agregados ubiquitinados dentro de axones terminales de MNs en moscas dsod1 mutantes envejecidas , así como dentro del músculo (Figura 6A). Además, los anticuerpos que marcan las mitocondrias también pueden detectar cambios morfológicos con la edad (Figura 6B).
Para algunas preparaciones, el daño muscular durante la disección hace que la muestra sea inutilizable. Al principio, tal daño puede ser una ocurrencia común, pero la mejora ocurre con la práctica. Ejemplos de buenas disecciones se muestran en la Figura 7A, C, mientras que las disecciones deficientes se muestran en la Figura 7B, D. Las disecciones deficientes causan la desorganización de las fibras musculares según lo detectado por la microscopía de contraste de fase (Figura 7B) o las fibras musculares faltantes visualizadas por la faloidina conjugada fluorescente (Figura 7D, flecha). La combinación del uso de faloidina para etiquetar el músculo y las imágenes de luz transmitidas puede ayudar a detectar dicho daño muscular que puede no ser evidente cuando se ve bajo un microscopio de disección.
Figura 3. Anatomía de la pierna de Drosophila . (A) Diagrama del lado anterior de una pierna metatorácica, caracterizado por la presencia de cerdas en contraste con la cutícula desnuda prominente presente en el lado posterior. La pierna segmentada está compuesta por la coxa (Cx), trocánter (Tr), fémur (Fe), tibia (Ti), 5 segmentos tarsianos (Ta1-5) y garra (Cl) en orden desde proximal (Pr) hasta distal (Di). También están indicados los lados dorsal (D) y ventral (V) del fémur. Barra de escala = 100 μm. (B) Diagrama del fémur que contiene los músculos elevador de tibia (tilm), depresor de tibia (tidm), músculo tendón largo 2 (ltm2) y reductor de tibia (tirm) y proyecciones de axones en el fémur proximal que inerva el tilm. Se presume que estas proyecciones axonales estereotipadas se derivan de neuroblastos del linaje I16, y la segunda arborización es la más fácil de acceder por disección (en caja). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El fémur metatorácico diseccionado reveló una arquitectura estereotipada de MN que inerva la tilm. La inmunocitoquímica se utilizó para marcar neuronas (HRP), discos grandes (DLG) y músculos (faloidina). Las pilas Z se capturaron mediante imágenes de microscopía confocal a través de todo el fémur y se mostraron como una proyección de serie máxima. (A) También se incluyó un canal de luz transmitido para ilustrar que no se produjo daño muscular detectable durante la disección. La imagen fue capturada a un aumento de 20x, barra de escala = 50 μm. (B) Cenadores identificados asociados con el tilm (área en caja, centro), barra de escala = 20 μm; y (C) a un aumento de 60x, barra de escala = 20 μm. (D) DLG que rodean a los boutons era evidente en animales de tipo salvaje cuando se fotografiaban a un aumento de 100x con zoom de 2x; barra de escala = 2 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Ejemplo de cambios dependientes de la edad en la morfología del bouton que se pueden detectar utilizando la técnica de disección de piernas. La hinchazón de Bouton se observa en mutantes dsod1H71Y envejecidos. (A) Imágenes representativas de boutones manchados de HRP de moscas jóvenes (recién eclosadas, adultos del día 0) y viejas (día 10), barra de escamas = 1 μm. (B) Los tamaños de Bouton se cuantificaron a partir de los genotipos respectivos utilizando la función de medida dentro de ImageJ. p<0.0001 (ANOVA de 2 vías con prueba de Tukey post-hoc). (C) Zonas activas dentro de boutones sinápticos marcados con anticuerpo monoclonal NC82 (anti-bruchpilot); barra de escala = 1 μm. Figura modificada de20Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Marcadores comunes asociados con la enfermedad neurodegenerativa utilizados en las preparaciones de piernas de Drosophila. (A) Se detectan agregados poliubiquitinados subcelulares en axones terminales y músculos de moscas dsod1H71Y envejecidas. La inmunocitoquímica con antipoliubiquitina (FK2) detecta puntúas (flechas) en dsod1H71Y/H71Y envejecido, barra de escala = 20 μm (izquierda) y 5 μm (derecha). (B) Las mitocondrias inflamadas se pueden detectar usando anti-ATP5A, barra de escamas = 1 μm. Figura modificada de20Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Ejemplos de disecciones buenas y malas. (A) Disección que no interrumpió la arquitectura muscular subyacente. (B) Un ejemplo de una disección deficiente que mostró fibras musculares deshilachadas (flecha) y no pudo usarse para el análisis. Ambas muestras fueron fotografiadas por microscopía de contraste de fase. Barra de escala = 50 μm. (C) Ejemplo de una buena disección fotografiada por microscopía confocal con HRP (verde) y faloidina (azul). (D) Falta una mala disección de las fibras musculares dorsales del TILM (flecha). Barra de escala = 50 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo/Tinción | Dilución* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Anti-bruchpilot (nc82) | 1:20 |
| Proteína de cadena anticisteína (ab49) | 1:50 |
| Antidiscos grandes (4F3) | 1:200 |
| Anti-hrp | 1:550 |
| Anti-poliubiquitina (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra | 1:800 |
| Faloidina | 1:2000 |
| *Diluir en 5% NGS |
Tabla 2. Anticuerpos y diluciones. Los proveedores comerciales de los anticuerpos utilizados en estos estudios se enumeran en la Lista de materiales.
Discussion
La pierna adulta de Drosophila es un modelo ideal para estudiar la neurodegeneración dada la relativa simplicidad con MN bien caracterizadas mapeadas a partir de linajes de neuroblastos y patrones de arborización estereotipados. Varios informes han utilizado previamente las MN de piernas para el estudio de la enfermedad neurodegenerativa21,22. Estos estudios utilizaron líneas que expresan GFP combinadas con análisis de mosaico con un marcador celular represible (MARCM) para obtener imágenes a través de la cutícula y documentaron una serie de cambios morfológicos. La obtención de imágenes de NMJ adultos por inmunocitoquímica con cutícula resecada permite una caracterización adicional con la capacidad de rastrear cambios moleculares complejos utilizando una caja de herramientas de anticuerpos disponibles.
La parte de inmunocitoquímica de este protocolo es relativamente estándar y se puede implementar independientemente del genotipo (ver23 para una excelente descripción de los métodos generales de tinción de anticuerpos para su uso con Drosophila). Además, parámetros como la intensidad de la fluorescencia, la longitud de la rama del axón y el número y tamaño del bouton se pueden determinar utilizando una variedad de macros ImageJ disponibles una vez que se capturan las imágenes y se han publicado métodos detallados para el análisis cuantitativo (por ejemplo, ver24,25,26). Por lo tanto, la técnica de disección es la principal innovación descrita aquí. Antes de la disección, las moscas se sumergen en un alcohol para eliminar los hidrocarburos cuticulares. Tanto el etanol como el metanol se usan comúnmente para este propósito; sin embargo, solo hemos utilizado metanol. Críticos para el éxito de la disección son varios factores: Primero, el uso de fórceps modificados con un bisel permite un contacto muy superficial con la cutícula. En segundo lugar, utilizando un microscopio de disección capaz de un aumento total de 60-100x para que la superficie de la cutícula sea claramente visible. Para microscopios con un aumento máximo más bajo, los objetivos 2x están disponibles para las marcas más comunes y deberían ser suficientes cuando se combinan con lentes existentes. En tercer lugar, el paso de fijación inicial hace que la cutícula sea frágil y más fácil de alejar sin dañar el músculo debajo. La fijación excesiva en este paso hace que toda la pierna esté demasiado rígida para una disección efectiva. Por lo tanto, la fijación inicial debe limitarse a 30 minutos. El fijador de formaldehído no penetrará lo suficiente como para reticular eficazmente el tejido subyacente durante este corto período y, por lo tanto, es necesario un segundo paso de fijación. Antes de la segunda fijación, los tejidos deben mantenerse en hielo para evitar la degradación y los cambios en la morfología. Cuarto, hemos encontrado que diseccionar muestras mientras que el frío también es importante, probablemente por razones similares en que la cutícula es frágil y una pieza pequeña se puede quitar más fácilmente.
Con la práctica, encontramos que ~ 50% de las disecciones serán utilizables sin daño tisular discernible. Aunque este porcentaje puede parecer bajo en relación con algunos otros tejidos, el procedimiento de disección es rápido y muchas piernas se pueden procesar en 30-60 minutos. Por lo tanto, incluso si las tasas de éxito son bajas inicialmente, es factible obtener 4-5 buenas muestras para cada grupo experimental. Sin embargo, una limitación puede ser el número de moscas disponibles en un momento dado si los genotipos y / o la edad resultan en una letalidad sustancial.
Otra limitación es que no hemos podido diseccionar otras zonas de la pierna más allá de la región proximal del fémur debido al tamaño. Por lo tanto, podemos estudiar los cenadores MN identificados que inervan el TILM de manera confiable y es posible diseccionar la cutícula por encima del músculo depresor de la tibia con pequeños cambios en la forma en que se orienta la pierna al diseccionar. Sin embargo, el acceso a otras regiones de la pierna ha resultado más difícil sin interrumpir la arquitectura axonal durante la disección.
Aquí, presentamos métodos de disección para detectar cambios en la NMJ adulta para MNs definidas que inervan el tilm utilizando inmunocitoquímica. La pierna es útil como un sistema simple, inervada por solo ~ 50 MN y que contiene 14 músculos con una anatomía bien descrita. La preparación de la pierna diseccionada se puede utilizar en todos los genotipos y un conjunto de anticuerpos están disponibles para la visualización de NMJ sin la necesidad de construir existencias genotípicamente complejas de construcciones de genes reporteros en fondos mutantes. Este enfoque permitirá una caracterización más detallada de los cambios en el NMJ para las enfermedades de MN y otras afecciones relacionadas con la edad.
Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Eric Roberts por sus consejos sobre imágenes. También deseamos agradecer a los Servicios de Tecnología de la Información en Rhode Island College y, en particular, a Michael Caine y Jake Douglas por la videografía. Los anticuerpos monoclonales anti-dlg y anti-brp fueron desarrollados por UC-Berkeley y Universitaetsklinikim Wuerzburg respectivamente, y se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank, creado por el NICHD de los NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242, EE. UU. La investigación reportada aquí fue apoyada completamente por la Red de Excelencia en Investigación Biomédica del Premio de Desarrollo Institucional de Rhode Island (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
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