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Neuroscience

विच्छेदन और ड्रोसोफिला वयस्क पैर के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक पहचाने गए मोटर न्यूरॉन के लिए न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर परिवर्तनों का पता लगाने के लिए

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62844
Automatic Translation
1, *1,2
1Department of Biology, Rhode Island College, 2Department of Pediatrics, Women and Infants Hospital, Warren Alpert Medical School of Brown University
* These authors contributed equally

Summary

हम एक विच्छेदन तकनीक का वर्णन करते हैं जो न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की वास्तुकला को संरक्षित करता है और वयस्क ड्रोसोफिला पैर में मोटर न्यूरॉन्स के विस्तृत इम्यूनोसाइटोकेमिकल अध्ययन को सक्षम बनाता है।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर न्यूरोनल संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से सभ्य मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, और रोग राज्यों में बाद में परिवर्तन करता है। अच्छी तरह से विशेषता लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन अक्सर इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, तेजी से लार्वा विकास के बाद मांसपेशियों के हिस्टोलिसिस और तंत्रिका तंत्र remodeling के दौरान कायापलट इस मॉडल को धीमी उम्र पर निर्भर अपक्षयी परिवर्तनों के अध्ययन के लिए समस्याग्रस्त बनाता है जैसे कि एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस में होने वाले। वैकल्पिक रूप से, वयस्क मक्खियां 90 दिनों तक रहती हैं और वयस्क पैर का उपयोग छल्ली के माध्यम से विवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग में उपयोग करके वयस्क जीवनकाल के दौरान मोटर न्यूरॉन परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री के साथ मिलकर एक पैर विच्छेदन तकनीक का वर्णन करते हैं, जो पहचाने गए वयस्क पैर मोटर न्यूरॉन्स के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर आणविक परिवर्तनों के अध्ययन की अनुमति देता है। इन तकनीकों को एंटीबॉडी के असंख्य के साथ जोड़ा जा सकता है जो पूर्व और बाद के सिनैप्टिक संरचनाओं दोनों को लेबल करता है। साथ में ये प्रक्रियाएं वयस्क मक्खियों में धीमी उम्र-निर्भर परिवर्तनों के अधिक पूर्ण लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं और कई मोटर न्यूरॉन रोग मॉडल में लागू की जा सकती हैं।

Introduction

मोटर न्यूरॉन (एमएन) रोगों में विषम स्थितियों का एक समूह शामिल है जिसमें प्रगतिशील अध: पतन शामिल है जो प्राथमिक नैदानिक फेनोटाइप 1 के रूप में मांसपेशियों की बर्बादी और पक्षाघात के लिए अग्रणी है। हालांकि प्रति 100,000 प्रति 4.5 के वैश्विक प्रसार के साथ दुर्लभ, इस प्रसार को उम्र बढ़ने वाली आबादी के साथ बढ़ने की उम्मीद है2। एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) सबसे आम एमएन रोग (एमएनडी) है और आमतौर पर निदान के थोड़े समय के भीतर घातक होता है जिसमें कोई मौजूदा रोग-संशोधित उपचार उपलब्ध नहीं होता है। MNDs आम में जल्दी आणविक biomarker परिवर्तन और कार्यात्मक इमेजिंग रोगियों में देखा परिवर्तन के साथ एक लंबे समय तक presymptomatic चरण में साझा करते हैं4. प्रारंभिक presymptomatic सेलुलर विकृति भी गैर मानव रोग मॉडल 5,6,7,8 में मनाया जाता है। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर शुरुआती परिवर्तनों का अध्ययन एमएन रोग रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रारंभिक निदान और संभावित चिकित्सीय विकसित करने में सहायता कर सकता है।

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की संरचना और कार्य को विच्छेदित करने के लिए ड्रोसोफिला में आनुवंशिक और आणविक उपकरणों का एक खजाना मौजूद है (एनएमजे, अच्छी तरह से विशेषता वाले लार्वा एनएमजे की समीक्षा के लिए देखें 9)। ये उपकरण एक छोटे जीवनकाल के साथ संयुक्त ड्रोसोफिला को एनएमजे में न्यूरोडीजेनेरेटिव परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाते हैं। विशेष रूप से, एमएन इनरवेटिंग वयस्क मांसपेशियां ~ 90-दिवसीय वयस्क जीवनकाल में मौजूद होती हैं और सामान्य उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं के अधीन होती हैं10,11,12,13। वयस्क एमएन इसलिए लार्वा एनएमजे के विपरीत धीमी गति से अपक्षयी परिवर्तनों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं जो कायापलट 14,15 से पहले केवल एक छोटी ~ 1 सप्ताह की अवधि के लिए मौजूद हैं।

यहां, हम एक विच्छेदन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो हमें वयस्क पैर में एमएन के इम्यूनोसाइटोकेमिकल विश्लेषण का संचालन करने की अनुमति देता है। प्रत्येक वयस्क पैर को ~ 50 एमएन द्वारा इनरवेट किया जाता है, जो लोकोमोशन को चलाने के लिए संबंधित पैर की मांसपेशियों पर synapse करता है। पैर की शारीरिक रचना, यांत्रिक शरीर विज्ञान और न्यूरोबायोलॉजी को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है16,17,18। लेग एमएन के अक्षतंतु arbors को पहले द्विपक्षीय Gal4 / UAS प्रणाली का उपयोग करके बैक-भरे या आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए सेल आबादी में छल्ली के माध्यम से इमेजिंग की विशेषता दी गई है और इमेजिंग विधियों को पहले प्रकाशित किया गया है। यहां प्रस्तुत विच्छेदन विधियां अक्षतंतु शाखाओं के आकारिकी को संरक्षित करती हैं और हमें एनएमजे के विभिन्न आणविक घटकों को लेबल करने के लिए एंटीबॉडी की एक विविध श्रृंखला का शोषण करने की अनुमति देती हैं। हमारे पिछले काम ने मेटाथोरेसिक (3) पैर में एक परिभाषित एमएन के अनुमानों पर ध्यान केंद्रित किया है, जो टिबिया लेवेटर मांसपेशी (तिल्म) को इनरवेट करता है और लगातार आर्बराइजेशन पैटर्न और बाउटन संख्याओं को दिखाता है। प्रारंभ में हमने ड्रोसोफिला सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज 1 (dsod1) उत्परिवर्ती में उम्र-निर्भर परिवर्तनों का अध्ययन किया और NMJ20 को खत्म करने के अनुरूप परिवर्तन पाए। ये विच्छेदन विधियां अन्य एएलएस मॉडल, उम्र बढ़ने के बुनियादी अध्ययन और अन्य एमएन से संबंधित बीमारियों के लिए एनएमजे में धीमी गति से अपक्षयी परिवर्तनों को बेहतर ढंग से चिह्नित करने का अवसर प्रदान करती हैं।

Figure 1
चित्र 1. पैरों को विच्छेदन करने के लिए वर्कफ़्लो सारांश. विस्तृत चरणों के लिए प्रोटोकॉल देखें. (A, B) मक्खियों का चयन किया जाता है और एनेस्थेटिक किया जाता है। (c) मक्खियों को मेथनॉल में स्थानांतरित किया जाता है और पीबीएस के साथ धोया जाता है। (डी) मेटाथोरेसिक पैरों को कॉक्सा के आधार पर हटा दिया जाता है, जबकि एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (~ 30x आवर्धन) के साथ कल्पना की जाती है; स्केल बार = 500 μm. (ई) पैरों को तब 24-अच्छी प्लेटों के कुओं के भीतर 30 मिनट के लिए 3.7% फॉर्मेल्डिहाइड / पीबीएस (एफए) समाधान में तय किया जाता है और फिर पीए को पीबीएस के साथ धोने से हटा दिया जाता है। (F, G, H) पैरों को सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन ट्रे में स्थानांतरित कर दिया जाता है और छल्ली का एक टुकड़ा समीपस्थ फीमर से 80x पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना करते हुए बेवेल संदंश का उपयोग करके हटा दिया जाता है; स्केल बार = 50 μm. (I) पैरों को एफए में तय किया जाता है और पीबीएस और फिर पीबीटी (पीबीएस + 0.1% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट) में धोया जाता है। (जे) पैरों को इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के अधीन किया जाता है। (K,L) पैरों को एक ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित किया जाता है, बढ़ते मीडिया में साफ किया जाता है, और मिट्टी के स्पेसर्स युक्त एक कवरस्लिप के साथ कवर किया जाता है; स्केल सलाखों = 2 मिमी और 500 μm. (एम) पैरों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने वाले कार्य समाधान तैयार करने की प्रक्रियाओं को तालिका 1 में वर्णित किया गया है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) तैयारी गोदाम
PBS आसुत पानी में पतला करके एक 10x PBS स्टॉक समाधान से 1x PBS का एक कामकाजी स्टॉक बनाएं।  काम कर रहे पीबीएस स्टॉक का पीएच 7.2- 7.4 होना चाहिए 1 + महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस जब तक कि जीवाणु संदूषण दिखाई नहीं देता है।
PBT 0.1% गैर आयनिक surfactant के साथ 1x PBS समाधान. 1 + महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस जब तक कि जीवाणु संदूषण दिखाई नहीं देता है।
एफए 3.7% formaldehyde समाधान एक 37% formaldehyde स्टॉक से बना है और 1x PBS में पतला. कमरे का तापमान। विच्छेदन के प्रत्येक दिन ताजा करें
सावधानी: 37% स्टॉक समाधान के रूप में आपूर्ति की गई फॉर्मेल्डिहाइड एक संभावित कार्सिनोजेन है और इसे धुएं के हुड में पतला किया जाना चाहिए।
5% NGS 5% सामान्य बकरी सीरम पीबीटी में पतला.  उपयोग किए जाने वाले सीरम को उपयोग किए जाने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी की प्रजातियों से मेल खाना चाहिए। कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस जब तक कि जीवाणु संदूषण दिखाई नहीं देता है

तालिका 1. वयस्क ड्रोसोफिला पैर के immunocytochemistry प्रदर्शन के लिए समाधान .

1. ऊतकों का प्रारंभिक निर्धारण

  1. प्रत्येक जीनोटाइप और उम्र के लिए लगभग 10 मक्खियों का चयन करें। कार्बन डाइऑक्साइड (चित्रा 1 ए, बी) के तहत एक फ्लाई पैड पर एनेस्थेटिकाइज़ करें।
    नोट: विच्छेदन के बाद एक बड़ा पर्याप्त नमूना आकार सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक से अधिक मक्खियों के साथ शुरू करें।
  2. एक पेंटब्रश का उपयोग करके, लगभग 30 सेकंड से 1 मिनट (चित्रा 1 सी) के लिए एक ग्लास अच्छी तरह से या डिश में ठंडे मेथनॉल में मक्खियों को स्थानांतरित करें। मेथनॉल क्यूटिकुलर हाइड्रोकार्बन को घुलनशील बनाता है और मक्खियों को अब जलीय समाधानों में तैरने के बजाय जलमग्न किया जा सकता है।
  3. संदंश के साथ, ध्यान से पीबीएस के लिए मक्खियों हस्तांतरण. अतिरिक्त मेथनॉल को हटाने के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस में 3x कुल्ला करें और विच्छेदन और निर्धारण तक बर्फ पर पीबीएस में मक्खियों को रखें। इस बिंदु पर, मक्खियों को विच्छेदित करें और कम से कम समय (<30 मिनट) के भीतर ठीक करें।
  4. पैरों को अलग करने के लिए, ठंडे पीबीएस से भरे सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन पकवान में मक्खियों को स्थानांतरित करें, # 5 ड्यूमोंट संदंश के दो जोड़े का उपयोग करके कॉक्सा में मेटाथोरेसिक पैरों को हटा दें या वन्ना कैंची (चित्रा 1 डी) के साथ पैरों को काट दें। पीबीएस के 1 मिलीलीटर से भरे एक प्लास्टिक 24 अच्छी तरह से प्लेट में पैरों को एक कुएं में स्थानांतरित करें और प्लेट को बर्फ पर रखें जब तक कि सभी पैरों को हटा नहीं दिया जाता है और कुओं में स्थानांतरित नहीं किया जाता है।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से कम से कम 20 पैर पकड़ सकते हैं।
  5. पीबीएस समाधान को 1 एमएल एफए समाधान के साथ बदलें और 30 मिनट (चित्रा 1 ई) के लिए एक न्यूटर पर घुमाएं। Nutator सेटिंग एक मध्यम गति (17 rpm) पर सेट किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त निर्धारण के लिए इस समय के दौरान पैर पूरी तरह से एफए समाधान में डूब गए हैं।
  6. एफए समाधान को हटाने के लिए, पीबीएस 3x के 1 मिलीलीटर में जल्दी से धोएं, इसके बाद पीबीएस के 1 एमएल में प्रत्येक में 5 मिनट के लिए एक अतिरिक्त 3 वॉश करें। से पहले बर्फ पर पीबीएस के 1 मिलीलीटर में ऊतकों को पकड़ो, और नीचे वर्णित विच्छेदन चरणों के दौरान।

2. लेग छल्ली और एंटीबॉडी धुंधला हटाने

  1. पैर छल्ली निकालना
    1. विच्छेदन संदंश सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। # 5 सुपर ठीक संदंश के अंत में दोनों prongs में मामूली समानांतर bends परिचय एक बेवल प्रदान करने के लिए है कि छल्ली को पोक किए जाने के बजाय सतही रूप से पकड़ने की अनुमति देता है, जो ऊतक को बर्बाद कर सकता है (चित्रा 1 एफ, जी)।
      नोट: समानांतर में मुड़े हुए Prongs को अभी भी बंद होने पर prong की लंबाई में एक दूसरे के साथ संपर्क करना चाहिए (चित्रा 2)।
    2. विच्छेदन के लिए पीबीएस में एक सिलिकॉन इलास्टोमर डिश में पैर स्थानांतरित करें। एक पैर को उन्मुख करें ताकि पूर्वकाल पक्ष का सामना करना पड़ रहा हो (पैर की शारीरिक रचना और अभिविन्यास जानकारी के लिए चित्रा 3 देखें)। संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, सिलिकॉन इलास्टोमर डिश के खिलाफ टिबिया सेगमेंट को पकड़ो। अन्य संदंश का उपयोग करके बेवल साइड नीचे आयोजित किया जाता है, फीमर के डिस्टल छोर पर छल्ली का एक टुकड़ा पकड़ो और ट्रोचेंटर की ओर समीपस्थ दिशा में खींचें।
    3. व्यवस्थित रूप से छल्ली को हटाते रहें जब तक कि नग्न मांसपेशी फीमर के समीपस्थ छोर पर दिखाई न दे (चित्रा 1 एफ, जी, एच)।
      नोट: केवल मांसपेशियों को खींचने से बचने के लिए संदंश के बेवेल्ड पक्ष का उपयोग करके पैरों के साथ सतही संपर्क करें।
    4. एक बार जब सभी पैरों को विच्छेदित कर दिया जाता है, तो पीबीएस को एफए के साथ बदलें ताकि मध्यम गति पर एक न्यूटर पर हिलाने के साथ 30 मिनट के लिए पैरों को ठीक किया जा सके (चित्रा 1 आई)। पीबीएस के 1 एमएल में 3 बार त्वरित के लिए नमूने धोएं और फिर पीबीटी (चित्रा 1 जे) में प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3 बार।
      नोट: यदि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NC82 (एंटी-ब्रुकपायलट) के साथ सक्रिय क्षेत्रों को लेबल करने के लिए धुंधला हो रहा है, तो 20 मिनट के लिए पोस्ट-फिक्स करें क्योंकि यह एंटीजन लंबे समय तक फिक्सेशन के प्रति संवेदनशील है।

Figure 2
चित्र 2. वयस्क पैरों को विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले संशोधित संदंश। (ए) संदंश के सिरों को मोड़ा जाता है और फिर नीचे (तीर) पर चपटा किया जाता है, जिससे एक तेज पत्थर पर दाखिल करके बेवल बनता है। (बी) इसके विपरीत, असंशोधित संदंश के प्रोंग्स मुड़े हुए नहीं होते हैं। स्केल बार = 1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एंटीबॉडी धुंधला
    1. एंटीबॉडी स्टेनिंग के लिए ऊतकों को अवरुद्ध करने के लिए, पीबीटी में पतला 5% एनजीएस के 1 एमएल से मिलकर 1 एमएल के समाधान के साथ पीबीटी को प्रतिस्थापित करें। कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए विच्छेदित पैरों को इनक्यूबेट करें, जबकि मध्यम गति (17 आरपीएम) पर एक न्यूटर पर रॉकिंग करते हैं। सभी ऊष्मायन के दौरान, प्लास्टिक कवर (चित्रा 1 जे) के अलावा सीलिंग टेप के साथ कुओं को कवर करें।
      नोट: 24 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग 1.5 मिलीलीटर या 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज के बजाय इम्युनोसाइटोकैमिस्ट्री के लिए किया जाता है क्योंकि माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करने के पिछले प्रयासों के परिणामस्वरूप टूटे हुए पैर और क्षतिग्रस्त ऊतक होते हैं।
    2. ब्लॉकिंग समाधान निकालें और ताजा अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 300 मिलीलीटर जोड़ें। ऊतकों को कवर करने के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी की छोटी मात्रा पर्याप्त होनी चाहिए। प्रयोगशाला सील टेप और प्लास्टिक ढक्कन के साथ कुओं को फिर से सील करें और मध्यम गति (चित्रा 1 जे) पर एक न्यूटर पर मिलाने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर इनक्यूबेट करें। इन अध्ययनों के लिए उपयोग की जाने वाली कार्यशील एंटीबॉडी अभिकर्मक जानकारी और सांद्रता को तालिका 2 में वर्णित किया गया है।
    3. पीबीटी के 1 मिलीलीटर में प्राथमिक एंटीबॉडी को 3 बार संक्षेप में धोएं और फिर 15 मिनट के लिए 3 बार प्रत्येक (चित्रा 1 जे)।
      नोट: पतला प्राथमिक एंटीबॉडी को बचाया जा सकता है और पुन: उपयोग किया जा सकता है यदि 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    4. कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए या 4 सी (चित्रा 1 जे) पर रात भर के लिए 5% एनजीएस के 1 मिलीलीटर में ऊतकों को फिर से ब्लॉक करें।
    5. 5% NGS ब्लॉकिंग समाधान निकालें और उपयुक्त पतला फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 300 μL जोड़ें। इसके अतिरिक्त, मांसपेशियों को लेबल करने के लिए प्रतिदीप्ति-संयुग्मित phalloidin के 1: 2000 कमजोर पड़ने जोड़ें (चित्रा 1J)।
    6. द्वितीयक एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए, प्रयोगशाला सील टेप और ढक्कन के साथ कुओं को सील करें। इसके अलावा, प्रकाश से fluorophores की रक्षा करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेटों लपेटें। कमरे के तापमान पर 6-8 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. ऊपर दिए गए चरण 2.2.3 में वर्णित द्वितीयक एंटीबॉडी और phalloidin धोएं। प्रकाश से fluorophores की रक्षा करने के लिए धोने के बीच में एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर प्लेटों.

3. बढ़ते पैर

  1. संदंश का उपयोग करके स्लाइड पर पैर स्थानांतरित करें और पूर्वकाल पक्ष को ऊपर की ओर उन्मुख करें। बढ़ते मीडिया के साथ पैरों को कवर करें (चित्रा 1K, एल)।
    नोट: विच्छेदित पैरों को एक P1000 पिपेट टिप के साथ एस्पिरेटेड किया जा सकता है यदि नीचे बोर को रेजर ब्लेड से काटकर चौड़ा किया जाता है।
  2. मॉडलिंग मिट्टी की एक छोटी सी गेंद भर में coverslip कोनों scraping द्वारा एक 22x22 mm2 coverslip (# 1.5 मोटाई) के लिए मिट्टी spacers जोड़ें। प्रत्येक कोने में मिट्टी की एक छोटी मात्रा 1-2 मिमी मोटी होनी चाहिए (चित्रा 1K)।
  3. स्लाइड को कवर करने के लिए, स्लाइड की ओर सामना करने वाले मिट्टी के स्पेसर्स के साथ कवरस्लिप जोड़ें और ध्यान से कोनों पर धक्का दें जब तक कि कवरस्लिप सिर्फ फीमर की सतह को छू न जाए।
  4. वाष्पीकरण को रोकने के लिए, नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले एक अंधेरे स्थान (लगभग 10 मिनट) में सूखने दें।

4. इमेजिंग

  1. confocal माइक्रोस्कोप द्वारा छवि (चित्रा 1M). विच्छेदन की गुणवत्ता का बेहतर आकलन करने के लिए एक प्रेषित प्रकाश चैनल शामिल करें और ब्याज के क्षेत्र में स्पष्ट रूप से बाधित मांसपेशी फाइबर के साथ नमूनों को छोड़ दिया जाना चाहिए।
    1. 2x ज़ूम के साथ 20x आवर्धन के साथ इमेजिंग z-stacks शुरू करें और फीमर की मोटाई के अनुरूप ~ 40 मिमी की कुल छवि गहराई। फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाने के लिए, Nyquist नमूनाकरण के अनुरूप संकल्पों पर छवियों को कैप्चर करें (हम 8-10 μs / पिक्सेल की निवास सेटिंग के साथ 1024 x 1024 पिक्सेल का उपयोग कर रहे हैं)। सिग्नल तीव्रता रैखिक सीमा में होनी चाहिए जो उच्च वोल्टेज लाभ सेटिंग्स को समायोजित करके प्राप्त की जाती है। एक बार जब लाभ सेटिंग्स एक प्रयोग के भीतर नमूनों की एक श्रृंखला के लिए सेट की जाती हैं, तो उन्हें नहीं बदला जाना चाहिए ताकि संकेत तीव्रता की तुलना नमूनों के बीच की जा सके।
  2. इमेजिंग सिनैप्टिक बाउटन और अन्य उपकोशिकीय संरचना के लिए, ≥60x आवर्धन पर कॉन्फोकल छवियों को कैप्चर करें। डिटेक्टर सेटिंग्स रैखिक सीमा में होनी चाहिए, जबकि पिक्सेल घनत्व, निवास सेटिंग्स और जेड-गहराई कम आवर्धन (चरण 4.1) पर कैप्चर की गई छवियों के लिए समान होनी चाहिए।

Representative Results

चित्रा 4 एक मेटाथोरेसिक पैर का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है जो एंटी-एचआरपी, एंटी-डीएलजी और फेलोइडिन के साथ सना हुआ है। विच्छेदन के लिए जो फीमर के समीपस्थ भाग से छल्ली को हटाते हैं, रूढ़िवादी आर्बर्स कण्डरा के पास स्पष्ट होंगे जो ऑटोफ्लोरेसेंस द्वारा आसानी से पता लगाया जाता है। ध्यान दें कि पैर में एंटीबॉडी प्रवेश उस क्षेत्र से परे थोड़ी दूरी के लिए होता है जिसमें छल्ली को हटा दिया गया है (चित्रा 4 ए)। इन क्षेत्रों को प्रभावी ढंग से चित्रित किया जा सकता है जब मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत मौजूद होता है। कम आवर्धन पर इमेजिंग (2x ज़ूम के साथ 20x) 1 के एक आसान निर्धारण की अनुमति देता है) कितना छल्ली हटा दिया जाता है, और 2) क्या विच्छेदन के दौरान नुकसान हुआ। बढ़ी हुई आवर्धन (60x) tilm (चित्रा 4B) पर रूढ़िवादी अनुमानों को दर्शाता है। हमारे काम ने एक एमएन पर ध्यान केंद्रित किया है, संभवतः आई-एमएन वंश से व्युत्पन्न है जो समीपस्थ फीमर (बॉक्स, चित्रा 4 बी और चित्रा 4 सी) में तिल्म को इनरवेट करता है। आवर्धन को आगे बढ़ाना (2x ज़ूम के साथ 100x) सिनैप्टिक बाउटन (चित्रा 4 डी) के प्रभावी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देता है।

समय के साथ वयस्क एनएमजे में रूपात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, हमने पहले एएलएस के मॉडल के रूप में डीएसडी 1 म्यूटेंट का उपयोग किया है। Bouton सूजन dsod1H71Y उत्परिवर्ती dsod1nulland dsod1 + (चित्रा 5A, बी) के सापेक्ष वृद्ध dsod1H71Y उत्परिवर्ती में होता है। लार्वा NMJ में, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NC82 का उपयोग अक्सर सक्रिय क्षेत्रों को लेबल करने के लिए किया जाता है और इन संरचनाओं को वयस्क NMJ (चित्रा 5 C) में आसानी से देखा जा सकता है। कमजोर-सकारात्मक एचआरपी अक्षतंतु शाखाएं dsod1H71Y उत्परिवर्ती में प्रचुर मात्रा में हैं और ये शाखाएं अक्सर कमजोर और फैलाना बीआरपी स्थानीयकरण (तीर) दिखाती हैं।

न्यूरोडीजेनेरेशन के लिए महत्वपूर्ण, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी अक्सर समुच्चय में पाए जाने वाले यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन का पता लगा सकते हैं, और हमने वृद्ध उत्परिवर्ती डीसोड 1 मक्खियों में एमएन के टर्मिनल अक्षतंतुओं के भीतर और साथ ही मांसपेशियों के भीतर यूबिकिटिनेटेड समुच्चय का पता लगाया है (चित्रा 6 ए)। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया लेबलिंग एंटीबॉडी भी उम्र के साथ रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगा सकते हैं (चित्रा 6 बी)।

कुछ तैयारियों के लिए, विच्छेदन के दौरान मांसपेशियों की क्षति नमूने को अनुपयोगी बनाती है। सबसे पहले, इस तरह की क्षति एक सामान्य घटना हो सकती है, लेकिन अभ्यास के साथ सुधार होता है। अच्छे विच्छेदन के उदाहरण चित्र 7A, C को दर्शाते हैं जबकि खराब विच्छेदन चित्र 7B, D में दिखाए गए हैं। खराब विच्छेदन मांसपेशियों के तंतुओं के विघटन का कारण बनता है जैसा कि चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी (चित्रा 7 बी) या फ्लोरोसेंट-संयुग्मित फेलोइडिन (चित्रा 7 डी, तीर) द्वारा कल्पना की गई लापता मांसपेशी फाइबर द्वारा पता लगाया गया है। मांसपेशियों को लेबल करने के लिए फालोइडिन का उपयोग करने का संयोजन, और संचारित प्रकाश छवियां ऐसी मांसपेशियों की क्षति का पता लगाने में मदद कर सकती हैं जो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत देखते समय स्पष्ट नहीं हो सकती हैं।

Figure 3
चित्र 3. ड्रोसोफिला पैर की शारीरिक रचना। (ए) एक मेटाथोरेसिक पैर के पूर्वकाल पक्ष का आरेख, जो पीछे की ओर मौजूद प्रमुख नग्न छल्ली के विपरीत ब्रिसल्स की उपस्थिति की विशेषता है। खंडित पैर में कॉक्सा (सीएक्स), ट्रॉचेंटर (टीआर), फीमर (एफई), टिबिया (टीआई), 5 टार्सल सेगमेंट (टीए 1-5), और पंजा (सीएल) को समीपस्थ (पीआर) से डिस्टल (डी) तक के क्रम में शामिल किया गया है। पृष्ठीय (डी) और वेंट्रल (वी) फीमर के पक्षों को भी इंगित किया गया है। स्केल बार = 100 μm. (बी) टिबिया लेवेटर (टिल्म), टिबिया डिप्रेसर (टीआईडीएम), लंबी कण्डरा मांसपेशी 2 (एलटीएम 2) और टिबिया रेडक्टर (टिर्म) मांसपेशियों और अक्षतंतु के अनुमानों वाले फीमर का आरेख समीपस्थ फीमर इनरवेटिंग में तिल्म को इनरवेट करता है। इन रूढ़िवादी अक्षीय अनुमानों को आई-वंश न्यूरोब्लास्ट्स 16 से व्युत्पन्न माना जाता है, और दूसरा आर्बराइजेशन विच्छेदन (बॉक्स्ड) द्वारा उपयोग करने के लिए सबसे आसान है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. विच्छेदित मेटाथोरेसिक फीमर ने टिल्म को अंतर्निहित करने वाली रूढ़िवादी एमएन वास्तुकला का खुलासा किया। Immunocytochemistry न्यूरॉन्स (HRP), डिस्क-लार्ज (DLG) और मांसपेशी (phalloidin) को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जेड-स्टैक को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा पूरे फीमर के माध्यम से कैप्चर किया गया था और अधिकतम श्रृंखला प्रक्षेपण के रूप में दिखाया गया था। (ए) विच्छेदन के दौरान हुई कोई पता लगाने योग्य मांसपेशियों की क्षति को चित्रित करने के लिए एक प्रेषित प्रकाश चैनल को भी शामिल किया गया था। छवि को 20x आवर्धन, स्केल बार = 50 μm पर कैप्चर किया गया था। (बी) टाइलम (बॉक्स्ड क्षेत्र, केंद्र), स्केल बार = 20 μm के साथ जुड़े arbors की पहचान की; और (सी) 60x आवर्धन पर, स्केल बार = 20 μm। (डी) डीएलजी के आसपास के बाउटन जंगली प्रकार के जानवरों में स्पष्ट था जब 2x ज़ूम के साथ 100x आवर्धन पर चित्रित किया गया था; स्केल बार = 2 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. बाउटन आकृति विज्ञान में आयु-निर्भर परिवर्तनों का उदाहरण जो पैर विच्छेदन तकनीक का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। बुटन सूजन वृद्ध dsod1H71Y उत्परिवर्ती में देखा जाता है। (ए) युवा (नए eclosed, दिन 0 वयस्कों) और पुराने (दिन 10) मक्खियों, स्केल बार = 1 μm से HRP दाग boutons की प्रतिनिधि छवियों. (बी) बाउटन आकार ों को संबंधित जीनोटाइप से इमेजजे के भीतर माप समारोह का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। p<0.0001 (पोस्ट-हॉक टुकी परीक्षण के साथ 2-तरफ़ा एनोवा)। (सी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NC82 (एंटी-ब्रूचपायलट) के साथ लेबल किए गए सिनैप्टिक बाउटन के भीतर सक्रिय क्षेत्र; स्केल बार = 1 μm. 20 से संशोधित चित्रइस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. ड्रोसोफिला पैर की तैयारी में उपयोग किए जाने वाले न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग से जुड़े सामान्य मार्कर। (ए) उपकोशिकीय पॉलीयूबिकिटिनेटेड समुच्चय टर्मिनल अक्षतंतुओं और वृद्ध dsod1H71Y मक्खियों की मांसपेशियों में पाए जाते हैं। एंटी-पॉलीयूबिकिटिन (FK2) का उपयोग करके Immunocytochemistry वृद्ध dsod1H71Y / H71Y, स्केल बार = 20 μm (बाएं) और 5 μm (दाएं) में puncta (तीर) का पता लगाता है। (बी) सूजन माइटोकॉन्ड्रिया एंटी-एटीपी 5 ए, स्केल बार = 1 μm का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। 20 से संशोधित चित्रइस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7. अच्छे और खराब विच्छेदन के उदाहरण। (ए) विच्छेदन जो अंतर्निहित मांसपेशी वास्तुकला को बाधित नहीं करता था। (बी) एक खराब विच्छेदन का एक उदाहरण जो फटे हुए मांसपेशी फाइबर (तीर) को दर्शाता है और विश्लेषण के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। दोनों नमूनों को चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। स्केल बार = 50 μm. (सी) एचआरपी (हरे) और फालोइडिन (नीले) के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित एक अच्छे विच्छेदन का उदाहरण। (डी) एक गरीब विच्छेदन गायब TILM के पृष्ठीय मांसपेशी तंतुओं लापता (तीर). स्केल बार = 50 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीबॉडी / दाग तनुकरण*
विरोधी ATP5A 1:500
विरोधी bruchpilot (nc82) 1:20
एंटी-सिस्टीन स्ट्रिंग प्रोटीन (ab49) 1:50
विरोधी डिस्क बड़े (4F3) 1:200
एंटी-एचआरपी 1:550
विरोधी polyubiquitin (FK2) 1:1000
एंटी-रेपो (8D12) 1:5
बकरी विरोधी माउस द्वितीयक एंटीबॉडी 1:800
फालोइडिन 1:2000
* 5% NGS में पतला

तालिका 2. एंटीबॉडी और dilutions. इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं को सामग्री सूची में सूचीबद्ध किया गया है।

Discussion

ड्रोसोफिला वयस्क पैर न्यूरोडीजेनेरेशन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है जो न्यूरोब्लास्ट वंशों और रूढ़िवादी आर्बराइजेशन पैटर्न से मैप किए गए अच्छी तरह से विशेषता वाले एमएन के साथ सापेक्ष सादगी को देखते हैं। कई रिपोर्टों ने पहले न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग 21,22 के अध्ययन के लिए पैर एमएन का उपयोग किया है। इन अध्ययनों ने छल्ली के माध्यम से छवि बनाने के लिए एक दमनकारी सेल मार्कर (MARCM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण के साथ संयुक्त GFP-व्यक्त लाइनों का उपयोग किया और रूपात्मक परिवर्तनों की एक श्रृंखला का दस्तावेजीकरण किया। उच्छेदित छल्ली के साथ immunocytochemistry द्वारा इमेजिंग वयस्क NMJs उपलब्ध एंटीबॉडी के एक टूलबॉक्स का उपयोग करके जटिल आणविक परिवर्तनों को ट्रैक करने की क्षमता के साथ आगे लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।

इस प्रोटोकॉल का इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री भाग अपेक्षाकृत मानक है और इसे जीनोटाइप से स्वतंत्र रूप से लागू किया जा सकता है (ड्रोसोफिला के साथ उपयोग के लिए सामान्य एंटीबॉडी स्टेनिंग विधियों के उत्कृष्ट विवरण के लिए देखें23)। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति तीव्रता, अक्षतंतु शाखा की लंबाई, और बाउटन संख्या और आकार जैसे पैरामीटर विभिन्न प्रकार के उपलब्ध इमेजजे मैक्रोज़ का उपयोग करके निर्धारित किए जा सकते हैं एक बार छवियों पर कब्जा कर लिया जाता है और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत तरीके प्रकाशित किए जाते हैं (उदाहरण के लिए, देखें24,25,26)। इस प्रकार, विच्छेदन तकनीक यहां वर्णित मुख्य नवाचार है। विच्छेदन से पहले, मक्खियों को क्यूटिकुलर हाइड्रोकार्बन को स्ट्रिप करने के लिए एक अल्कोहल में डुबोया जाता है। इथेनॉल और मेथनॉल दोनों का उपयोग आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए किया जाता है; हालांकि, हमने केवल मेथनॉल का उपयोग किया है। विच्छेदन सफलता के लिए महत्वपूर्ण कई कारक हैं: सबसे पहले, बेवल के साथ संशोधित संदंश का उपयोग करना छल्ली के साथ बहुत सतही संपर्क की अनुमति देता है। दूसरा, 60-100x कुल आवर्धन में सक्षम एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना ताकि छल्ली की सतह स्पष्ट रूप से दिखाई दे। कम अधिकतम आवर्धन वाले माइक्रोस्कोप के लिए, 2x उद्देश्य सबसे आम ब्रांडों के लिए उपलब्ध हैं और मौजूदा लेंस के साथ संयुक्त होने पर पर्याप्त होना चाहिए। तीसरा, प्रारंभिक निर्धारण चरण छल्ली भंगुर बनाता है और नीचे की मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना दूर खींचना आसान बनाता है। इस चरण में ओवर-फिक्सेशन पूरे पैर को प्रभावी विच्छेदन के लिए बहुत कठोर बनाता है। इसलिए, प्रारंभिक निर्धारण 30 मिनट तक सीमित होना चाहिए। फॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेटिव इस छोटी अवधि के दौरान अंतर्निहित ऊतक को प्रभावी ढंग से क्रॉसलिंक करने के लिए पर्याप्त प्रवेश नहीं करेगा और इस प्रकार एक दूसरा निर्धारण चरण आवश्यक है। दूसरे निर्धारण से पहले, ऊतकों को आकारिकी में गिरावट और परिवर्तन को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। चौथा, हमने नमूनों को विच्छेदन पाया है जबकि ठंड भी महत्वपूर्ण है, संभवतः इसी तरह के कारणों से उस छल्ली भंगुर है और एक छोटे से टुकड़े को अधिक आसानी से हटाया जा सकता है।

अभ्यास के साथ, हम पाते हैं कि ~ 50% विच्छेदन कोई समझदार ऊतक क्षति के भीतर उपयोग करने योग्य होगा। हालांकि यह प्रतिशत कुछ अन्य ऊतकों के सापेक्ष कम लग सकता है, विच्छेदन प्रक्रिया तेज है, और कई पैरों को 30-60 मिनट में संसाधित किया जा सकता है। इसलिए, भले ही सफलता की दर शुरू में कम हो, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए 4-5 अच्छे नमूने प्राप्त करना संभव है। हालांकि, एक सीमा किसी भी समय उपलब्ध मक्खियों की संख्या हो सकती है यदि जीनोटाइप और / या उम्र के परिणामस्वरूप पर्याप्त घातकता होती है।

एक और सीमा यह है कि हम आकार के कारण फीमर के समीपस्थ क्षेत्र से परे पैर के अन्य क्षेत्रों को विच्छेदित करने में सक्षम नहीं हैं। इस प्रकार, हम टीआईएलएम को मज़बूती से इनरवेट करने वाले पहचाने गए एमएन आर्बर्स का अध्ययन कर सकते हैं और विच्छेदन करते समय पैर को उन्मुख करने के तरीके में छोटे बदलावों के साथ टिबिया डिप्रेसर मांसपेशी के ऊपर छल्ली को विच्छेदित करना संभव है। हालांकि, विच्छेदन के दौरान चेताक्षीय वास्तुकला को बाधित किए बिना पैर के अन्य क्षेत्रों तक पहुंचना अधिक कठिन साबित हुआ है।

यहां, हम वयस्क एनएमजे में परिवर्तनों का पता लगाने के लिए विच्छेदन विधियों को प्रस्तुत करते हैं, जो परिभाषित एमएन के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके तिल्म को इनरवेट करते हैं। पैर एक सरल प्रणाली के रूप में उपयोगी है, केवल ~ 50 एमएन द्वारा अंतर्निहित है और अच्छी तरह से वर्णित शरीर रचना विज्ञान के साथ 14 मांसपेशियों से युक्त है। विच्छेदित पैर की तैयारी का उपयोग जीनोटाइप में किया जा सकता है और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में रिपोर्टर जीन निर्माणों के जीनोटाइपिक रूप से जटिल स्टॉक के निर्माण की आवश्यकता के बिना एनएमजे विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एंटीबॉडी का एक सूट उपलब्ध है। यह दृष्टिकोण एमएन रोगों और अन्य उम्र से संबंधित स्थितियों के लिए एनएमजे में परिवर्तनों के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करेगा।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इमेजिंग पर सलाह के लिए एरिक रॉबर्ट्स को धन्यवाद देते हैं। हम रोड आइलैंड कॉलेज में सूचना प्रौद्योगिकी सेवाओं और विशेष रूप से माइकल केन और जेक डगलस को वीडियोग्राफी के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एंटी-डीएलजी और एंटी-बीआरपी क्रमशः यूसी-बर्कले और Universitaetsklinikim Wuerzburg द्वारा विकसित किए गए थे, और विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किए गए थे, जो एनआईएच के एनआईसीएचडी द्वारा बनाया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए 52242, संयुक्त राज्य अमेरिका में बनाए रखा गया था। यहां रिपोर्ट किए गए शोध को रोड आइलैंड इंस्टीट्यूशनल डेवलपमेंट अवार्ड (आईडीईए) नेटवर्क ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस द्वारा अनुदान संख्या [P20GM103430] के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय चिकित्सा विज्ञान संस्थान से पूरी तरह से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
24 well plates Corning 3473 Hydrophobic, ultra-low attachment surface
2x objective accessory Olympus 110AL2X Screw-on attachment
Anti-ATP5A primary antibody Abcam ab14748 Mouse monoclonal
Anti-bruchpilot primary antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Mouse monoclonal
Anti-discs large primary antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 Mouse monoclonal
Anti-hrp primary antibody Jackson Immuno Research 123-605-021 Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody Millipore Sigma 04-263 Mouse monoclonal
Confocal Microscope Olympus FV1000 Objectives (NA):  10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)
Coverslips Corning 285022 160-190 mm thickness
Dissecting forceps Fine Science Tools 11252-00 Dumont #5SF
Dissecting Microscope Olympus SZ61
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500 37% stock stabilized with methanol
Goat anti-mouse secondary antibody Jackson Immuno Research 115-545-146 Alexa Fluor 488 conjugated
Goat Serum Novus Biologicals NB036768 0.2 mm filtered
Laboratory sealing tape Fisher Scientific 03-448-254 Parafilm M
Methanol Fisher Scientific A413
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-123 76mm x 25mm
Mounting media Molecular Probes S36972 Slowfade Diamond mounting media
Nonionic surfactant Acros Organics 215680010 Triton-X 100
Nutator Fisher Scientific S06622
Phalloidin Invitrogen A34055 Alexa Fluor 555- conjugated
Sharpening stone Fine Science Tools 29008-01
Silicone elastomer Electron Microscopy Sciences 2423610 Sylgard 184

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References

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Stilwell, G., Agudelo, A. Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron. J. Vis. Exp. (180), e62844, doi:10.3791/62844 (2022).

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