Summary
אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .
Abstract
Drosophila melanogaster מייצג מודל מתיחה גנטית לחקר מבנה עצבי ותפקוד, ושינויים הבאים במצבי המחלה. צומת נוירו-שרירי זחל מאופיין היטב משמש לעתים קרובות עבור מחקרים כאלה. עם זאת, התפתחות זחל מהירה ואחריה היסטוליזה שרירית ושיפוץ מערכת העצבים במהלך מטמורפוזה עושה מודל זה בעייתי לחקר שינויים ניווניים תלויי גיל איטיים כמו אלה המתרחשים בטרשת אמיוטרופית לרוחב. לחלופין, זבובים בוגרים חיים במשך 90 יום ואת הרגל הבוגרת ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים נוירון מוטורי במהלך תוחלת החיים למבוגרים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית vivo דרך הקיטור. כאן, אנו מתארים טכניקת ניתוח רגליים בשילוב עם אימונוציטוכימיה, המאפשרת לחקור שינויים מולקולריים בצומת הנוירו-שרירי של נוירונים מוטוריים מוטוריים של רגל בוגרת מזוהים. טכניקות אלה ניתן יחד עם מספר עצום של נוגדנים תיוג מבנים טרום ופוסט סינפטי. יחד נהלים אלה מאפשרים אפיון מלא יותר של שינויים תלויי גיל איטיים בזבובים בוגרים וניתן ליישם אותם על פני מודלים מרובים של מחלות נוירונים מוטוריים.
Introduction
מחלות נוירון מוטורי (MN) מקיפות קבוצה של תנאים הטרוגניים הכוללים ניוון מתקדם המוביל לבזבוז שרירים ושיתוק כמו פנוטיפ קליני ראשוני1. למרות נדיר עם שכיחות עולמית של 4.5 לכל 100,000, שכיחות זו צפויה לגדול עם אוכלוסייה מזדקנת2. טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא מחלת ה- MN הנפוצה ביותר (MND) והיא בדרך כלל קטלנית תוך זמן קצר מהאבחון ללא טיפולים קיימים לשינוי מחלות זמינים3. MNDs חולקים במשותף שלב פרזימפטומטי ממושך עם שינויים מוקדמים בסמן ביולוגי מולקולרי ושינויי הדמיה פונקציונליים שנראו בחולים4. פתולוגיה תאית פרזימפטומטית מוקדמת נצפתה גם במודלים של מחלות לא אנושיות5,6,7,8. המחקר של שינויים מוקדמים בצומת neuromuscular חשוב להבנת פתוגנזה מחלת MN ועשוי לסייע בפיתוח אבחון מוקדם וטיפולים פוטנציאליים.
שפע של כלים גנטיים ומולקולריים קיים Drosophila לנתח את המבנה והתפקוד של הצומת neuromuscular (NMJ, ראה9 לסקירה של NMJ זחל מאופיין היטב). כלים אלה בשילוב עם תוחלת חיים קצרה הופכים את Drosophila למודל מצוין לחקר שינויים ניווניות ב- NMJ. באופן ספציפי, MNs innervating שרירים למבוגרים נמצאים לאורך תוחלת החיים של ~ 90 יום למבוגרים והם כפופים לתהליכי הזדקנות נורמליים10,11,12,13. לכן, MNs הבוגרים מספקים הזדמנות לחקור שינויים ניווניים איטיים בניגוד ל- NMJs זחלים הקיימים רק פרק זמן קצר ~ 1 שבוע לפני מטמורפוזה14,15.
כאן, אנו מתארים הליך ניתוח המאפשר לנו לבצע ניתוח אימונוציטוכימי של MNs ברגל הבוגרת. כל רגל בוגרת היא innervated על ידי ~ 50 MNs, אשר לסנאפסה על שרירי הרגל הקשורים לנהוג בקטר. האנטומיה של הרגל, הפיזיולוגיה המכנית והנוירוביולוגיה תוארו היטב16,17,18. ארבורים אקסון של MNs רגל התאפיינו בעבר על ידי הדמיה באמצעות חתך באוכלוסיות תאים מלאות או מתויגות גנטית באמצעות מערכת Gal4 / UAS הדו-צדדית ושיטות הדמיה פורסמו בעבר19. שיטות הניתוח המוצגות כאן משמרות את המורפולוגיה המסתעפת של אקסון ומאפשרות לנו לנצל מגוון רחב של נוגדנים כדי לתייג רכיבים מולקולריים שונים של NMJ. עבודתנו הקודמת התמקדה בהקרנות של MN מוגדר ברגל המטה-מורקטית (השלישית), אשר ממקמת את שריר מנוף השוקה (tilm) ומציגה דפוסי ארבורציה עקביים ומספרי בוטון. בתחילה חקרנו שינויים תלויי גיל במוטנטים של Drosophila superoxide 1 (dsod1) ומצאנו שינויים העולים בקנה אחד עם פירוק NMJ20. שיטות ניתוח אלה מציעות את ההזדמנות לאפיין טוב יותר שינויים ניווניים איטיים ב- NMJ עבור מודלים אחרים של ALS, מחקרים בסיסיים של הזדקנות ומחלות אחרות הקשורות ל- MN.
איור 1. סיכום זרימת עבודה עבור כריתת רגליים. עיין בפרוטוקול לקבלת שלבים מפורטים. (א,ב) זבובים נבחרים ומונשמים. (ג) זבובים מועברים למתנול ונשטפים עם PBS. (D) הרגליים המטה-תותוריות מוסרות בבסיס הקוקסה תוך הדמיה עם מיקרוסקופ מנתח (~ הגדלה של פי 30); סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ה) הרגליים קבועות לאחר מכן בפתרון פורמלדהיד /PBS של 3.7% למשך 30 דקות בתוך בארות של צלחות של 24 בארות ולאחר מכן FA מוסר על ידי שטיפות עם PBS. (ו, ז, ה) הרגליים מועברות למגשי ניתוח אלסטומר סיליקון וחתיכת ציפורניים מוסרת מ עצם הירך הפרוקסימלית באמצעות מלקחיים משופעים תוך הדמיה תחת מיקרוסקופ ניתוח ב 80x; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (I) הרגליים הן לאחר הניתוח קבוע FA ונשטף PBS ולאחר מכן PBT (PBS + 0.1% פעילי שטח לא יוני). (J) הרגליים כפופות להכתמה חיסונית. (ק,ל) הרגליים מועברות למגלשת זכוכית, מנוקות במדיה הרכבה, ומכוסות בכיסוי המכיל מרווחי חרס; מוטות קנה מידה = 2 מ"מ ו 500 מיקרומטר. (M) הרגליים מדמות מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
ההליכים להכנת פתרונות עבודה המשמשים בשילוב עם פרוטוקול זה מתוארים בטבלה 1.
| מגיב | הכנה | אחסון | |||
| PBS | הפוך מלאי עובד של 1x PBS מפתרון 10x PBS מלאי על ידי דילול במים מזוקקים. ה-pH של מניית PBS העובדת צריך להיות 7.2- 7.4 | 4 °C למשך 1+ חודשים עד לזיהום חיידקי. | |||
| PBT | פתרון PBS 1x עם 0.1% פעילי שטח לא יוניים. | 4 °C למשך 1+ חודשים עד לזיהום חיידקי. | |||
| FA | 3.7% פתרון פורמלדהיד עשוי מניית פורמלדהיד 37% ודוולל ב- PBS 1x. | טמפרטורת החדר. הפוך טרי בכל יום של בית | |||
| זהירות: פורמלדהיד המסופק כפתרון מלאי של 37% הוא מסרטן פוטנציאלי ויש לדללו אותו במכסה אדים. | |||||
| 5% גז טבעי נוזלי | 5% סרום עזים רגיל מדולל PBT. הנסיוב המשמש צריך להתאים למין של הנוגדן המשני לשימוש. | 4 °C (75°F) למשך מספר שבועות עד לזיהום חיידקי | |||
טבלה 1. פתרונות לביצוע אימונוציטוכימיה של רגל הדרוסופילה הבוגרת .
1. קיבוע ראשוני של רקמות
- בחר כ-10 זבובים עבור כל גנוטיפ וגיל. יש להסתים על משטח זבובים תחת פחמן דו-חמצני (איור 1A, B).
הערה: התחל עם יותר זבובים מהנדרש כדי להבטיח גודל מדגם גדול מספיק לאחר הניתוח. - בעזרת מברשת צבע, מעבירים זבובים למתנול קר בבאר זכוכית או צלחת למשך כ-30 שניות עד דקה אחת (איור 1C). מתנול solubilizes פחמימנים cuticular וזבובים עכשיו יכול להיות שקוע ולא לצוף בפתרונות מימיים.
- עם מלקחיים, בזהירות להעביר זבובים PBS. יש לשטוף פי 3 ב-PBS קר כקרח כדי להסיר מתנול עודף ולשמור זבובים ב-PBS על קרח עד לניתוח לקיבעון. בשלב זה, לנתח זבובים ולתקן בתוך הזמן הקצר ביותר האפשרי (<30 דקות).
- כדי לבודד רגליים, העבירו זבובים לצלחת ניתוח אלסטומר מסיליקון מלאה ב-PBS קר, הסירו את הרגליים המטה-טקסיות בקוקסה באמצעות שני זוגות של מלקחיים מסוג דומונט מס' 5 או חתכו את הרגליים במספריים של ואנה (איור 1D). מעבירים את הרגליים לבאר בצלחת פלסטיק 24 ממולאת ב-1 מ"ל של PBS ושומרים את הצלחת על הקרח עד שכל הרגליים מוסרות ומועברות לבארות.
הערה: כל באר יכולה להכיל לפחות 20 רגליים. - החלף את פתרון PBS בפתרון FA של מ"ל אחד וסובב על מקטור למשך 30 דקות (איור 1E). יש להגדיר את הגדרת nutator במהירות בינונית (17 סל"ד). ודא שהרגליים שקועות לחלוטין בתמיסת FA בתקופה זו עבור קיבעון הולם.
- כדי להסיר פתרון FA, לשטוף ב 1 מ"ל של PBS 3x במהירות ואחריו 3 שטיפות נוספות במשך 5 דקות כל אחד ב 1 מ"ל של PBS. החזק רקמות ב 1 מ"ל של PBS על קרח לפני, ובמהלך שלבי הניתוח המתוארים להלן.
2. הסרת חתך הרגל והכתמת הנוגדנים
- הסרת חתך הרגל
- המלקחיים הניתוחים הם קריטיים להצלחה. הציגו כיפופים מקבילים קלים בשני הקצוות בסוף המלקחיים הסופר-עדינים מס' 5 כדי לספק שיפוע המאפשר לתפוס את הקיטור באופן שטחי במקום להידחף, מה שעלול להרוס את הרקמה (איור 1F, G).
הערה: ניחנים כפופים במקביל עדיין צריכים ליצור קשר זה עם זה לאורך אורך הניף כשהם סגורים (איור 2). - מעבירים את הרגליים לצלחת אלסטומר סיליקון ב-PBS לצורך ניתוח. כוון רגל כך שהצד הקדמי פונה כלפי מעלה (ראו איור 3 למידע על אנטומיה של הרגליים והתמצאות). בעזרת זוג מלקחיים אחד, יש להחזיק את מקטע השוקה כנגד צלחת אלסטומר הסיליקון. באמצעות המלקחיים האחרים החזיק צד משופע כלפי מטה, לתפוס חתיכת חתך בקצה הדיסטלי של עצם הירך ולמשוך בכיוון הפרוקסימלי לכיוון trochanter.
- יש להסיר באופן שיטתי את הקיסם עד שהשריר העירום נראה לאורך הקצה הפרוקסימלי של עצם הירך (איור 1F, G, H).
הערה: רק ליצור קשר שטחי עם הרגליים באמצעות הצד המשופע של המלקחיים כדי למנוע משיכת שרירים. - לאחר שכל הרגליים נותחו, החליפו את PBS ב-FA כדי לתקן רגליים למשך 30 דקות עם רעד על מטור במהירות בינונית (איור 1I). יש לשטוף דגימות ב-1 מ"ל של PBS במהירות של פי 3 ולאחר מכן 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת ב-PBT (איור 1J).
הערה: אם מכתים בנוגדן חד שבטי NC82 (אנטי-bruchpilot) כדי לסמן אזורים פעילים, לאחר תיקון במשך 20 דקות כמו אנטיגן זה רגיש קיבעונות ארוכים יותר.
- המלקחיים הניתוחים הם קריטיים להצלחה. הציגו כיפופים מקבילים קלים בשני הקצוות בסוף המלקחיים הסופר-עדינים מס' 5 כדי לספק שיפוע המאפשר לתפוס את הקיטור באופן שטחי במקום להידחף, מה שעלול להרוס את הרקמה (איור 1F, G).
איור 2. מלקחיים מותאמים המשמשים לכריתת רגליים בוגרות. (א) קצות המלקחיים כפופים ולאחר מכן שטוחים בתחתית (חץ) ויוצרים שיפוע על ידי תיוק על אבן מחדדת. (ב) לעומת זאת, נטיפים של מלקחיים שלא שופצו אינם כפופים. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- כתמי נוגדנים
- כדי לחסום רקמות להכתמת נוגדנים, החלף 1 מ"ל של PBT עם פתרון חסימה המורכב מ-1 מ"ל של 5% NGS מדולל ב-PBT. דגירה רגליים ניתחו במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (7 °F) תוך נדנדה על nutator במהירות בינונית (17 סל"ד). במהלך כל הדגירות, יש לכסות בארות בנייר איטום בנוסף לכיסוי הפלסטיק (איור 1J).
הערה: 24 לוחות היטב משמשים אימונוציטוכימיה ולא 1.5 מ"ל או 2 מ"ל מיקרוצנטריפוגה כי ניסיונות קודמים להשתמש צינורות microcentrifuge הביא רגליים שבורות ורקמות פגומות. - הסר פתרון חסימה ולהוסיף 300 מ"ל של נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה טרייה. הנפח הקטן של נוגדן בשימוש צריך להיות מספיק כדי לכסות את הרקמות. אטמו מחדש בארות עם סרט איטום מעבדה ומכסה פלסטיק ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם רעד על מטור במהירות בינונית (איור 1J). מידע ריאגנט נוגדנים עובד וריכוזים המשמשים למחקרים אלה מתוארים בטבלה 2.
- יש לשטוף נוגדנים ראשוניים ב-1 מ"ל של PBT למשך 3 פעמים לזמן קצר ולאחר מכן 3 פעמים למשך 15 דקות כל אחד (איור 1J).
הערה: נוגדנים ראשוניים מדוללים ניתן לשמור וייעשה שימוש חוזר אם מאוחסנים ב 4 °C (70 °F) עד שבועיים. - חסום רקמות שוב ב-1 מ"ל של 5% NGS למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר או בלילה ב-4 מעלות צלזיוס (איור 1J).
- הסר את פתרון חסימת NGS 5% והוסף 300 μL של הנוגדנים המשניים המוצללים המתאימים. בנוסף, הוסיפו 1:2000 דילול של פאלואידין מצומד פלואורסצנטית כדי לסמן שרירים (איור 1J).
- לדגרות נוגדנים משניות, אטמו בארות עם סרט איטום מעבדה ומכסה. כמו כן, לעטוף צלחות בנייר אלומיניום כדי להגן על פלואורופורים מפני אור. דגירה במשך 6-8 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (5 °F).
- לשטוף נוגדנים משניים ו פאלואידין כמתואר בשלב 2.2.3 לעיל. לכסות לוחות עם רדיד אלומיניום בין שטיפות כדי להגן על פלואורופורים מפני אור.
- כדי לחסום רקמות להכתמת נוגדנים, החלף 1 מ"ל של PBT עם פתרון חסימה המורכב מ-1 מ"ל של 5% NGS מדולל ב-PBT. דגירה רגליים ניתחו במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (7 °F) תוך נדנדה על nutator במהירות בינונית (17 סל"ד). במהלך כל הדגירות, יש לכסות בארות בנייר איטום בנוסף לכיסוי הפלסטיק (איור 1J).
3. רגליים הרכבה
- מעבירים רגליים למגלשה באמצעות מלקחיים ומכוונות את הצד הצידה הצידה למעלה. כסו את הרגליים במדיה הרכבה (איור 1K, L).
הערה: הרגליים הניתחו יכולות להיות שאפתן עם קצה פיפטה P1000 אם השעמום התחתון מתרחב על ידי חיתוך עם סכין גילוח. - הוסף מרווחי חימר לכיסוי 22x22 mm2 (עובי מס '1.5) על ידי גירוד פינות כיסוי על פני כדור קטן של חימר דוגמנות. לכל פינה צריכה להיות כמות קטנה של חימר בעובי 1-2 מ"מ (איור 1K).
- כדי לכסות את השקופית, מוסיפים את כיסוי עם מרווחי החימר הפונים לכיוון המגלשה ודוחפים בזהירות בפינות עד שהכיסוי נוגע רק בפני השטח של עצם הירך.
- כדי למנוע אידוי, לאטום את הקצוות של כיסוי עם לק ולתת יבש במקום חשוך (כ 10 דקות) לפני אחסון ב 4 °C (50 °F) עד הדמיה.
4. הדמיה
- תמונה לפי מיקרוסקופ קונפוקל (איור 1M). כלול ערוץ אור משודר כדי להעריך טוב יותר את איכות הניתוח ודגימות עם סיבי שריר משובשים בעליל בתחום העניין צריך להיות מושלך.
- התחל הדמיית z-ערימות עם הגדלה 20x עם זום 2x ועומק תמונה כולל של ~ 40 מ"מ המתאים לעובי עצם הירך. לזיהוי אותות פלואורסצנטיים, צלם תמונות ברזולוציות התואמות לדגימה של Nyquist (אנו משתמשים בפיקסלים בגודל 1024 x 1024 עם הגדרת השתהות של 8-10 מיקרו-פיקסל/פיקסל). עוצמת האות צריכה להיות בטווח הליניארי אשר מושגת על ידי התאמת הגדרות רווח מתח גבוה. לאחר הגדרות הרווח מוגדרות עבור סדרה של דגימות בתוך ניסוי, הם לא צריכים להיות משתנים כך עוצמות האות ניתן להשוות בין דגימות.
- עבור זרי פרחים סינפטיים הדמיה ומבנה תת-תאי אחר, לכוד תמונות קונפוקליות בהגדלה של פי 60 ≥. הגדרות הגלאי צריכות להיות בטווח הליניארי, בעוד שצפיפות הפיקסלים, הגדרות ההשתהות ועומק z צריכים להיות דומים עבור תמונות שנלכדו בהגדלה נמוכה יותר (שלב 4.1).
Representative Results
איור 4 מציג דוגמה מייצגת לרגל מטאורקטית מוכתמת באנטי-hrp, אנטי-dlg ו-phalloidin. עבור ניתוחים המסירים חתך מהחלק הפרוקסימלי של עצם הירך, arbors סטריאוטיפי יהיה גלוי ליד הגיד אשר מזוהה בקלות על ידי autofluorescence. שימו לב שחדירת נוגדנים לרגל מתרחשת למרחק קצר מעבר לאזור שבו הוסר החתך (איור 4A). אזורים אלה יכולים להיות בתמונה ביעילות כאשר אות פלואורסצנטי חזק קיים. הדמיה בהגדלה נמוכה (20x עם זום 2x) מאפשרת קביעה קלה של 1) כמה חותך מוסר, ו -2) אם נגרם נזק במהלך הניתוח. הגדלה מוגברת (פי 60) מציגה תחזיות סטריאוטיפיות על הטילם (איור 4B). העבודה שלנו התמקדה ב-MN אחד, שכנראה נגזר משושלת ה-I-MN שממקמת את הטילם בעצם הירך הפרוקסימלית (תיבה, איור 4B ואיור 4C). הגדלת ההגדלה נוספת (פי 100 עם זום כפול) מאפשרת הדמיה יעילה של זרי פרחים סינפטיים (איור 4D).
כדי לחקור שינויים מורפולוגיים ב- NMJ הבוגר לאורך זמן, השתמשנו בעבר במוטנטים dsod1 כמודל של ALS. נפיחות בוטון מתרחשת במוטנטים מיושנים של dsod1H71Y ביחס ל-dsod1nulland dsod1+ (איור 5A, B). ב-larval NMJ, נוגדן חד שבטי NC82 משמש לעתים קרובות לתיוג אזורים פעילים, וניתן לדמיין את המבנים האלה בקלות ב-NMJ הבוגר (איור 5C). ענפי אקסון HRP חיוביים חלשים מצויים בשפע במוטנטים dsod1H71Y וענפים אלה מראים לעתים קרובות לוקליזציה חלשה ומפוזר BRP (חצים).
נוגדנים זמינים מסחרית, החשובים לנוירדגנרציה, יכולים לזהות חלבונים הנמצאים בכל מקום שנמצאים לעתים קרובות במצטברים, וזיהינו אגרגטים בכל מקום בתוך אקסונים סופניים של MNs בזבובי dsod1 מוטנטיים מיושנים , כמו גם בתוך השריר (איור 6A). כמו כן, נוגדנים המסמן מיטוכונדריה יכולים גם לזהות שינויים מורפולוגיים עם הגיל (איור 6B).
עבור כמה הכנות, נזק לשרירים במהלך הניתוח עושה את המדגם שמיש. בתחילה, נזק כזה יכול להיות תופעה שכיחה, אבל שיפור מתרחשת עם תרגול. דוגמאות לדיסקציה טובה מוצגות איור 7A, C , בעוד ניתוחים גרועים מוצגים באיור 7B, D. ניתוחים לקויים גורמים לאי-ארגון של סיבי שריר כפי שזוהו על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה (איור 7B) או סיבי שריר חסרים שדמיינו על ידי פאלואידין מצומד פלואורסצנטי (איור 7D, חץ). השילוב של שימוש פאלואידין כדי לתייג שריר, ותמונות אור מועברות יכול לעזור לזהות נזק שרירים כזה אשר לא יכול להיות גלוי בעת צפייה תחת מיקרוסקופ לנתח.
איור 3. אנטומיה של רגל הדרוסופילים . (א) תרשים של הצד הקדמי של רגל מטאורקטית, המאופיינת בנוכחות זיפים בניגוד לצלע העירומה הבולטת הקיימת בצד האחורי. הרגל המפולחת מורכבת מהקוקסה (Cx), הטרוצנטר (Tr), עצם הירך (Fe), השוקה (Ti), 5 מקטעי טרסל (Ta1-5) וטפר (Cl) על מנת מהפרוקסם (Pr) לדיסטל (Di). צדדים גחון (D) וגחון (V) של עצם הירך מסומנים גם. סרגל קנה מידה =100 מיקרומטר. (B) תרשים של עצם הירך המכילה את מנוף השוקה (השוקה), דפרסור השוקה (tidm), שריר גיד ארוך 2 (ltm2) והפחתת השוקה (tirm) תחזיות אקסון בעצם הירך הפרוקסימלית innerving את השוק. תחזיות אקסוניות סטריאוטיפיות אלה נחשבות נגזרות נוירובלסטים I-שושלת16, ואת arborization השני הוא הקל ביותר לגשת על ידי ניתוח (boxed). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. עצם הירך המטה-מורקטית נותח חשף ארכיטקטורת MN סטריאוטיפית הממקמת את הטילם. אימונוציטוכימיה שימשה לסימון נוירונים (HRP), דיסקים גדולים (DLG) ושרירים (פאלואידין). ערימות Z נלכדו על ידי הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית דרך עצם הירך כולה והוצגו כהקרנה מסדרה מקסימלית. (א) ערוץ אור משודר נכלל גם כדי להמחיש שלא נגרם נזק לשרירים שניתן לזהות במהלך הניתוח. התמונה צולמה בהגדלה של פי 20, סרגל קנה מידה =50 מיקרומטר. (B) ארבורים מזוהים המשויכים לטילם (אזור בקופסה, מרכז), סרגל קנה מידה =20 מיקרומטר; ותעוד (C) בהגדלה של פי 60, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (D) DLG סביב boutons היה ניכר בבעלי חיים סוג בר כאשר בתמונה בהגדלה 100x עם זום 2x; סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. דוגמה לשינויים תלויי גיל במורפולוגיה של בוטון שניתן לזהות באמצעות טכניקת ניתוח הרגל. נפיחות בוטון נראית במוטנטים מיושנים של DSod1H71Y. (A) תמונות מייצגות של זרי פרחים מוכתמים HRP מצעירים (eclosed לאחרונה, יום 0 מבוגרים) ומבוגרים (יום 10) זבובים, סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. (B) גדלי בוטון היו מכומתים מגנוטיפים בהתאמה באמצעות פונקציית המידה בתוך ImageJ. p<0.0001 (ANOVA דו כיווני עם מבחן טוקי פוסט הוק). (C) אזורים פעילים בתוך זרי פרחים סינפטיים המסומנים בנוגדן חד שבטי NC82 (אנטי-ברופילוט); סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. איור שונה מ- 20Please לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. סמנים נפוצים הקשורים למחלה נוירודגנרטיבית המשמשת תכשירי רגל Drosophila. (A) אגרגטים פוליוביקוויטינציה תת-תאית מזוהים באקסונים סופניים ושרירים של זבובי dsod1H71Y מיושנים. אימונוציטוכימיה באמצעות אנטי פוליוביקוויטין (FK2) מזהה puncta (חצים) ב dsod1H71Y/H71Y מיושן, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (משמאל) ו 5 מיקרומטר (מימין). (B) מיטוכונדריה נפוחה ניתן לזהות באמצעות אנטי ATP5A, סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. איור שונה מ- 20Please לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. דוגמאות של ניתוחים טובים ועניים. (א) ניתוח שלא שיבש את ארכיטקטורת השרירים הבסיסית. (ב) דוגמה לניתוח לקוי שהראה סיבי שריר פרומים (חץ) ולא ניתן היה להשתמש בו לניתוח. שתי הדגימות צולמו על ידי מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) דוגמה של ניתוח טוב בתמונה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית עם HRP (ירוק) ו פאלואידין (כחול). (D) ניתוח לקוי חסר סיבי שריר שרירי געש של TILM חסר (חץ). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| נוגדן/כתם | דילול* |
| אנטי-ATP5A | 1:500 |
| אנטי-ברוצ'פילוט (nc82) | 1:20 |
| חלבון מחרוזת אנטי ציסטאין (ab49) | 1:50 |
| אנטי-דיסקים גדולים (4F3) | 1:200 |
| אנטי-hrp | 1:550 |
| אנטי פוליוביקוויטין (FK2) | 1:1000 |
| אנטי-ריפו (8D12) | 1:5 |
| נוגדן משני נגד עכבר עזים | 1:800 |
| פאלואידין | 1:2000 |
| *לדלל ב-5% גז טבעי נוזלי |
טבלה 2. נוגדנים ודילולים. הספקים המסחריים של הנוגדנים המשמשים במחקרים אלה מפורטים ברשימת החומרים.
Discussion
הרגל הבוגרת Drosophila היא מודל אידיאלי לחקר ניוון עצבי בהתחשב בפשטות יחסית עם MNs מאופיין היטב ממופה שושלות neuroblast ודפוסי arborization סטריאוטיפי. מספר דיווחים השתמשו בעבר MNs רגל לחקר של מחלה ניווניות21,22. מחקרים אלה השתמשו בקווים המבטאים GFP בשילוב עם ניתוח פסיפס עם סמן תא דכאני (MARCM) כדי לדמות דרך החתך ותיעדו סדרה של שינויים מורפולוגיים. הדמיית NMJs למבוגרים על ידי אימונוציטוכימיה עם חותך חתך מאפשר אפיון נוסף עם היכולת לעקוב אחר שינויים מולקולריים מורכבים באמצעות ארגז כלים של נוגדנים זמינים.
החלק החיסוני של פרוטוקול זה הוא סטנדרטי יחסית והוא יכול להיות מיושם ללא תלות genotype (ראה23 לתיאור מצוין של שיטות מכתים נוגדנים כלליות לשימוש עם Drosophila). יתר על כן, ניתן לקבוע פרמטרים כגון עוצמת פלואורסצנטיות, אורך ענף אקסון ומספרי בוטון וגודל באמצעות מגוון פקודות מאקרו זמינות של ImageJ לאחר לכידה של תמונות ושיטות מפורטות לניתוח כמותי (לדוגמה, ראה24,25,26). לפיכך, טכניקת הניתוח היא החידוש העיקרי המתואר כאן. לפני הניתוח, זבובים שקועים באלכוהול כדי להפשיט פחמימנים. אתנול ומתנול משמשים בדרך כלל למטרה זו; עם זאת, השתמשנו רק במתנול. קריטי להצלחה לנתח הם מספר גורמים: ראשית, באמצעות מלקחיים מותאמים עם שיפוע מאפשר מגע שטחי מאוד עם הקיטור. שנית, באמצעות מיקרוסקופ ניתוח המסוגל להגדיל את ההגדלה הכוללת של 60-100x כך שפני השטח של החתך נראים בבירור. עבור מיקרוסקופים עם הגדלה מקסימלית נמוכה יותר, יעדי 2x זמינים עבור רוב המותגים הנפוצים וצריכים להספיק בשילוב עם עדשות קיימות. שלישית, שלב הקיבעון הראשוני הופך את הקיטור לשברירי וקל יותר להתרחק מבלי לפגוע בשריר שמתחתיו. קיבוע יתר בשלב זה הופך את הרגל כולה נוקשה מדי עבור ניתוח יעיל. לכן, הקיבעון הראשוני צריך להיות מוגבל ל 30 דקות. הקיבעון פורמלדהיד לא יחדור מספיק כדי לחצות ביעילות את הרקמה הבסיסית בתקופה קצרה זו ולכן יש צורך בשלב קיבעון שני. לפני הקיבעון השני, יש לשמור רקמות על קרח כדי למנוע השפלה ושינויים במורפולוגיה. רביעית, מצאנו לנתח דגימות בעוד הקור הוא גם חשוב, סביר מסיבות דומות כי חותך הוא שביר חתיכה קטנה ניתן להסיר בקלות רבה יותר.
עם תרגול, אנו מוצאים ~ 50% של ניתוחים יהיה שמיש בתוך ללא נזק לרקמות ניכר. למרות אחוז זה עשוי להיראות נמוך יחסית כמה רקמות אחרות, הליך הניתוח הוא מהיר, ורגליים רבות ניתן לעבד בתוך 30- 60 דקות. לכן, גם אם שיעורי ההצלחה נמוכים בתחילה, זה אפשרי להשיג 4-5 דגימות טובות עבור כל קבוצת ניסוי. עם זאת, מגבלה עשויה להיות מספר הזבובים הזמינים בכל זמן נתון אם גנוטיפים ו/או גיל גורמים לקטלניות משמעותית.
מגבלה נוספת היא שלא הצלחנו לנתח אזורים אחרים ברגל מעבר לאזור הפרוקסימלי של עצם הירך בשל גודל. לכן, אנו יכולים ללמוד ארבורים MN מזוהים innervating TILM אמין וניתן לנתח חתך מעל שריר דיכאון השוקה עם שינויים קטנים לאופן שבו הרגל מכוונת בעת ניתוח. עם זאת, גישה לאזורים אחרים של הרגל הוכיחה קשה יותר מבלי לשבש את הארכיטקטורה האקסונית במהלך הניתוח.
כאן, אנו מציגים שיטות ניתוח כדי לזהות שינויים ב- NMJ הבוגר עבור MNs מוגדרים innervating tilm באמצעות אימונוציטוכימיה. הרגל שימושית כמערכת פשוטה, פנימי על ידי רק ~ 50 MNs ומכיל 14 שרירים עם אנטומיה מתוארת היטב. ניתן להשתמש בהכנת הרגל המנותח על פני גנוטיפים וחבילת נוגדנים זמינה להדמיה של NMJ ללא צורך בבניית מלאי מורכב גנוטיפי של מבנים גנטיים עיתונאיים ברקע מוטנטי. גישה זו תאפשר אפיון מפורט יותר של שינויים ב- NMJ למחלות MN ותנאים אחרים הקשורים לגיל.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לאריק רוברטס על עצת ההדמיה. אנו גם רוצים להודות לשירותי טכנולוגיית המידע במכללת רוד איילנד ובמיוחד למייקל קיין וג'ייק דאגלס על צילום וידאו. נוגדנים חד שבטיים נגד dlg ואנטי-brp פותחו על ידי UC-Berkeley ואוניברסיטת וירזבורג בהתאמה, והושגו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים, שנוצר על ידי NICHD של NIH ומתוחזק באוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242, ארה"ב. המחקר שדווח כאן נתמך באופן מלא על ידי רשת המצוינות במחקר ביו-רפואי של רוד איילנד (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר המענק [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
