Summary
نحن نصف تقنية تشريح تحافظ على بنية التقاطع العصبي العضلي وتمكن من دراسة كيميائية مناعية مفصلة للخلايا العصبية الحركية في ساق دروسوفيلا البالغة.
Abstract
Drosophila melanogaster يمثل نموذجا وراثيا لدراسة بنية الخلايا العصبية ووظيفتها، والتغيرات اللاحقة في حالات المرض. غالبا ما يستخدم التقاطع العصبي العضلي اليرقاتي المميز جيدا لمثل هذه الدراسات. ومع ذلك ، فإن التطور السريع لليرقات يليه انحلال العضلات وإعادة عرض الجهاز العصبي أثناء التحول يجعل هذا النموذج إشكاليا لدراسة التغيرات التنكسية البطيئة المعتمدة على العمر مثل تلك التي تحدث في التصلب الجانبي الضموري. بدلا من ذلك، يعيش الذباب البالغ لمدة 90 يوما ويمكن استخدام ساق البالغين لدراسة تغيرات الخلايا العصبية الحركية على مدار عمر البالغين باستخدام التصوير الفلوري في الجسم الحي من خلال السفاح. هنا، ونحن نصف تقنية تشريح الساق إلى جانب الكيمياء المناعية، والذي يسمح لدراسة التغيرات الجزيئية في تقاطع العصبية والعضلية من الخلايا العصبية الحركية الساق الكبار المحددة. ويمكن أن يقترن هذه التقنيات مع عدد لا يحصى من الأجسام المضادة وضع العلامات على حد سواء قبل وبعد الهياكل متشابك. معا هذه الإجراءات تسمح وصفا أكثر اكتمالا للتغيرات البطيئة التي تعتمد على العمر في الذباب الكبار ويمكن تطبيقها عبر نماذج مرض الخلايا العصبية الحركية متعددة.
Introduction
تشمل أمراض الخلايا العصبية الحركية (MN) مجموعة من الحالات غير المتجانسة التي تشمل الانحطاط التدريجي مما يؤدي إلى إهدار العضلات والشلل كنمط الظاهري السريري الأساسي1. وعلى الرغم من ندرة الانتشار العالمي بنسبة 4.5 لكل 000 100، فمن المتوقع أن يزداد هذا الانتشار مع شيخوخة السكان(2). التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو مرض MN الأكثر شيوعا (MND) وعادة ما يكون قاتلا في غضون فترة قصيرة من التشخيص مع عدم وجود علاجات تعديل المرض المتاحة3. تشترك MNDs في مرحلة مشتركة طويلة قبل أعراض مع تغييرات العلامات الحيوية الجزيئية المبكرة وتغييرات التصوير الوظيفي التي شوهدت في المرضى4. كما لوحظ الأمراض الخلوية في وقت مبكر قبل أعراض في نماذج الأمراض غير البشرية5،6،7،8. دراسة التغيرات المبكرة عند التقاطع العصبي العضلي مهم لفهم مسببات الأمراض مرض MN ويمكن أن تساعد في تطوير التشخيص المبكر والعلاجات المحتملة.
توجد ثروة من الأدوات الوراثية والجزيئية في Drosophila لتشريح بنية ووظيفة التقاطع العصبي العضلي (NMJ ، see9 لمراجعة NMJ اليرقات ذات السمات الجيدة). هذه الأدوات جنبا إلى جنب مع عمر قصير جعل Drosophila نموذجا ممتازا لدراسة التغيرات العصبية في NMJ. على وجه التحديد، MNs الداخلية عضلات الكبار موجودة طوال عمر البالغين ~ 90 يوما وتخضع لعمليات الشيخوخة العادية10،11،12،13. ولذلك توفر MNs الكبار فرصة لدراسة التغيرات التنكسية البطيئة على النقيض من NMJs اليرقات التي توجد لفترة قصيرة ~ 1 أسبوع فقط قبل التحول14،15.
هنا، نقوم بوصف إجراء تشريح يسمح لنا بإجراء تحليل كيميائي مناعي لل MNs في ساق البالغين. يتم تنشيط كل ساق بالغة من قبل ~ 50 MNs ، والتي متشابكة على الساق المرتبطة العضلات لدفع الحركة. وقد وصفت جيدا تشريح الساق، وعلم وظائف الأعضاء الميكانيكية، وعلم الأعصاب16،17،18. وقد سبق أن تميزت أربورات أكسون من MNs الساق عن طريق التصوير من خلال كتيكل في مجموعات الخلايا مملوءة بالظهر أو المسمى وراثيا باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي الأطراف وقد نشرت أساليب التصوير سابقا19. تحافظ طرق التشريح المعروضة هنا على مورفولوجيا متفرعة المحور العصبي وتسمح لنا باستغلال مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة لتسمية المكونات الجزيئية المختلفة ل NMJ. وقد ركز عملنا السابق على إسقاطات MN محددة في الساق metathoracic (3) ، الذي innervates عضلة الساق ليفاتور (tilm) ويظهر أنماط التشجير متسقة وأرقام بوتون. في البداية درسنا التغيرات المعتمدة على العمر في Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) المسوخ ووجدت تعديلات تتفق مع تفكيك NMJ20. توفر طرق التشريح هذه الفرصة لتوصيف أفضل للتغيرات التنكسية البطيئة في NMJ لنماذج ALS الأخرى والدراسات الأساسية للشيخوخة وغيرها من الأمراض المرتبطة بال MN.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 ملخص سير العمل لتشريح الساقين. راجع البروتوكول للحصول على خطوات تفصيلية. (أ، ب) يتم اختيار الذباب وتخديره. (ج) يتم نقل الذباب إلى الميثانول وغسلها مع برنامج تلفزيوني. (د) تتم إزالة الساقين metathoracic في قاعدة كوكسا في حين تصور مع المجهر تشريح (~ 30x التكبير)؛ شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ه) ثم يتم إصلاح الساقين في حل 3.7٪ الفورمالديهايد / PBS (FA) لمدة 30 دقيقة داخل آبار من لوحات 24 بئرا ومن ثم تتم إزالة الاتحاد الإنجليزي عن طريق يغسل مع برنامج تلفزيوني. (واو، ز، ح) يتم نقل الساقين إلى صواني تشريح الاستومر السيليكون ويتم إزالة قطعة من الجلد من عظم الفخذ القريب باستخدام ملقط مشطوف في حين تصور تحت المجهر تشريح في 80x; شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (I) الساقين هي مرحلة ما بعد تشريح ثابتة في الاتحاد الانجليزي وغسلها في برنامج تلفزيوني ثم PBT (PBS + 0.1٪ غير الأيونية السطحي). (J) الساقين تتعرض لتلطيخ الكيميائية المناعية. (ك، ل) يتم نقل الساقين إلى شريحة زجاجية، مسح في وسائل الإعلام المتصاعدة، وتغطي مع غطاء يحتوي على الفواصل الطينية. أشرطة المقياس = 2 مم و 500 ميكرومتر. (M) يتم تصوير الساقين عن طريق المجهر confocal. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
ويرد وصف لإجراءات إعداد حلول العمل المستخدمة بالاقتران مع هذا البروتوكول في الجدول 1.
| الكاشف | اعداد | خزن | |||
| برنامج تلفزيوني | جعل مخزون العمل من برنامج تلفزيوني 1x من محلول الأسهم PBS 10x عن طريق التخفيف في الماء المقطر. يجب أن يكون رقم الحموضة لمخزون PBS العامل 7.2- 7.4 | 4 درجة مئوية لمدة 1+ أشهر حتى يظهر التلوث البكتيري. | |||
| PBT | 1x حل برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ غير الأيونية السطحي. | 4 درجة مئوية لمدة 1+ أشهر حتى يظهر التلوث البكتيري. | |||
| الاتحاد الإنجليزي لكرة القدم | 3.7٪ حل الفورمالديهايد المصنوع من مخزون الفورمالديهايد 37٪ والمخفف في برنامج تلفزيوني 1x. | درجة حرارة الغرفة. جعل الطازجة كل يوم من تشريح | |||
| تنبيه: الفورمالديهايد الموردة كحل الأسهم 37٪ هو مادة مسرطنة محتملة وينبغي أن تضعف في غطاء محرك السيارة الدخان. | |||||
| 5٪ NGS | 5٪ مصل الماعز العادي المخفف في PBT. يجب أن يتطابق المصل المستخدم مع أنواع الأجسام المضادة الثانوية التي سيتم استخدامها. | 4 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى يظهر التلوث البكتيري | |||
الجدول 1 - الجداول حلول لأداء الكيمياء المناعية للساق Drosophila الكبار.
1. التثبيت الأولي للأنسجة
- حدد ما يقرب من 10 ذباب لكل نوع وراثي وعمر. تخدير على منصة ذبابة تحت ثاني أكسيد الكربون (الشكل 1A، B).
ملاحظة: ابدأ بالذباب أكثر من اللازم لضمان حجم عينة كبير بما فيه الكفاية بعد تشريح. - باستخدام فرشاة الطلاء، نقل الذباب إلى الميثانول البارد في بئر زجاجي أو طبق لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة تقريبا (الشكل 1C). يقوم الميثانول بتشحيم الهيدروكربونات القطعية ويمكن الآن غمر الذباب بدلا من تعويمه في المحاليل المائية.
- مع ملقط، نقل الذباب بعناية إلى برنامج تلفزيوني. شطف 3x في الجليد الباردة PBS لإزالة الميثانول الزائد والحفاظ على الذباب في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى تشريح والتثبيت. عند هذه النقطة، تشريح الذباب وإصلاح في أقصر وقت ممكن (<30 دقيقة).
- لعزل الساقين، نقل الذباب إلى طبق تشريح الاستومر السيليكون مليئة برنامج تلفزيوني الباردة، وإزالة الساقين metathoracic في كوكسا باستخدام اثنين من أزواج من ملقط دومون # 5 أو قطع الساقين مع مقص فانا (الشكل 1D). نقل الساقين إلى بئر في لوحة بلاستيكية 24 بئر مليئة 1 مل من برنامج تلفزيوني والحفاظ على لوحة على الجليد حتى تتم إزالة جميع الساقين ونقلها إلى الآبار.
ملاحظة: يمكن لكل بئر أن يحمل ما لا يقل عن 20 ساقا. - استبدال حل برنامج تلفزيوني مع 1 مل من حل الاتحاد الانجليزي وتدوير على نوتاتور لمدة 30 دقيقة (الشكل 1E). يجب ضبط إعداد نوتاتور بسرعة متوسطة (17 دورة في الدقيقة). تأكد من أن الساقين مغمورتان تماما في محلول FA خلال هذا الوقت لتثبيت مناسب.
- لإزالة محلول FA، اغسل في 1 مل من PBS 3x بسرعة تليها 3 يغسل إضافية لمدة 5 دقائق كل في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عقد الأنسجة في 1 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد قبل، وخلال خطوات تشريح المذكورة أدناه.
2. إزالة قطع الساق وتلطيخ الأجسام المضادة
- إزالة كندل الساق
- ملقط تشريح حاسمة للنجاح. إدخال الانحناءات موازية طفيفة في كلا الشقين في نهاية # 5 ملقط غرامة فائقة لتوفير شطبة التي تسمح للكفاح أن أمسك سطحيا بدلا من أن تكون مطعون، والتي يمكن أن تدمر الأنسجة (الشكل 1F، G).
ملاحظة: يجب أن لا تزال الشقات المنحنية بالتوازي تجري اتصالات مع بعضها البعض طوال طول الشق عند إغلاقها (الشكل 2). - نقل الساقين إلى طبق الاستومر السيليكون في برنامج تلفزيوني لتشريح. توجيه الساق بحيث يواجه الجانب الأمامي (انظر الشكل 3 لتشريح الساق ومعلومات التوجيه). باستخدام زوج واحد من ملقط، عقد الجزء الساق ضد طبق الاستومر السيليكون. باستخدام ملقط أخرى عقدت الجانب شطبة أسفل، والاستيلاء على قطعة من الجلد على الطرف القاصي من عظم الفخذ وسحب في الاتجاه القريب نحو trochanter.
- الحفاظ على إزالة الجلد منهجيا حتى العضلات العارية مرئية في جميع أنحاء نهاية قريبة من عظم الفخذ (الشكل 1F، G، H).
ملاحظة: فقط إجراء اتصال سطحي مع الساقين باستخدام الجانب مشطوف من ملقط لتجنب سحب العضلات. - مرة واحدة يتم تشريح جميع الساقين، واستبدال برنامج تلفزيوني مع الاتحاد الانجليزي لمرحلة ما بعد إصلاح الساقين لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (الشكل 1I). غسل العينات في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات سريعة ثم 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل في PBT (الشكل 1J).
ملاحظة: إذا تلطيخ مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة NC82 (المضادة للbruchpilot) لتسمية المناطق النشطة، بعد الإصلاح لمدة 20 دقيقة كما هذا المستضد حساسة لتثبيتات أطول.
- ملقط تشريح حاسمة للنجاح. إدخال الانحناءات موازية طفيفة في كلا الشقين في نهاية # 5 ملقط غرامة فائقة لتوفير شطبة التي تسمح للكفاح أن أمسك سطحيا بدلا من أن تكون مطعون، والتي يمكن أن تدمر الأنسجة (الشكل 1F، G).
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم ملقط معدلة تستخدم لتشريح الساقين الكبار. (أ) يتم ثني نهايات ملقط ثم بالارض في أسفل (السهم) خلق شطبة عن طريق الإيداع على حجر شحذ. (ب) وعلى النقيض من ذلك، فإن شوكات ملقط غير معدلة ليست عازمة. شريط المقياس = 1 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تلطيخ الأجسام المضادة
- لمنع أنسجة تلطيخ الأجسام المضادة، استبدل 1 مل من PBT بمحلول مانع يتكون من 1 مل من 5٪ NGS مخفف في PBT. حضانة تشريح الساقين لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (17 دورة في الدقيقة). أثناء جميع الحضانات، قم بتغطية الآبار بشريط الختم بالإضافة إلى الغطاء البلاستيكي (الشكل 1J).
ملاحظة: تستخدم 24 لوحة بئر في الكيمياء المناعية بدلا من 1.5 مل أو 2 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق لأن المحاولات السابقة لاستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيق أدت إلى كسر في الساقين وتلف الأنسجة. - إزالة حل حظر وإضافة 300 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل حظر جديدة. يجب أن يكون الحجم الصغير من الأجسام المضادة المستخدمة كافيا لتغطية الأنسجة. إعادة ختم الآبار مع مختبر ختم الشريط وغطاء من البلاستيك واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع اهتزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (الشكل 1J). ويرد وصف لمعلومات كاشفات الجسم المضاد العاملة والتركيزات المستخدمة في هذه الدراسات في الجدول 2.
- غسل الأجسام المضادة الأولية في 1 مل من PBT لمدة 3 مرات لفترة وجيزة ثم 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما (الشكل 1J).
ملاحظة: يمكن حفظ الأجسام المضادة الأولية المخففة وإعادة استخدامها إذا تم تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. - كتلة الأنسجة مرة أخرى في 1 مل من 5٪ NGS لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 C (الشكل 1J).
- إزالة 5٪ NGS حظر الحل وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الفلورية المخففة المناسبة اقتران الثانوية. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1:2000 تخفيف phalloidin مضان مترافق لتسمية العضلات (الشكل 1J).
- بالنسبة لاحتضانات الأجسام المضادة الثانوية، فقم بختم الآبار بشريط الختم المختبري والغطاء. أيضا، لوحات التفاف في رقائق الألومنيوم لحماية الفلوروفوريس من الضوء. حضانة لمدة 6-8 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C.
- غسل الأجسام المضادة الثانوية والثالويدين كما هو موضح في الخطوة 2.2.3 أعلاه. تغطية لوحات مع رقائق الألومنيوم بين يغسل لحماية الفلوروفوريس من الضوء.
- لمنع أنسجة تلطيخ الأجسام المضادة، استبدل 1 مل من PBT بمحلول مانع يتكون من 1 مل من 5٪ NGS مخفف في PBT. حضانة تشريح الساقين لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (17 دورة في الدقيقة). أثناء جميع الحضانات، قم بتغطية الآبار بشريط الختم بالإضافة إلى الغطاء البلاستيكي (الشكل 1J).
3. تصاعد الساقين
- نقل الساقين إلى شريحة باستخدام ملقط وتوجيه الجانب الأمامي لأعلى. تغطية الساقين مع تصاعد وسائل الإعلام (الشكل 1K، L).
ملاحظة: يمكن يستنشق الساقين تشريح مع تلميح ماصة P1000 إذا تم توسيع تتحمل أسفل عن طريق قطع مع شفرة حلاقة. - إضافة الفواصل الطين إلى 22x22 مم2 coverslip (# 1.5 سمك) عن طريق كشط زوايا coverslip عبر كرة صغيرة من الطين النمذجة. يجب أن يكون لكل زاوية كمية صغيرة من الطين سمكها 1-2 مم (الشكل 1K).
- لتغطية الشريحة، أضف الغطاء مع الفواصل الطينية التي تواجه نحو الشريحة ودفع بعناية على الزوايا حتى يغطي فقط يمس سطح عظم الفخذ.
- لمنع التبخر، قم بختم حواف الغطاء بطلاء الأظافر والسماح بالجفاف في مكان مظلم (حوالي 10 دقائق) قبل تخزينه عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.
4. التصوير
- الصورة بواسطة المجهر البؤري (الشكل 1M). وتشمل قناة ضوء المنقولة لتقييم أفضل لنوعية تشريح والعينات مع ألياف العضلات تعطلت بشكل واضح في مجال الاهتمام ينبغي التخلص منها.
- بدء التصوير z-مداخن مع التكبير 20x مع التكبير 2x وعمق الصورة الإجمالية من ~ 40 ملم المقابلة لسمك عظم الفخذ. للكشف عن الإشارة الفلورية، التقط الصور بدقات تتفق مع عينات Nyquist (نستخدم 1024 × 1024 بكسل مع إعداد ثابت من 8-10 ميكروس/بكسل). يجب أن تكون كثافة الإشارة في النطاق الخطي الذي يتحقق عن طريق ضبط إعدادات كسب الجهد العالي. بمجرد تعيين إعدادات الكسب لسلسلة من العينات داخل التجربة ، لا ينبغي تغييرها بحيث يمكن مقارنة كثافة الإشارة بين العينات.
- لتصوير نوبات متشابك وغيرها من البنية دون الخلوية، والتقاط الصور confocal في التكبير ≥60x. وينبغي أن تكون إعدادات الكاشف في النطاق الخطي، في حين ينبغي أن تكون كثافة البكسل وإعدادات الإسهاب وعمق z متشابهة للصور الملتقطة عند التكبير الأدنى (الخطوة 4-1).
Representative Results
يظهر الشكل 4 مثالا تمثيليا لساق ميتاثوراسيك ملطخة بمضادات الهرب، ومكافحة الدلغ، وال phalloidin. بالنسبة للتشريحات التي تزيل الجلد من الجزء القريب من عظم الفخذ ، ستكون الأربوريات النمطية واضحة بالقرب من الوتر الذي يتم اكتشافه بسهولة عن طريق الفلورة الذاتية. لاحظ أن اختراق الأجسام المضادة في الساق يحدث لمسافة قصيرة خارج المنطقة التي تمت إزالة كتل فيها (الشكل 4A). ويمكن تصوير هذه المناطق بشكل فعال عندما تكون إشارة الفلورسينس قوية موجودة. التصوير عند التكبير المنخفض (20x مع التكبير 2x) يسمح بسهولة تحديد 1) كم هو إزالة كتل، و 2) ما إذا كان الضرر حدث أثناء تشريح. زيادة التكبير (60x) يظهر الإسقاطات النمطية على tilm (الشكل 4B). وقد ركز عملنا على MN واحد، المستمدة على الأرجح من النسب I-MN التي innervate tilm في عظم الفخذ القريبة (مربع، الشكل 4B والشكل 4C). زيادة التكبير كذلك (100x مع 2x التكبير) يسمح لتصور فعال من boutons متشابك (الشكل 4D).
لدراسة التغيرات المورفولوجية في NMJ الكبار مع مرور الوقت، استخدمنا سابقا المسوخ dsod1 كنموذج ل ALS. يحدث تورم بوتون في المسوخ dsod1H71Y الذين تتراوح أعمارهم بين نسبة إلى dsod1nulland dsod1 + (الشكل 5A، B). في NMJ اليرقات ، وغالبا ما يستخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة NC82 لتسمية المناطق النشطة ، وهذا يمكن تصور هذه الهياكل بسهولة في NMJ الكبار (الشكل 5C). فروع محور المحور HRP ضعيفة الإيجابية وفيرة في المسوخ dsod1H71Y وهذه الفروع غالبا ما تظهر تعريب BRP ضعيفة ومنتشرة (الأسهم).
مهم للتجدد العصبي، يمكن للأجسام المضادة المتاحة تجاريا الكشف عن البروتينات في كل مكان غالبا ما توجد في المجاميع، ولقد اكتشفنا المجاميع في كل مكان داخل محاور المحطة الطرفية من MNs في الذباب dsod1 متحولة العمر وكذلك داخل العضلات (الشكل 6A). أيضا، يمكن للأجسام المضادة وضع العلامات الميتوكوندريا أيضا الكشف عن التغيرات المورفولوجية مع التقدم في السن (الشكل 6B).
بالنسبة لبعض التحضيرات، فإن تلف العضلات أثناء التشريح يجعل العينة غير صالحة للاستخدام. في البداية ، يمكن أن يكون هذا الضرر حدثا شائعا ، ولكن يحدث التحسن مع الممارسة. ومن الأمثلة على التشريح الجيد الشكل 7 ألف، جيم، بينما تظهر عمليات التشريح السيئة في الشكل 7B، دال. تشريح الفقراء يسبب عدم تنظيم ألياف العضلات كما تم الكشف عنها عن طريق المجهر النقيض المرحلة (الشكل 7B) أو ألياف العضلات المفقودة تصورها phalloidin الفلورسنت المترافقة (الشكل 7D، السهم). الجمع بين استخدام phalloidin لتسمية العضلات، والصور الخفيفة المنقولة يمكن أن تساعد على الكشف عن مثل هذا الضرر العضلات التي قد لا تكون واضحة عند عرض تحت المجهر تشريح.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تشريح الساق دروسوفيلا . (أ) رسم تخطيطي للجانب الأمامي من الساق الميتاثوراسيكية ، يتميز بوجود شعيرات على النقيض من بشرة عارية بارزة موجودة على الجانب الخلفي. وتتألف الساق مجزأة من كوكسا (CX)، trochanter (Tr)، عظم الفخذ (Fe)، الساق (Ti)، 5 شرائح القطران (Ta1-5)، ومخلب (Cl) من أجل من قريب (العلاقات العامة) إلى البعيدة (دي). كما يشار إلى جانبي عظم الفخذ الظهري (D) والبطين (V). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) رسم تخطيطي لعظم الفخذ الذي يحتوي على ليفاتور الساق (tilm) ، والاكتئاب الساق (tidm) ، وعضلات الوتر الطويلة 2 (ltm2) وعضلات إعادة تنشيط الساق (tirm) وإسقاطات المحور في عظم الفخذ القريب الداخلي للبلسم. ويفترض أن هذه الإسقاطات المحورية النمطية مشتقة من الأرومات العصبية من سلالة I16، والتشجير الثاني هو أسهل الوصول إليها عن طريق التشريح (محاصر). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تشريح عظم الفخذ metathoracic كشفت النمطية MN العمارة innervating tilm. تم استخدام الكيمياء المناعية لوضع علامة على الخلايا العصبية (HRP) والأقراص الكبيرة (DLG) والعضلات (phalloidin). تم التقاط Z-مداخن عن طريق التصوير المجهري confocal من خلال عظم الفخذ بأكمله وأظهرت كعرض سلسلة الحد الأقصى. (أ) كما أدرجت قناة ضوئية منقولة لتوضيح عدم حدوث أي تلف في العضلات يمكن اكتشافه أثناء التشريح. تم التقاط الصورة في 20x التكبير، شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (ب) المشتلات المحددة المرتبطة بالبلسم (المنطقة المعلبة، الوسط)، شريط المقياس = 20 ميكرومتر؛ و (ج) عند التكبير 60x، شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (د) DLG المحيطة boutons كان واضحا في الحيوانات البرية نوع عندما صورت في التكبير 100x مع التكبير 2x؛ شريط المقياس = 2 ميكرومتر الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم مثال على التغيرات التي تعتمد على العمر في مورفولوجيا بوتون التي يمكن اكتشافها باستخدام تقنية تشريح الساق. وينظر بوتون تورم في المسوخ dsod1H71Y الذين تتراوح أعمارهم بين. (أ) صور تمثيلية من boutons الملون HRP من الشباب (eclosed حديثا، اليوم 0 البالغين) والذباب القديم (اليوم 10)، شريط مقياس = 1 ميكرومتر. (ب) تم قياس أحجام بوتون كميا من الأنماط الجينية ذات الصلة باستخدام وظيفة القياس داخل ImageJ. ع<0.0001 (2-اتجاه ANOVA مع اختبار توكي ما بعد مخصص). (ج) المناطق النشطة داخل بوتونات متشابك المسمى مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة NC82 (المضادة للbruchpilot)؛ شريط المقياس = 1 ميكرومتر. الشكل المعدل من20Please انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 علامات مشتركة المرتبطة الأمراض العصبية المستخدمة في الاستعدادات الساق Drosophila. (أ) يتم الكشف عن المجاميع متعددة الخلايا في محاور المحطة الطرفية والعضلات من الذباب dsod1H71Y الذين تتراوح أعمارهم بين. يكشف علم الكيمياء المناعية باستخدام مضاد البوليبيكيتين (FK2) عن puncta (أسهم) في dsod1H71Y/H71Y القديمة، وشريط المقياس = 20 ميكرومتر (يسار) و5 ميكرومتر (يمين). (ب) يمكن الكشف عن الميتوكوندريا منتفخة باستخدام المضادة ATP5A، شريط مقياس = 1 ميكرومتر. الشكل المعدل من20Please انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم أمثلة على التشريح الجيد والفقير. (أ) تشريح التي لم تعطل بنية العضلات الكامنة. (ب) مثال على سوء تشريح التي أظهرت ألياف العضلات المتوترة (السهم) ، ولا يمكن استخدامها للتحليل. تم تصوير كلتا العينتين عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) مثال على تشريح جيد مصور بالمنظار المجهري البؤري مع HRP (أخضر) وphalloidin (أزرق). (د) تشريح الفقراء في عداد المفقودين ألياف العضلات الظهرية من تيلم في عداد المفقودين (السهم). شريط المقياس = 50 ميكرومتر يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الأجسام المضادة / وصمة عار | التخفيف* |
| مكافحة ATP5A | 1:500 |
| مضادة للبروشبلوت (nc82) | 1:20 |
| بروتين سلسلة مضادة للسيستين (ab49) | 1:50 |
| مكافحة الأقراص الكبيرة (4F3) | 1:200 |
| مكافحة hrp | 1:550 |
| مكافحة البوليبيكيتين (FK2) | 1:1000 |
| مكافحة الريبو (8D12) | 1:5 |
| الماعز المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية | 1:800 |
| فالويدين | 1:2000 |
| * تمييع في 5٪ NGS |
الجدول 2 - الأرباح الأجسام المضادة و المخففات. ويرد الموردون التجاريون للأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسات في قائمة المواد.
Discussion
الساق البالغة Drosophila هو نموذج مثالي لدراسة التنكس العصبي نظرا البساطة النسبية مع MNs تتميز بشكل جيد تعيينها من الأنساب neuroblast وأنماط التشجير النمطية. وقد استخدمت عدة تقارير سابقا MNs الساق لدراسة الأمراض العصبية21,22. استخدمت هذه الدراسات خطوط التعبير عن GFP جنبا إلى جنب مع تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية القابلة للقمع (MARCM) للصورة من خلال السفاح ووثقت سلسلة من التغييرات المورفولوجية. تصوير NMJs الكبار عن طريق الكيمياء المناعية مع كتل استئصال تمكن من مزيد من التوصيف مع القدرة على تتبع التغيرات الجزيئية المعقدة باستخدام صندوق أدوات من الأجسام المضادة المتاحة.
جزء الكيمياء المناعية من هذا البروتوكول هو معيار نسبيا ويمكن تنفيذها مستقلة عن النمط الجيني (انظر23 للحصول على وصف ممتاز لأساليب تلطيخ الأجسام المضادة العامة للاستخدام مع Drosophila). وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد معلمات مثل كثافة الفلورسينس، وطول فرع المحور، وأرقام وحجم بوتون باستخدام مجموعة متنوعة من وحدات الماكرو المتاحة ImageJ بمجرد التقاط الصور ونشر أساليب مفصلة للتحليل الكمي (على سبيل المثال، انظر 24،25،26). وبالتالي ، فإن تقنية التشريح هي الابتكار الرئيسي الموصوف هنا. قبل تشريح، يتم غمر الذباب في الكحول لتجريد الهيدروكربونات مقطعي. ويستخدم الإيثانول والميثانول عادة لهذا الغرض؛ ومع ذلك، استخدمنا الميثانول فقط. حاسمة لنجاح تشريح عدة عوامل: أولا، باستخدام ملقط المعدلة مع شطبة يسمح للاتصال سطحية جدا مع كتل. ثانيا، باستخدام مجهر تشريح قادر على التكبير الكلي 60-100x بحيث يكون سطح السفاح مرئيا بوضوح. بالنسبة للمجاهر ذات الحد الأقصى الأدنى من التكبير ، تتوفر أهداف 2x لمعظم العلامات التجارية الشائعة ويجب أن تكون كافية عند دمجها مع العدسات الموجودة. ثالثا، خطوة التثبيت الأولي يجعل الجلد هشة وأسهل لسحب بعيدا دون الإضرار العضلات تحت. الإفراط في التثبيت في هذه الخطوة يجعل الساق بأكملها قاسية جدا لتشريح فعال. لذلك، يجب أن يقتصر التثبيت الأولي إلى 30 دقيقة. فإن مثبت الفورمالديهايد لا تخترق ما يكفي لتقاطع الأنسجة الكامنة بشكل فعال خلال هذه الفترة القصيرة، وبالتالي خطوة التثبيت الثاني ضروري. قبل التثبيت الثاني ، يجب الاحتفاظ بالأنسجة على الجليد لمنع التدهور والتغيرات في مورفولوجيا. رابعا، وجدنا تشريح العينات في حين أن البرد مهم أيضا، من المرجح لأسباب مماثلة في أن الجلد هش ويمكن إزالة قطعة صغيرة بسهولة أكبر.
مع الممارسة، نجد ~ 50٪ من تشريح ستكون قابلة للاستخدام في أي ضرر الأنسجة ملحوظ. على الرغم من أن هذه النسبة المئوية قد تبدو منخفضة بالنسبة لبعض الأنسجة الأخرى ، فإن إجراء التشريح سريع ، ويمكن معالجة العديد من الساقين في 30-60 دقيقة. لذلك، حتى لو كانت معدلات النجاح منخفضة في البداية، فمن الممكن الحصول على عينات جيدة 4-5 لكل مجموعة تجريبية. ومع ذلك، قد يكون الحد من عدد الذباب المتاحة في أي وقت من الأوقات إذا كانت الأنماط الجينية و / أو العمر يؤدي إلى فتك كبير.
وهناك قيد آخر هو أننا لم نتمكن من تشريح مناطق أخرى من الساق خارج المنطقة القريبة من عظم الفخذ بسبب الحجم. وهكذا، يمكننا دراسة تحديد MN arbors innervating TILM موثوق بها، وأنه من الممكن تشريح لطيف فوق عضلة الاكتئاب الساق مع تغييرات صغيرة على الطريقة التي يتم توجيه الساق عند تشريح. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الوصول إلى مناطق أخرى من الساق أكثر صعوبة دون تعطيل العمارة المحورية أثناء التشريح.
هنا، نقدم طرق تشريح للكشف عن التغيرات في NMJ الكبار لMNs محددة الداخلية tilm باستخدام الكيمياء المناعية. الساق مفيدة كنظام بسيط، ت الداخلي من قبل ~ 50 MNs فقط وتحتوي على 14 العضلات مع التشريح وصفت جيدا. يمكن استخدام إعداد الساق تشريح عبر الأنماط الجينية ومجموعة من الأجسام المضادة متاحة لتصور NMJ دون الحاجة إلى بناء مخزونات معقدة جينيا من بنيات الجينات مراسل في خلفيات متحولة. وسيمكن هذا النهج من تحديد وصف أكثر تفصيلا للتغيرات في ال NMJ لأمراض MN وغيرها من الحالات المرتبطة بالعمر.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر إريك روبرتس على المشورة بشأن التصوير. ونود أيضا أن نشكر خدمات تكنولوجيا المعلومات في كلية رود آيلاند، ولا سيما مايكل كين وجيك دوغلاس على تصوير الفيديو. تم تطوير الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للdlg ومكافحة brp من قبل جامعة كاليفورنيا في بيركلي وجامعة فيرزبورغ، وتم الحصول عليها من بنك Hybridoma الدراسات التنموية، التي أنشأتها NICHD من المعاهد القومية للصحة والحفاظ عليها في جامعة أيوا، قسم البيولوجيا، مدينة أيوا، IA 52242، الولايات المتحدة الأمريكية. تم دعم البحث المبلغ عنه هنا بشكل كامل من قبل شبكة جائزة رود آيلاند للتنمية المؤسسية (IDeA) للتميز في البحوث الطبية الحيوية من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
