Summary
多重免疫体化学とマルチスペクトルイメージングの進歩にもかかわらず、子宮内膜における主要な免疫細胞の密度とクラスタリングを同時に特徴付けるのは依然として課題です。本論文では、子宮内膜における4種類の免疫細胞の同時局在化のための詳細な多重染色プロトコルとイメージングについて述べている。
Abstract
免疫組織化学は、生体研究や臨床診断における組織抗原の同定と可視化に最も一般的に使用される方法です。創傷治癒、免疫応答、組織拒絶反応、組織生体物質相互作用など、様々な生物学的プロセスや病理を特徴付けるために使用できます。しかし、従来の免疫組織化学(IHC)染色を用いた単一の組織セクションにおける複数の抗原(特に免疫細胞)の可視化および定量は不十分なままである。したがって、多重化された技術は、単一の組織サンプルまたは異なる組織サンプルのアンサンブル内の複数の生物学的マーカーを同定するために、近年導入されました。
これらの技術は、移植中に再発流産した肥沃な女性と女性の子宮内の免疫細胞間相互作用の変化を区別するのに特に有用であり得る。この論文では、多重蛍光IHC染色の詳細なプロトコルを用いて、胚移植中の正確なタイミングの子宮内膜標本における4つの主要な免疫細胞タイプの密度とクラスタリングを同時に調査する。この方法は、サンプル調製、免疫細胞サブタイプのマーカーによる多重最適化、およびスライドのスキャン、続いてデータ分析、子宮内膜免疫細胞の検出に関する具体的な参照を含む。
この方法を用いて、子宮内膜における4つの主要な免疫細胞タイプの密度およびクラスタリングを、単一の組織セクションで同時に解析することができる。さらに、適用される蛍光プローブ間の蛍光性干渉の可能性を克服するための重要な要因とトラブルシューティングについて説明します。重要なことに、この多重染色技術の結果は、胚移植中の免疫学的相互作用および調節の詳細な理解を提供するのに役立つ。
Introduction
再発流産(RM)は、妊娠24週前の24週前の2回以上の妊娠の喪失と定義することができる。この頻繁な生殖状態は、世界中のカップルの最大1%に影響を及ぼします2,3.病態生理は多因子的であり、子宮内膜および/または胎盤の発達に影響を与える母体駆動の原因(主に異常な胚核型による)および母体駆動の原因に分けることができる。この症状は、親の遺伝的異常、子宮異常、プロトロンボティック状態、内分泌因子、および免疫障害4に起因する可能性がある。
近年、免疫エフェクター細胞機能障害は妊娠初期の病因に関与している5.これは、月経周期、移植、妊娠初期の子宮内膜中の免疫細胞の特定の集団を、妊娠初期の特定の役割を持つ特定の集団を解明する多くの調査に影響を与えました。これらの免疫細胞の中でも、子宮ナチュラルキラー(uNK)細胞は、特に栄養芽球浸潤と血管新生6の過程において、胚移植および妊娠時に重要な役割を果たす。研究は、RM7,8を有する女性の子宮内膜におけるuNK細胞密度の増加を示しているが、この知見は流産のリスクの増加と関連していなかった9。しかし、この刺激研究は、RM10,11を有する女性の子宮内膜における他の免疫細胞型(マクロファージ、子宮樹状細胞など)の密度を評価する研究を刺激した。それにもかかわらず、RMを有する女性の包床注入子宮内膜における免疫細胞密度に有意な変化があるかどうかは不明である。
不確実性の1つの考えられる説明は、子宮内膜免疫細胞密度の評価が、移植の窓の間に子宮内膜の急激な変化のために困難である可能性があることである。24時間の時間枠の間に、子宮内膜の有意な変化は免疫細胞密度およびサイトカイン分泌を変化させ、これらの結果12に変動の源を導入する。さらに、ほとんどの報告は、主に同じ組織セクション上の複数のマーカーを調べることができなかった単細胞染色(例えば、従来のIHC法)の使用に依存している。フローサイトメトリーは、1つのサンプルで複数の細胞集団を検出するために使用できますが、大量の細胞が必要で、時間のかかる最適化により、この方法の人気と効率が妨げられています。したがって、近年の多重IHC染色の進歩は、同じスライド上で複数のマーカーを免疫染色して、細胞系統や個々の免疫亜集団の組織学的局在化を含む複数のパラメータを評価することによって、この問題を解決できる。さらに、この技術は、組織の入手可能性が限られている場合に得られる情報を最大限に活用することができる。最終的には、この技術は、RMを有する肥沃な女性と女性の間の子宮内膜における免疫細胞相互作用の違いを解明するのに役立つ。
女性の2つのグループは、肥沃な制御女性(FC)と原因不明の再発流産(RM)を持つ女性を含むプリンス・オブ・ウェールズ病院から募集されました。肥沃なコントロールは、自発的流産の既往歴のない少なくとも1人の出生を持つ女性と定義され、RM女性は妊娠20週前に≥2回連続流産の既往歴を持つ女性と定義された。2つのグループの被験者は、(a)20歳から42歳までの年齢、(b)非喫煙者、(c)定期的な月経周期(25〜35日)および正常子宮構造、(d)子宮内膜生検の前に少なくとも3ヶ月間ホルモン療法を使用しない、(e)ヒステラによるヒドロサルピンスの使用なし。さらに、募集されたすべての被験者は、正常な核作法、正常な3次元超音波超音波ヒステロスピンゴグラム、10 IU/L<2日目の卵胞刺激ホルモン、30nmol/L>中黄体プロゲステロン、正常甲状腺機能、およびα性抗凝固剤および抗心リジンIgGおよびIgM抗体に対して陰性を試験した。
RMの免疫学的基礎をよりよく理解するためには、移植時に子宮内膜に存在する主要な免疫細胞タイプを同時に定量化し、局在させることが最も望ましいであろう。本論文では、サンプル調製のプロトコル全体、免疫細胞サブタイプのマーカーによる多重最適化、スライドのスキャン、子宮内膜免疫細胞の検出に関する具体的なデータ分析について説明する。さらに、この論文では、子宮内膜における免疫細胞タイプの密度とクラスタリングを同時に決定する方法について述べる。
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Protocol
この研究は、香港新準地域東方位クラスター臨床研究倫理委員会の中国合同大学によって承認されました。インフォームドコンセントは、子宮内膜生検を収集する前に参加者から得られました。制御グループおよびRMグループの包含基準については、「概要」セクションを参照してください。
1. サンプル準備
- この研究のすべての女性が排卵を検出するために黄体形成ホルモン(LH)サージを同定するために月経周期の9日目以降に毎日尿ディップスティック検査を受けることを確認し、LHサージ(LH+7)の7日目 に子宮内膜生検を正確に行う。
- 原因不明のRMを有する肥沃な女性および女性からピペルサンプラーまたはピペットキュレットを使用して子宮内膜生検の0.5cm2 断片を得る。
注: 固定剤の体積は、組織の5〜10倍にする必要があります。 - 組織処理機の脱水用カートリッジに組織を入れ、溶融パラフィンワックスに埋め込みます。58-60°Cでパラフィンに組織を埋め込む。
- パラフィンブロックを室温で一晩冷却します。ミクロトームを使用して、パラフィンブロックを厚さ3μmにトリミングします。
注:蒸留水の使用は、多重染色全体にわたって適切な組織の取り付けと付着に役立ちます。 - パラフィンリボンを水浴に40~45°Cで30s入れます。
- ポリL-リジン(0.1%w/v)コーティングされた顕微鏡ガラススライドにセクションを取り付けます。組織を上向きにしてスライドを置き、一晩で37°Cで乾燥させます。さらに使用するまで極端な温度から離れたスライドボックスにスライドを保管してください。
2. 従来のIHCを用いて多重IHCの抗体の理想的な濃度を決定する。
注:これは、子宮内膜サンプル内の各免疫マーカーの発現レベルとパターンを特定し、各マーカーの染色配列と関連するチラミドシグナル増幅(TSA)フルオロフォアの組み合わせを決定するために重要です。
- 手動の従来のIHC13を使用して、多重IHCに対する抗体の適合性をテストします。
- 単一抗体検査には子宮内膜組織を使用します。
- 各抗体の染色条件を最適化するための陽性対照(例えば、脾臓)および陰性対照(アイソタイプ制御)を含む。
- 抗体のデータシートで推奨される希釈液を使用して染色を行います。
- ステップ2.3で使用される推奨希釈液の上下の濃度を使用して追加の染色を行います。
注:臨床病理学者は、抗体プローブと細胞の完全性の局在を確認するために、染色されたスライドを盲目的に評価する必要があります。
3. 多重染色法
- スライドの準備と固定
- スライドを平らにして(ステップ1.6から)平らにし、組織をオーブンで上向きにし、60°Cで少なくとも1時間焼きます。
- スライドをオーブンから取り出し、室温で少なくとも20分間冷却してから、垂直スライドラックに入れます。
- デワックスおよび水分補給 10 分を使用して、ホルマリン固定、パラフィン埋め込みスライドを次の手順のそれぞれに割り当てる: キシレン (2x), 100% エタノール (2x), 95% エタノール (1x), 70% エタノール (2x), 蒸留水 (2x).
- スライドのラックをプラスチック製のスライドボックスに入れ、トリスバッファ状の生理液(TBS、pH 7.6)に浸します。
注: スライドは、この再水和ステップから最後のステップで取り付けるまで、湿った状態を保つ必要があります。 - メタノール(1:9)で希釈したホルムアルデヒドを混ぜたプラスチック製のスライドボックスに、暗闇の中で30分間、スライドを沈めてサンプルを固定します。
- 2分間、脱イオン水でスライドを2回洗浄し、抗原の取り出しに進みます。
- エピトープ検索
- スライドのラックを耐熱ボックスに入れ、クエン酸バッファー(pH 6.0)で充填してスライドを覆います。
- 電子レンジに箱を入れ、50 sのスライドを100%の電力で加熱し、20%の電力で20分加熱して同じ温度を維持します。
- スライドを室温で約15分間冷却します。
- スライドを水で2分間リンスし、その後TBS-トゥイーン20(TBST)を2分間リンスします。
注: TBST は 25 mM トリス-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、および 0.05% トゥイーン 20 (v/v) で構成されています。
- ブロッキング
- ペルオキシダーゼ遮断溶液を含む瓶にスライドを浸漬することにより、組織中の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロック( 材料表参照)10分間。
- スライドをTBSTで5分間洗います。
- 疎水性バリアペンを使用して、スライド上の組織セクションの周囲の境界をマークします。
- 組織切片をブロッキングバッファー( 材料表参照)またはウシ血清アルブミン(5%、w/v)で覆い、加湿チャンバーでスライドを15分間インキュベートします。
- 抗体およびシグナル応用
- ブロッキング試薬を取り除く。
- 目的の一次抗体(例えば、CD3、抗体希釈液中の1:100希釈)を用いてインキュベートし、室温で30分間加湿したチャンバー内で 表1を参照)。
- 一次抗体を除去します。TBSTで3倍の洗浄を毎回5分間洗います。
- ポリマー西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(表1)を室温で加湿したチャンバーに15分間インキュベートする。TBSTで3倍の洗浄を毎回5分間洗います。
- オパールフルオロフォア TSA 作業溶液 (1:100 増幅希釈液) を適用し、10 分間室温でインキュベートして、一次抗体結合部位の組織サンプルにフルオロフォアを結合させます。TBSTで3回洗うたびに5分間洗います。
- マイクロ波ベースストリッピング
- 抗原の検索バッファー (クエン酸緩衝液, pH 6.0) でリンスします。
- マイクロ波ベースのストリッピングを行い、次の一次抗体(例えば、CD20)を導入するために一次-二次HRP複合体を除去する。
- スライドを抗原検索バッファーに入れ、50 s の場合は 100% の電力でマイクロ波にし、マイクロ波安全容器で 20 分間 20% の電力を 20% にし、室温で 15 分間冷却します。
- 組織サンプルがすべての一次抗体でプローブされるまで、ステップ3.2.4~3.5.2を繰り返します。
- カウンターステインおよび取り付け
- マイクロ波ベースの抗原検索バッファーの剥離および冷却後、蒸留水およびTBSTでスライドをすすいでください。
- 4'、6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)溶液(1.0 μg/mL)を室温で加湿したチャンバーに5分間インキュベート。
- TBSTで3倍の洗浄を毎回5分間洗います。水で5分間洗います。
- スライドをエアドライし、適切な取り付け媒体で取り付けます( 材料表を参照)。
注: スペクトルライブラリの開発にモノプレックススライドを使用する場合、カウンターステインは必要ありません。
4. 画像と解析
- スペクトルライブラリスライドの作成
- マルチスペクトル画像解析用に、同じコントロール組織を使用して、フルオロフォア、DAPI、自動蛍光ごとにライブラリスライド(単染色参照画像)を作成します。
- RMと肥沃な女性を持つ女性からの子宮内膜生検サンプルのスライドを使用して、各スライドの単一抗体検出のためにステップ1.1〜3.6.4を実行する(さらなる抗体またはフルオロフォア添加なし)。
- 各抗体検出について、スライドの1つをDAPI(ステップ3.6.2のように)で染色し、スペクトル内の任意の可能な組織の自動検出のために1つのスライドを染色しません。
- ワークステーションで適切なフィルタを使用して、各抗体のこのスライドセットの画像を取得し、画像解析ライブラリにアップロードします(ステップ 4.2 で説明)。
- イメージがキャプチャされたら、 スペクトル ライブラリ ソースとして inForm を選択し、スペクトル ライブラリを構築します。
- 蛍光体を使用する場合は、メニューから ステイン/フルーターを 選択します。
- 汚れや蛍光体を選択しながら、1つ以上のグループを選択して選択肢を絞り込みます。[ すべて]を 選択すると、画像と互換性のあるすべてのスペクトルが表示されます。
- スペクトルイメージング
メモ:画像は、inForm画像解析ソフトウェアを使用して確立されたスペクトルライブラリを備えたMantraワークステーションを使用してキャプチャされました。- 表2に提案されている適切なエピ蛍光フィルター(例えば、DAPI、フルオレセイン・イソチオシアネート[FITC]、CY3、テキサスレッド、およびCY5)を用いて、単一抗体染色スライドの画像をキャプチャする。
注: このプロトコルで使用される特定の蛍光素に推奨されるフィルタを 表 2に示します。 - 対応する蛍光チャネルの各マーカーを調べることにより、最適な信号に適した露光時間を特定します。
注:最適なシグナルは、単一抗体染色で得られた陽性と局在性に関する基準に従って決定されます。 - 各検体(抗体-フルオロフォアの組み合わせ)の固定露光時間を決定し、クロスサンプル比較を標準化します。
注:固定露出の決定は、興味のサンプルの強度に依存します。 - 組み込みの自動焦点アルゴリズムを使用して、適切なスキャンモードで多重染色スライドをスキャンします。
注: 確立されたスペクトル ライブラリは、マルチスペクトルイメージ キューブを個別のコンポーネント (スペクトルアンミックス) に区別するために使用されます。これにより、トレーニング セッションと画像解析セッションの 2 つの主要な手順を使用して、対象となるすべてのマーカーの色ベースの識別を処理できます。
- 表2に提案されている適切なエピ蛍光フィルター(例えば、DAPI、フルオレセイン・イソチオシアネート[FITC]、CY3、テキサスレッド、およびCY5)を用いて、単一抗体染色スライドの画像をキャプチャする。
- 画像解析
- 子宮内膜における選択免疫細胞タイプの細胞カウント
- 200倍の拡大率で分析するために、最低10フィールドをキャプチャします。
注: フィールドは、セクション全体を何も選択せずにスキャンすることでキャプチャされました。これにより、子宮内膜のすべての細胞成分、例えば、光上皮境界、間質、および腺の同時捕捉を確実にすることができる。 - セルをカウントするには、ステップバーの 「オブジェクト数をカウント 」ボタンをクリックして、「 オブジェクト数の設定」 パネルを表示します。
- 画像、プロセス領域、または組織領域のエッジに接触するオブジェクトを除外するには、[ エッジに触れる場合にオブジェクトを破棄 ]ボックスをオンにします。
- 組織がセグメント化されている場合は、オブジェクトが見つかる 組織カテゴリ を選択します。選択した組織カテゴリの外側にあるオブジェクトをカウントしないでください。
- オブジェクトを識別する 方法 を選択します: オブジェクトベース または ピクセルベース (しきい値)。
注:ピクセルベース(閾値)アプローチは、単純なしきい値の適用がオブジェクトピクセルを生成する信頼性のある、または一貫した汚れの場合に選択する必要があります。オブジェクトベースのアプローチは、オブジェクトの染色の一貫性と特異性が欠如している場合に、より高度なモーホメトリーベースのアプローチが必要な場合に推奨されます。 - 目的の シグナルスケーリングを選択します: 自動スケール または 固定スケール.
注: [自動スケール] を選択すると、オブジェクトのセグメンテーションを実行する前に、各コンポーネントプレーンが自動的にスケーリングされます。セグメンテーション性能が向上し、染色信号が一貫して信頼性の高い場合は、[ 固定スケール ]オプションをお勧めします。 - ドロップダウン リストからオブジェクト セグメンテーションの プライマリ コンポーネントを選択します。
- プライマリコンポーネントの [最小信号] の値を希望のしきい値に調整します。
- オブジェクトの穴を自動的に塗りつぶす場合は、[ 穴を埋める]を選択します。
- 1 つのオブジェクトとしてではなく、個別のオブジェクトとして他のオブジェクトに触れるオブジェクトを検出するには、[最大サイズ (ピクセル)]チェック ボックスをオンにした後で、[分割を調整] チェック ボックスをオンにします。
- オブジェクトの丸みを基準にしてオブジェクトを除外するには、[ 丸み] ボックスをオンにして、目的の [最小円度]を指定します。
- すべての間質細胞(CD3-/CD20-/CD68-/CD56-、およびDAPI+)を数えます。
- T細胞(CD3+およびDAPI+)、B細胞(CD20+およびDAPI+)、マクロファージ(CD68+およびDAPI+)、およびuNK細胞(CD56+およびDAPI+)を含む免疫細胞を別々に数える。
- キャプチャされた各画像の全体の間質細胞の数に対する免疫細胞の割合としてデータを表現し、最終的な細胞数を全フィールドの平均として報告します。
- ビュー エディタ を使用して、結果のデータ テーブルのポスト処理を表示します。 データ数テーブルをエクスポートします。
- 子宮内膜免疫細胞空間分布の定量化
- 200倍倍率の下で、セルセルコンタクト最大距離14と考えられる0〜20 μmの範囲に対してRプログラムを使用してL関数を推定する。
メモ: R 言語ツールボックスの「spatstat」は、L関数を測定するために使用されました。- L機能の曲線下領域(AUC)に基づいて、異なる免疫細胞のペアのクラスタリングのレベルを示します。
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Representative Results
4色の多重化アッセイを行う全体的な概略法を4種類の子宮内膜免疫細胞タイプの検出に用いた図1に示す。簡単に言えば、この多重免疫蛍光染色のためのプロトコルは、8つの重要なステップを必要としました:1.スライド調製、2.エピトープ検索、3.ブロッキング、4.一次抗体アプリケーション、5.二次抗体アプリケーション、6.シグナル増幅、7.反染色およびマウント。次に、画像のレンダリングと解析は、enform画像解析ソフトウェアを使用して生成されたスペクトルライブラリを用いて、子宮内膜サンプル内の4つの免疫細胞タイプを区別するために、Mantra Workstationを使用して行った(図2)。
この多重染色法を用いてヒト子宮内膜試料で4種類の子宮内膜免疫細胞を同定することができる:CD3+T細胞、CD20+B細胞、CD68+マクロファージ、およびCD56+uNK細胞(図3)。ただし、蛍光素干渉は、鮮明で使いやすい画像を得るために慎重に検討する必要があります。Mantra Workstationを使用したこのマルチスペクトル技術は、最大8プレックスアッセイをサポートできますが、このプロトコルで使用される4つのフルオロフォアの適用は、フルオロフォアの発光スペクトルの違いにより、フルオロフォア干渉のない最適な性能を示しました。対照的に、5~8の蛍光体を含む多重染色は、共有波長からの発光に起因する蛍光素干渉に対してより注意を要する場合が多い。
この欠点を克服するためには、マルチプレックスにおける各抗体の順序を決定し、子宮内膜試料中の各免疫マーカーの発現レベルおよびパターンを同定するために、モノプレックス染色が必要となる。これはマーカーおよび関連するTSAフルオロフォアの組み合わせの染色配列を決定するのに役立ちます。適用する抗体の順序を決定するためにモノプレックスアッセイが完了したら、次のステップは多重染色後の検出用のフルオロフォアを選択することです。目的の抗体ごとに、独自の蛍光体を選択する必要があります。各蛍光色素に関する数は、励起中に放射される蛍光波長とほぼ同じである(表1及び表2)。蛍光色素干渉を防ぐ方法の1つは、波長を持つフルオロフォアペアを可能な限り遠く(特に抗体を共局化する場合)を選択することです。これにより、過剰なスペクトルの重複を減らし、鮮明な画像とより信頼性の高いフェノタイピングを提供することができます。さらに、inFormソフトウェアのマルチプレックス合成画像からレーザーをオン/オフさせることによる細心の評価は、蛍光色素の飽和を最小限に抑えるための染色パターンを認識するのにも役立ちます(図4)。
画像解析では、CD3+T細胞、CD20+B細胞、CD68+マクロファージ、CD56+uNK細胞、および子宮内基質(CD3-/CD20-/CD68 - / CD56 -およびDAPI染色)の数を自動的に数えることができるインフォームフォームファインダーソフトウェア14.0(図5)各免疫細胞型密度は、全体の間質細胞数に対する割合で表した(図5)。同様に、子宮内膜免疫細胞の空間分布の定量化は、InFormシステムから得られたすべての単一の免疫細胞のXおよびY位置に基づいたものである(図6)。R言語を使用して、AUCに基づく免疫細胞の異なるペアのクラスタリングのレベルを区別することができます。
図1:ワークフロー図の染色 略語: BSA = ウシ血清アルブミン;HRP =わさびペルオキシダーゼ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:画像キャプチャおよび分析用ワークステーション(A)マントライメージングワークステーション、(B)未加工スペクトル画像、(C)合成画像、(C)組織セグメンテーション(上皮および間質コンパートメント)、(E)異なる細胞集団を同定する4つの着色マーカーを示す子宮内膜組織の合成画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: スペクトルイメージング4種類の免疫細胞タイプの多重免疫染色を、(A)肥沃な対照女性と(B)から子宮内膜生検に対して行い、単一のマルチスペクトルイメージングとして提示された未原因RMを有する女性である。単染色ライブラリの生成後、スペクトルを混合解除すると、(C)CD3、(D)CD56、(E)CD68、(F)CD20、G)DAPIを表す単一のフルオロフォアのイメージングが明らかになる可能性がある。合成画像は、マルチスペクトルイメージング(H)の後にすべてのフルオロフォアを組み込むことによって作成されました。スケールバー = 50 μm(A, B)略語: LE = ルミナール上皮;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;RM = 再発流産。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: インフォーム数計ツールinForm ソフトウェアカウントツールは、ベージュボックスのアイコン(↓で示される)を選択してアクティブになります。(A)画像調製、(B、C)手描きのトレーニングと自動化のためのセグメント化組織、(D)個々の細胞をセグメント化、(E)フルオロフォア強度に基づく細胞のフェノノタイピング、フルオロフォア強度の分析(選択された蛍光圏強度の陽性細胞数を示す赤いボックス)、および(G)が使用結果をエクスポート(赤いボックス)を示す。略語: IHC = 免疫体化学.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:細胞計数(A)細胞計数の細胞の定型化、および(B)セグメント化領域における陽性染色細胞の出力(例えば、間質)をさらに比較し、統計学的分析を行う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:空間密度の測定(A)セグメント化領域における正染色免疫細胞の位置(例えば、間質)の位置の自動検出、(B)各正染色CD20+免疫細胞の座標の出力表示、および(C)スタットを用いたセグメント化された組織領域におけるCD20+細胞と他の免疫細胞間の空間密度および局在を決定する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 命令 | 抗体 | クローン | クローン性 | 抗体希釈因子 | オパール | オパール希釈係数 |
| 1 | CD3 | SP7 | モノクローナル | 100人に1人 | オパール 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | モノクローナル | 100人に1人 | オパール 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | モノクローナル | 100人に1人 | オパール520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | モノクローナル | 100人に1人 | オパール 690 | 0.111111111 |
表1:使用する抗体、クローン、および濃度のリスト。
| 染める | 励起の最大値 (nm) | 排出の最大値 (nm) | フィルタ セット (名前) での検出が期待されます。 | 期待される色 |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | 青い |
| オパール520 | 494 | 525 | フィット | 緑 |
| オパール 620 | 588 | 616 | サイ3とテキサスレッド | 琥珀 |
| オパール 650 | 627 | 650 | テキサスレッドとサイ5 | オレンジ |
| オパール 690 | 676 | 694 | テキサスレッドとサイ5 | クリア |
表2:最大励起波長と発光波長、適切なフィルタセットでの期待検出、観察可能な色を持つ蛍光色素のリスト。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
多重染色には、勤勉な最適化が必要であることに注意することが重要です。クエン酸緩衝液およびマイクロ波技術を用いた抗原検索では、完全な抗体ストリッピングを確保し、組織の生存率を維持するための最適化が必要です。TSA試薬は抗原を取り巻く部位に共有結合するので、立体障害(「アンブレラ効果」とも呼ばれる)を介して、その後の一次抗体の結合を阻害する可能性がある。これは、複数の免疫マーカーが単一のセルコンパートメントに存在し、フルオロフォア干渉を引き起こす場合に発生する傾向があります。効果があるかどうかを特定するには、免疫細胞の局在化における重複を特定するために、あらかじめモノプレックスIHC/IFを実行することが重要です。スペクトルライブラリを生成するために単一サンプル染色が必要となるため、検証されたスペクトルライブラリは、蛍光素干渉をさらに防止するために個々の信号の識別を容易にすることができる。必要に応じて、一次抗体濃度およびインキュベーション時間、フルオロフォア抗体対合、TSAフルオロフォア濃度、および染色順序を変更して、フルオロフォア干渉を最小限に抑えてもよい。同様に、TSAダイマー形成を防止するためにはHRP濃度のバランスを適切に保つ事が重要である。これは、一次および二次抗体の滴定によって達成することができる。また、多重染色に用いられる一次抗体の濃度およびインキュベーション時間は、従来の発癌性単染色で使用されるものとは異なる可能性があることを覚えておくことが極めて重要です。したがって、多重染色に適用する抗体の濃度および順序の決定は、事前に行う必要があります。
変更とトラブルシューティング
本研究では、RMの有無にかかわらず女性の子宮内膜生検における4つの主要免疫細胞型の相互作用を同時に検出するために、蛍光多重蛍光免疫物質化学的染色を用いた。この技術は、T細胞に対するCD3、B細胞用CD20、マクロファージ用CD68、uNK細胞に対するCD56に対する抗体を使用して、これらの細胞タイプを区別する。この方法に基づいて、RM女性のCD3+、CD68+、およびCD56+細胞密度の中央値が、肥沃な制御15の中央値よりも有意に高いことがわかった。CD56+uNK細胞とCD68+マクロファージとの間のクラスタリングは、肥沃な制御よりもRM群において有意に高かった。また、この方法を用いた結果、CD56+uNK細胞は、両方の群の女性においてCD68+マクロファージとの間に数値的相関と空間的相関の両方を有するように見えた。対照的に、CD56+uNK細胞はRM15を有する女性のCD3+T細胞と有意な数値的な相関を有するが、空間的相関はない。 この方法はまた、子宮内膜における複数の免疫細胞タイプの空間的関係を決定する。ただし、特定のマーカーの陽性は、場合によっては境界線になる場合があります。この問題を解決するために、スペクトルライブラリを構築する際に陽性の閾値を決定するために、正のコントロールと負のコントロールを含めることが推奨されます。さらに、inFormソフトウェアの多重合成画像からレーザーをオン/オフさせることによる細心の評価は、蛍光色素の飽和を最小限に抑えるために染色パターンを認識するのにも役立ちます。
テクニックの制限
データ解釈時のフルオロフォア干渉の同定は、マーカーの本物の共局在化と非混合アーティファクトを区別するために不可欠です。この多重染色方法論は、酵素増幅によって駆動されるTSAベースの試薬を利用し、従来の間接的IF法と比較して10〜100倍の抗原マーカー強度を高める可能性がある。これは、過剰活性チラミド沈着のリスクを生成し、傘効果および/またはシグナルブリードスルーをもたらす可能性があります。オーバーステインを識別するために、inForm内の画像をアンミックスし、マルチプレックス組織画像の明るい正の領域にカーソルを置くことによって、信号レベルを視覚的に評価することができます。信号レベルは通常30以下、特にスペクトルに隣接するフルオロフォアの場合は、互いの因子3内に理想的に残るべきである。スペクトルに隣接する蛍光性蛍光HOREの信号の5倍以上の差は、フルオロフォア干渉を引き起こし、混合しないアーティファクトを引き起こす可能性があります。任意のフルオロフォアのシグナルレベルが隣接する蛍光素との差の3倍以上を示す場合、TSAフルオロフォア濃度は信号バランスを達成するために調整する必要があります。シグナルが正しい範囲に入っていることを確認したら、シグナルとバックグラウンドの比率を<1:10に維持して、非特異的な背景から正の染色が誤って検出されないようにする必要があります。
スペクトルクロストークは、大きな蛍光色素干渉を生じる可能性もあるため、染色の順序は、マーカーの配列と発現の両方でスペクトルに隣接する染料を分離するように調整する必要があります。Mantra Workstationを使用するこのマルチスペクトル技術は、最大8プレックスアッセイをサポートしますが、4つのフルオロフォア、すなわちオパール520、540、620、690のアプリケーションは、フルオロフォア干渉のない最高のパフォーマンスを示しています。≥5フルオロフォアの使用は、近位波長を共有するフルオロフォアのスペクトルプロファイルによるスペクトルクロストークを避けるために、多くの場合、より多くの最適化と検証が必要です。つまり、このアプローチで同時に検出できるターゲットの数は、波長バンド数と、利用可能な励起/発光フィルタセットの数によってのみ制限されます。したがって、他のTSAフルオロフォアのさらなる適用をブロックするTSAフルオロフォアの潜在的な過剰な汚染を排除したり、信号クロストークを識別したりするには、inFormソフトウェアのマルチプレックス合成画像からレイヤーをオン/オフさせることで細心の注意を払う必要があります。単一のIHC染色からの染色パターンを正しく解釈する。別の平面での局在に対応する1つの平面で明らかな損失、ゲイン、または同一の信号を探しています。
マルチスペクトル染色では、複数のマーカーを同時に検出するために、特定のフルオロフォアと組み合わせた抗体が必要です。このフルオロフォア抗体の組み合わせは、2つのルールに従います:i)共発現マーカーに割り当てられたフルオロフォアはスペクトル的に離れ、ii)より豊富なターゲットは、明るさの低いフルオロフォアとペアにする必要 があります。染色の順序はまた、連続抗体が染色された細胞内の同じ細胞区画内で共局化しないように配置する必要があります。したがって、抗体濃度およびインキュベーション時間以外は、従来の染色法において重要な因子であるが、適切なフルオロフォア抗体対合、TSAフルオロフォア濃度、染色配列、および1つ以上のマイクロ波治療への特異的抗体の曝露などの追加のパラメータは、多重染色に成功するために考慮されなければならない。スタディサンプルのばらつきが高いため、特定の多重プロトコルは、他のタイプのスタディサンプルで同じ結果を生成しない場合があります。
全体のオパールマルチプレックス連続染色プロセスは、パネルに関与するマーカーの数と一次抗体のインキュベーション時間に応じて、1日から数日かかることがあります.対照的に、標準的なIF法は、通常、染色の単一ラウンドで4〜5マーカーの可視化を可能にする。なお、従来のIHC法を用いて最適化された条件は、追加の複数のマイクロ波処理を伴う多重染色手順に進む前に、さらに最適化が必要であり、最終的に各抗体の染色強度に影響を及ぼすTSAフルオロフォアの適用が必要です。現在、マルチスペクトル技術を利用するイメージング手法では、高価で専用の計測が必要になる場合があります。また、対象となる画像選択領域のみに限定されてもよい。したがって、これは限られた資源を持つ実験室や不確実な抗原標的を持つ組織のスカウトには最適ではないかもしれない。
既存の方法に関する意義
この現在の方法の特定の強みは、単一の組織セクションで1〜2つの細胞タイプしか標識できない従来のIHC法とは異なり、子宮内の複数の免疫細胞タイプの密度を同時に測定する能力である。フローサイトメトリーは、子宮内膜標本における異なる免疫細胞タイプの相対的な割合を分析できる別の方法です。しかし、さまざまな免疫細胞型と異なる子宮内膜内の特異的分布との間に空間的な情報を提供することは不可能であろう。さらに、組織の枯渇は、臨床現場、特に臨床試験中および生検サンプルを使用する場合には深刻な懸念事項です。これらの2つの従来の方法は、手順を最適化し、RMの有無にかかわらず女性の子宮内膜内の複数の免疫細胞タイプを検出するために、多数の標本(セクションまたは細胞のいずれか)を必要とするであろう。
このプロトコルで説明されているように、 Opal ワークフローは、マントラ ワークステーションを使用して、同じ組織セクション内の最大 7 つのマーカーを検出するために設計されています。また、抗体選択時の種間反応性は、この技術の制限ではない。確かに、この技術の利点は、最大7つのマーカーを検出するために同じ種で育てられた抗体の使用を可能にすることです。このアプローチは、蛍光TSA試薬を用いて検出し、続いてマイクロ波処理を行い、非特異的染色を除去することを含む。マイクロ波ベースのストリッピングの後、抗体交差反応性のリスクなしに、追加のターゲット検出のために別の染色を行うことができます。さらに、このTSA検出方法は、低発現タンパク質標的を検出するための信頼性の高い結果を生成しながら、最大7つのフルオロクロムを組み合わせるために、最低3日間で行うことができます。従来のIHC研究に対する多重染色のもう一つの利点は、測定が自動化され、主観的バイアスを排除できる効率が向上することです。生成された定量的データは、アッセイの終了結果を表す。
今後のアプリケーション
この多重プロトコルの適用範囲は計り知れません。重要なのは、Mantra Workstationを用いた多重化免疫蛍光マーカー発現の検出方法と、RMの有無にかかわらず女性の複数の免疫細胞集団を区別する正確で再現性のある結果をもたらすInForm 2.2.1ソフトウェアを用いた画像解析を用いた第一の論文である。最終的には、特定の標的治療を確立するためのRMを有する女性の胚移植中の免疫細胞微小環境をよりよく理解することにつながる。
さらに、我々の現在の方法は、いくつかの免疫細胞とその相互作用が子宮内膜の機能にとって重要である可能性があることを実証するのに役立った。これは、4つの子宮内膜免疫細胞タイプのうち3つの密度の有意な変化と、CD68+およびCD56+細胞間のクラスタリングの有意な増加によって示される。逆に、これらの免疫細胞型の異常な相互作用は、RMの素因因子であり得る。さらに、免疫微小環境における空間的特徴の定量化とさらなる理解は、免疫療法の文脈におけるこの疾患の生物学に光を当てるのに役立つかもしれない。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、2018年に香港産婦人科信託基金と香港保健医療研究基金(07180226 06170186)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
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