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Neuroscience

人诱导多能干细胞及其神经和神经胶质衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

Published: November 8, 2021 doi: 10.3791/63116
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
* These authors contributed equally

Summary

本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告基因或抗体双重染色测量多种线粒体功能参数的新方法，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成和线粒体 DNA 的变化。

Abstract

线粒体在许多神经退行性疾病的病理生理学中很重要。线粒体体积、线粒体膜电位 （MMP）、线粒体活性氧产生 （ROS） 和线粒体 DNA （mtDNA） 拷贝数的变化通常是这些过程的特征。本报告详细介绍了一种基于流式细胞术的新型方法，用于测量不同细胞类型中的多种线粒体参数，包括人诱导多能干细胞（iPSC）和iPSC来源的神经和神经胶质细胞。这种基于流动的策略使用活细胞来测量线粒体体积、MMP 和 ROS 水平，并使用固定细胞来估计线粒体呼吸链 （MRC） 和 mtDNA 相关蛋白质（如线粒体转录因子 A （TFAM））的成分。

通过与荧光报告基因（包括 MitoTracker Green （MTG）、四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 和 MitoSox Red 共同染色，可以量化线粒体体积、MMP 和线粒体 ROS 的变化，并与线粒体含量相关。用针对MRC复合物亚基和线粒体外膜20转位酶（TOMM20）的抗体进行双重染色，可以评估MRC亚基的表达。由于TFAM的量与mtDNA拷贝数成正比，因此每个TOMM20的TFAM测量可以间接测量每个线粒体体积的mtDNA。整个协议可以在2-3小时内进行。重要的是，这些协议允许使用流式细胞术测量线粒体参数，包括总水平和每线粒体体积的特定水平。

Introduction

线粒体是存在于几乎所有真核细胞中的必需细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）来负责能量供应，并作为生物合成和代谢的代谢中介。线粒体深入参与许多其他重要的细胞过程，如ROS生成、细胞死亡和细胞内Ca2+ 调节。线粒体功能障碍与各种神经退行性疾病有关，包括帕金森病 （PD）、阿尔茨海默病 （AD）、亨廷顿病 （HD）、弗里德赖希共济失调 （FRDA） 和肌萎缩侧索硬化症 （ALS）1。线粒体功能障碍和mtDNA异常的增加也被认为有助于人类衰老2，3。

神经退行性疾病中会出现各种类型的线粒体功能障碍，线粒体体积的变化、MMP去极化、ROS的产生和mtDNA拷贝数的改变是常见的4，5，6，7。因此，在研究疾病机制和测试潜在治疗剂时，测量这些和其他线粒体功能的能力非常重要。此外，鉴于缺乏忠实复制人类神经退行性疾病的动物模型，建立合适的体外模型系统来概括脑细胞中的人类疾病是朝着更好地了解这些疾病和开发新疗法迈出的重要一步2，3，8，9。

人iPSCs可用于产生各种脑细胞，包括神经元和非神经元细胞（即神经胶质细胞），并且在两种细胞类型中都发现了与神经退行性疾病相关的线粒体损伤3，10，11，12，13。iPSC分化为神经和神经胶质谱系的适当方法可用14，15，16。这些细胞为体外疾病建模和药物筛选提供了独特的人/患者平台。此外，由于这些来自患者，iPSC衍生的神经元和神经胶质细胞提供了更准确地反映人类正在发生的事情的疾病模型。

迄今为止，很少有方便可靠的方法来测量iPSCs中的多个线粒体功能参数，特别是活神经元和神经胶质细胞。流式细胞术的使用为科学家提供了一种强大的工具来测量单细胞中的生物学参数，包括线粒体功能。该协议提供了生成不同类型的脑细胞的详细信息，包括来自 iPSC 的神经干细胞 （NSC）、神经元和神经胶质星形胶质细胞，以及基于流式细胞术的新型方法，用于测量不同细胞类型中的多个线粒体参数，包括 iPSC 和 iPSC 衍生的神经和神经胶质细胞。该协议还提供了使用流式细胞术测量线粒体体积、MMP、线粒体 ROS 水平、MRC 复合物和 TFAM 的共染色策略。通过结合线粒体体积或质量的测量，这些协议还允许测量每个线粒体单位的总水平和特定水平。

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Protocol

注意：请参阅 材料 表和 补充表S1 ，了解本协议中使用的所有培养基和溶液的配方。

1. 人 iPSC 分化为 NCS、多巴胺能 （DA） 神经元和星形胶质细胞

  1. 准备基质包被的板。
    1. 将一瓶 5 mL 基质在冰上解冻过夜。用 99 mL 冷的高级杜尔贝克改良鹰培养基/火腿的 F-12（高级 DMEM/F12）（1% 终浓度）稀释 1 mL 基质。制作1mL等分试样并将其储存在-20°C。
    2. 在4°C下解冻基质溶液（保持低温）并涂覆6孔（6孔板中每孔1mL）。
    3. 将基质包被的板置于37°C的加湿的5%CO2 / 95%空气培养箱中1小时。将板从培养箱中取出，使其平衡至室温（RT）。
      注意：建议在涂层后 3 天内使用板。但是，涂层板可以在4°C下储存长达2周。 只需记住在使用前将其取出并使其预热至 RT。对于长期储存，向包被板中加入 1 mL iPSC 培养基，以避免基质干燥。
  2. 解冻 iPSC
    1. 在室温下或在37°C的培养箱中预热基质包被的板20-30分钟。在室温下预热所需量的iPSC培养基。
    2. 将 6 mL 预热的 iPSC 培养基与 12 μL Y-27632 ROCK 抑制剂混合，以获得 10 μM 的终浓度。
    3. 在水浴中以37°C部分解冻iPSCs冷冻小瓶，直到剩下一小块冰。
    4. 将 1 mL 预热的 iPSC 培养基和 12 μL ROCK 抑制剂滴加到细胞中。使用 5 mL 移液管将装有 iPSC 的小瓶中的液体内容物滴入 6 孔预包被板的一个孔中。
    5. 垂直方向移动板以混合孔内容物并将板放回培养箱。用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（1x）（Ca 2 + / Mg2 +-free）（6孔板中每孔4mL）洗涤24小时后更换iPSC培养基。
      注意：不要在随后的喂食中添加 ROCK 抑制剂。每天更换iPSC培养基。
  3. iPSC的传代
    1. 在室温下或在37°C的培养箱中预热基质包被的板20-30分钟。在室温下预热所需量的iPSC培养基。
    2. 从含有细胞的平板中吸出培养基。用DPBS（1x）（不含Ca 2 + / Mg2 +）（6孔板中每孔4 mL）冲洗iPSC。
    3. 加入EDTA （0.5 mM）（6孔板中每孔1 mL）。在37°C下孵育板，直到菌落的边缘开始从孔中抬起（通常为3-5分钟）。吸出EDTA。
    4. 加入预热的iPSC培养基（6孔板中每孔4 mL），并使用10 mL无菌移液管强行分离iPSC菌落一次。不要上下移液，因为这可能会将细胞团块分解成单个细胞。
    5. 将每个孔的内容物转移到基质包被的6孔板中的两个单独的孔中（6孔板中每孔2mL），并在37°C下孵育。 移液时不要在悬浮液中产生气泡。
      注意：在将其保存在培养箱中之前，轻轻摇动板。分流比可以是1：2（一口井进入2口新井）到1：4（一口井进入4口新井）。
    6. 每天更换培养基，直到菌落达到60%汇合，尺寸和连接良好。
  4. 神经诱导和神经祖细胞生成
    1. 制备 500 mL 化学成分确定培养基 （CDM）、500 mL 神经诱导培养基 （NIM） 和 500 mL 无神经干细胞血清 （NSC SF） 培养基。
    2. 用DPBS（1x）（不含Ca 2 + / Mg2 +）（6孔板中每孔4mL）冲洗细胞并加入NIM（6孔板中每孔3mL）。设置为第 0 天。
    3. 在第 1 天、第 3 天和第 4 天更换 NIM（6 孔板中每孔 3 mL），并每天在显微镜下观察。
    4. 在第 5 天，将神经玫瑰花结分离到悬浮培养物中，如下所述。
      1. 用DPBS（1x）（不含Ca 2 + / Mg2 +）（在6孔板中每孔4 mL）轻轻洗涤一次。加入胶原酶IV（6孔板中每孔1mL），并在培养箱中保持1分钟。吸出 IV 胶原酶并用 DPBS （1x）（6 孔板中每孔 4 mL）轻轻洗涤一次。
      2. 每孔向 6 孔板中加入 2 mL NSC SF 培养基。通过使用 200 μL 移液器吸头绘制网格来刮孔底部来分离细胞。
      3. 将细胞悬液从6孔板收集到10cm非粘附培养皿中。用 NSC SF 培养基将体积补足至 12 mL。
      4. 在培养箱中的轨道振荡器上以65-85rpm的速度摇动非粘附培养皿以防止聚集。
  5. DA神经元分化
    1. 在第 7 天，加入 12 mL 补充有 100 ng/mL 成纤维细胞生长因子-8b （FGF-8b） 的 CDM，并将培养皿放在培养箱的轨道振荡器上。
    2. 在第8-13天，每2天更换一次培养基，并每天在显微镜下观察。
    3. 在第 14 天，加入 12 mL CDM，补充有 100 ng/mL FGF-8b 和 1 μM 紫吗啡胺 （PM）。将培养皿放在培养箱中的轨道振荡器上。
    4. 在第15-20天，每2天更换一次培养基，并每天观察显微镜下的细胞。
    5. 通过使用 1000 μL 吸头以机械方式通过球体来分解较大的球体。
      注意：比例可以是1：2（一道菜变成2道新菜）。
  6. 分化的终止
    1. 如下所述，用聚-L-鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白涂覆6孔板或盖玻片。
      1. 用每孔1mL的PLO涂覆6孔板，并将板在37°C孵育20分钟。吸出PLO溶液。
      2. 在紫外线下对板进行消毒20分钟。用DPBS（1x）（在6孔板中每孔4mL）冲洗孔两次。
      3. 向孔中加入5μg/ mL层粘连蛋白溶液（6孔板中每孔1mL），并在37°C下孵育2小时。吸出层粘连蛋白并在接种前用DPBS（1x）（6孔板中每孔4mL）短暂洗涤孔一次。
    2. 将所有球体（来自步骤1.5.5）收集在50 mL管中，并加满DPBS（1x）。以 300 × g 旋转 5 分钟。吸出上清液。
    3. 用2mL细胞解离试剂（参见 材料表）在37°C的水浴中孵育10分钟，然后用200μL移液管轻轻研磨（20-50次，取决于球体的大小，避免形成气泡）。
    4. 用 2 mL Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清 （FBS） 中和细胞解离试剂，并在室温下以 300 × g 离心含有细胞的 50 mL 锥形管 5 分钟。 吸出上清液。
    5. 加入 1 mL CDM，补充有 10 ng/mL 脑源性神经营养因子 （BDNF） 和 10 ng/mL 神经胶质细胞系来源神经营养因子 （GDNF），通过轻轻上下移液来重悬细胞沉淀以获得单细胞悬浮液。
    6. 从板中吸出层粘连蛋白溶液（步骤1.6.1.3），用DPBS（1x）（6孔板中每孔4mL）短暂洗涤，并将细胞（来自步骤1.6.5）接种在预包被板或盖玻片中，接种在补充有10ng / mL BDNF和10 ng / mL GDNF的3 mL CDM中。每4天喂一次细胞。
      注意：分化培养物可以维持数周至3个月。神经形态通常在终止2周后出现，并可用于从该点开始的下游分析。BDNF和GDNF对于长期维护（长达2个月）的培养不是必需的。
  7. NSC 生成
    1. 涂覆基质板。
    2. 在 50 mL 管中收集所有神经球（从步骤 1.4 生成），并用 DPBS （1x）（不含Ca 2+/Mg2+）加满。以 300 × g 旋转 5 分钟。吸出上清液。
    3. 将沉淀与2mL细胞解离试剂在37°C的水浴中孵育10分钟，然后用200μL移液管轻轻研磨（20-50次，取决于球体的大小，避免形成气泡）。
    4. 用 2 mL DMEM 和 10% FBS 中和，并在室温下以 300 × g 离心含有细胞的 50 mL 锥形管 5 分钟。 吸出上清液。通过轻轻上下移液重悬细胞沉淀以获得单细胞悬浮液。
    5. 从预包被板中吸出基质溶液，并将细胞接种在NSC SF培养基中（6孔板中每孔3 mL）。每2-3天喂一次细胞，并在汇合时分裂细胞。
      注意：从此阶段开始，可以扩展和冻结 NSC。
  8. 胶质星形胶质细胞分化
    1. 来自 NSC 的星形胶质细胞分化
      1. 准备 500 mL 星形胶质细胞分化培养基。
      2. 用NSC SF培养基在聚-D-赖氨酸（PDL）包被的平板/盖玻片上播种NSC。
      3. 第二天，用DPBS（1x）（Ca 2 + / Mg2 +-free）（6孔板中每孔4mL）冲洗细胞，并加入星形胶质细胞分化培养基（6孔板中每孔3mL）。设置为第 0 天。
      4. 每天在显微镜下观察NSC，并从第1天到第27天每2天更换星形胶质细胞分化培养基（6孔板中每孔3mL）。
    2. 星形胶质细胞成熟
      1. 准备星形胶质细胞成熟培养基。
      2. 在第28天，用DPBS（1x）（6孔板中每孔4mL）冲洗细胞，并加入星形胶质细胞成熟培养基（6孔板中每孔3mL）。
      3. 在第29天及以后，每天在显微镜下观察细胞，并每2天更换星形胶质细胞成熟培养基（6孔板中每孔3mL）。
      4. 成熟一个月后，从这个阶段开始扩增细胞并冷冻保存它们。
        注意：在此阶段，单元格数量将增加。分裂细胞时，不需要PDL包被的盖玻片进行培养。

2. 通过免疫细胞化学和免疫荧光染色进行细胞表征

  1. 在培养期结束时，将带有细胞的盖玻片转移到12孔板中。
    用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1x）冲洗细胞两次，并在室温下在4%多聚甲醛（PFA）（12孔板中每孔0.5mL）中孵育10分钟。
    注意：固定样品可以用2mL PBS（1x）覆盖，并储存在4°C直至需要免疫染色。PFA有毒，被怀疑会导致癌症。防止皮肤和眼睛暴露，并在化学通风橱下工作。
  2. 封闭并透化细胞，并与含有PBS（1x），0.3%Triton X-100和10%正常山羊血清的封闭缓冲液在室温下孵育1小时。
  3. 在封闭缓冲液中与一抗在4°C孵育过夜：具有抗八聚体结合转录因子4（Oct4）和抗阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4）的染色iPSC，具有抗性别决定区Y框-2（Sox2）和抗Nestin的NSC，具有反配对盒-6（Pax6）和抗Nestin的神经球，具有抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抗S100钙结合蛋白β（S100β）的星形胶质细胞，以及具有抗酪氨酸羟化酶（TH）的DA神经元， 抗 β III 微管蛋白 （Tuj 1）、抗突触素和抗 PSD-95（12 孔板中每孔 0.5 mL 一抗溶液;详见 材料表 ）。
  4. 用PBS（1x）洗涤样品三次，每次10分钟，轻轻摇动。
  5. 与二抗溶液（封闭缓冲液中的1：800，12孔板中每孔0.5mL Alexa Fluor二抗溶液）在室温下轻轻摇动孵育1小时。
  6. 用Hoechst 33342（1：5，000，12孔板中每孔0.5mL）在PBS（1x）中孵育细胞15分钟以标记细胞核。
  7. 用封片剂安装细胞并在室温下干燥过夜，以便在黑暗中在荧光显微镜下成像。有关显微镜设置和参数，请参见 补充图S1 。

3. 活细胞中线粒体体积、MMP和线粒体ROS的流式细胞术测量

  1. 将细胞分别接种到6孔板中的4个孔中，直到细胞达到50%-60%汇合度。将这四个孔标记为 #1、#2、#3 和 #4。
  2. 在培养期结束时，准备5个单独的染色溶液（6孔板中每孔500μL），如下所示：#1仅培养基（至仅包含用于对照的细胞的孔#1）;#2-1含有FCCP（100μM）;#2-2在培养基中含有FCCP（100μM）+ TMRE（100nM）+ MTG（150nM）;#3在培养基中含有TMRE（100nM）+ MTG（150nM）;#4 含有 MitoSox 红 （10 μM） + MTG （150 nM） 在 PBS （1x） 中含有 10% FBS。有关这些化合物和流式细胞术设置的详细信息，请参见 图1A、 补充表S2和 材料表 。
    注意：使用培养基制备染色溶液。使用前在室温下预热培养基和 PBS （1x）。FCCP 有毒;防止皮肤和眼睛暴露，并在化学通风橱下工作。
  3. 从#2孔中吸出培养基并加入#2-1溶液（仅限FCCP）。将细胞在37°C孵育10分钟。
  4. 从#2和#3孔中吸出培养基，并在#2孔中加入#2-2溶液（FCCP + TMRE + MTG）和#3中的#3溶液（TMRE + MTG）。将细胞在37°C孵育45分钟。
  5. 从#4孔中吸出培养基并加入#4溶液（MitoSox Red + MTG）。将细胞在37°C孵育15分钟。
  6. 从所有孔中吸出培养基。用PBS（1x）（6孔板中每孔4mL）洗涤。使用1mL细胞解离试剂（6孔板中每孔1mL）在37°C下分离细胞5分钟。用 10% FBS（6 孔板中每孔 2 mL）中和 1 mL DMEM 中的细胞解离试剂。
  7. 将所有孔的内容物收集在 15 mL 锥形管中。将试管以300× g 离心5分钟。用PBS（1x）清洗颗粒一次或两次。
  8. 吸出上清液，但在管中留下约 100 μL。将细胞沉淀重悬于 300 μL PBS （1x） 中。将细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中。在室温下将试管保持在黑暗中。
  9. 使用流式细胞仪（具有3个蓝色和1个红色激光配置）分析细胞。使用 530/30 带通滤光片检测滤光片 1 （FL1） 中的 MTG，使用带通滤光片 585/40 检测滤光片 2 （FL2） 中的 TMRE，使用 510/580 带通滤光片检测滤光片 3 （FL3） 中的 MitoSox Red。

4. 固定细胞中MRC复合亚基和TFAM的流式细胞术测量

  1. 在培养期结束时，通过加入细胞解离试剂分离细胞（~106）;然后，沉淀并将细胞收集在 15 mL 管中。通过用PBS（1x）离心两次，以300×g离心5分钟来洗涤细胞。
  2. 将细胞固定在室温下 1.6% PFA（1 mL 管中的 1.6% PFA）中 10 分钟。通过用PBS（1x）离心两次，以300×g离心5分钟来洗涤细胞。
  3. 用冰冷的90%甲醇（15mL管中的1mL90%甲醇）在-20°C下透化细胞20分钟。
  4. 封闭缓冲液中含有 0.3 M 甘氨酸、5% 山羊血清和 1% 牛血清白蛋白 （BSA） - PBS （1x） 中的级分 V（15 mL 管中的封闭缓冲液）。通过用PBS（1x）离心两次（如步骤3.7）洗涤细胞。
  5. 用以下一抗孵育细胞30分钟：抗NDUFB10（1：1，000）用于测量复合物I亚基，抗琥珀酸脱氢酶复合黄素蛋白亚基A（SDHA，1：1，000）用于测量复合物II亚基和抗COX IV（1：1，000）用于测量复合物IV亚基，以及与Alexa Fluor 488偶联的抗TFAM抗体（1：400）。用Alexa Fluor 488（1：400）偶联的抗TOMM20抗体分别染色相同数量的细胞30分钟（15 mL管中的1 mL一抗溶液;有关抗体的详细信息，请参阅 材料表 ）。
  6. 用PBS（1x）洗涤细胞一次，以300× g 离心5分钟。将二抗（1：400）加入NDUFB10，SDHA和COX IV管中，并用这些溶液孵育细胞30分钟。
  7. 用PBS（1x）洗涤细胞一次，以300× g 离心5分钟。吸出上清液，在管中留下约 100 μL。将细胞沉淀重悬于 300 μL PBS （1x） 中。将细胞转移到冰上黑暗保存的 1.5 mL 微量离心管中。
  8. 分析流式细胞仪上的细胞（使用3蓝色和1红色激光配置）。使用 530/30 带通滤波器检测滤波器 1 （FL1） 中的信号。有关显微镜设置和参数，请参见 补充图S2 。

5. 流式细胞术采集与分析

  1. 使用未染色的对照管根据所分析细胞群的大小和复杂性设置前向散射区域 （FSC-A） 和侧向散射区域 （SSC-A） 散点图。有关显微镜设置和参数，请参见 补充图S2 。
    注意：为单个细胞类型设置非染色对照。
  2. 使用非染色对照管选择阳性门，并使用单色对照管补偿多色流式细胞术中MTG（荧光团-1 [FL-1]）和TMRE（FL-2）之间的荧光光谱重叠。使用阴性对照的同种型对照来监测MRC和TFAM样品中的背景染色。使用 FCCP 管作为 TMRE 染色的去极化对照。
  3. 从前向和侧向散射图中剔除外来碎片以选择活细胞和主门控（图2A）。使用前向散射高度 （FSC-H） 与（相对于）FSC-A 密度图来排除双峰，并构建侧向散射高度 （SSC-H） 与 SSC-A 图（图 2A）。
  4. 数据采集（流式细胞仪）
    1. 使用未染色或同种型样品作为阴性对照，在观察SSC-A和各种过滤器（FL1，FL2，FL3，FL4）的同时，在单细胞事件的主要群体上方创建一个门（图1B和图2B）。
  5. 数据分析（CFlow 软件）
    1. 将栅极的位置复制到染色的细胞样品上，并记录阳性染色的阳性染色细胞量。
    2. 对于每个细胞亚群，选择直方图并分析不同过滤通道（FL1，FL2，FL3，FL4）（x轴）的中位荧光强度（MFI）。
      1. 通过在直方图中从 #3 TMRE 染色样品中减去 FL2 的 MFI 中减去 #2 FCCP 处理细胞的 FL3 的 MFI 来计算 TMRE 水平，如下面的方程 （1） 所示。
        TMRE 水平 = 来自 #3 TMRE 染色样品的 FL2 的 MFI - #2 FCCP 处理细胞的 FL2 MFI （1）
      2. 通过TMRE或MitoSox Red中的MFI计算MMP和线粒体ROS的特定值，除以线粒体体积指示器MTG。
      3. 通过在复合表达或TFAM中使用MFI计算复合亚基和TFAM的特定值，除以线粒体体积指示器TOMM20。

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Representative Results

分化方法和流式细胞术策略的示意图如图 3所示。将人iPSC分化为神经花环，然后提升到悬浮培养物中分化为神经球体。神经球进一步分化并成熟为DA神经元。神经球被解离成单细胞以产生神经胶质星形胶质细胞，作为NSC重新铺在单层中，然后分化成星形胶质细胞。该协议提供了通过流式细胞术获取和分析样品所需的策略，以测量MMP，线粒体体积，线粒体ROS水平，MRC复合物亚基的表达水平和TFAM（相对mtDNA拷贝数的间接测量）。具体而言，与荧光报告基因TMRE和MTG共染色用于检测和量化MMP和线粒体体积的变化。与MitoSox Red和MTG共染色可以测量活细胞中线粒体ROS的产生。用针对MRC复合物亚基的抗体与TOMM20一起染色可以评估MRC，并对TFAM和TOMM20进行染色，以间接评估mtDNA拷贝数。重要的是，MTG和TOMM20允许测量每个线粒体体积，抵消线粒体体积对这些参数的影响。

DA神经元通过双重SMAD抑制从iPSC产生，并暴露于FGF-8b和声波刺猬（SHH）激动剂PM，如图4A所示。将人 iPSC 接种在基质包被板上的 iPSC 培养基中。当细胞达到50%-80%汇合时，使用补充有SB431542，AMPK抑制剂，化合物C和N-乙酰半胱氨酸的CDM将培养基更改为NIM，持续5天。5天后，iPSC（图4B，a）进展到神经上皮阶段，表现出清晰的神经花环结构（图4B，b）。在第5天，通过将神经上皮提升到悬浮培养物中并在培养箱内的轨道振荡器上的NSC SF培养基中培养它们来产生神经球体。圆形、定义明确的球体如图4B，c所示。在第7天，将培养基更换为补充有100 ng/mL FGF-8b的CDM。在第 14 天，将培养基换入补充有 100 ng/mL FGF-8b 和 1 μM PM 的 CDM。在第21天，通过将球体解离成单细胞并在补充有10ng / mL BDNF和10 ng / mL GDNF的CDM中培养它们，将它们解离成单层DA神经元和层粘连蛋白包被的板/盖玻片。成熟15-30天的神经元（图4B，e）进一步用于线粒体功能测量。

NSCs是通过将神经球解离成单个细胞，然后将它们重新铺在单层中以产生星形胶质细胞而产生的。这些NSC表现出经典的神经祖外观（图4B，d）。现阶段的 NSC 可以随时扩展和储存以供进一步使用。为了启动星形胶质细胞分化，将NSCs接种在NSC SF培养基中的PDL包被的盖玻片上。第二天，将培养基更换为星形胶质细胞分化培养基28天。28天后，分化的星形胶质细胞在星形胶质细胞成熟培养基中进一步成熟。在这个阶段，星形胶质细胞应显示星形形态（图4B，f），这些细胞可以扩增和储存以供进一步使用，包括线粒体功能评估。

在分化过程中，使用免疫荧光染色确认细胞身份。 在图5A中，免疫染色显示iPSC表达特异性多能标志物SSEA4和Oct4。 图5B 显示神经球对Nestin和Pax6进行阳性染色，而 图5C 显示单层中iPSC衍生的NSC表现出Nestin和Sox2的阳性染色。为了鉴定DA神经元，用神经标志物β III微管蛋白（Tuj 1）和DA神经元标志物酪氨酸羟化酶（TH）染色细胞（图6B）。此外，DA神经元显示突触标记物，突触素和PSD-95染色，确认其功能性突触连接（图5B）。iPSC来源的星形胶质细胞的免疫染色显示星形胶质细胞标志物，神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100钙结合蛋白β（S100β）的表达。

使用流式细胞术对分化神经元和星形胶质细胞中线粒体功能的研究如上所述在协议第 3 节和第 4 节中进行。使用流式细胞仪进行数据采集，使用CFlow采样器进行数据分析，如图 1B所示。

图2显示了对活单细胞进行门控的方法。使用FSC与SSC图排除死细胞和细胞碎片（图2A，a）。使用FSC-H与FSC-A图（图2A，b）排除细胞双峰，然后是SSC-H与SSC-A图（图2A，c）。如果将特定细胞类型的阴性群体与同一细胞类型中的阳性群体进行比较，则正确评估背景荧光（图2B，a）。对于MMP样品，用FCCP处理细胞可消除线粒体膜电位和TMRE染色的干扰（图2B，b）。

这些流式细胞术方法已被用于研究由携带线粒体DNA聚合酶催化亚基POLG（W748S）突变的人iPSC产生的DA神经元，并将其与底特律551成纤维细胞产生的无病样品进行比较。如前所述4，这项研究还表明POLG DA神经元中的MMP降低和特定线粒体ROS水平增加（图7）。线粒体体积、总MMP和总线粒体ROS水平不变。 在图8中，结果显示与对照组相比，突变DA神经元中的特定复合物I水平降低，总TFAM水平和特定TFAM水平降低，但特异性复合物II水平相似。

这种方法也用于研究从相同的iPSC系产生的星形胶质细胞。如前7 报道和 图9所示，结果表明POLG突变的星形胶质细胞具有较低的总MMP和特异性MMP，但与对照组相比，线粒体体积和线粒体ROS相似，并且特异性复合物I和IV的水平降低（图10）。然而，POLG星形胶质细胞中复合物I和IV的总水平没有变化，复合物II的总水平和特异性水平也没有变化。总体而言，这些数据表明，对多个线粒体参数的流式细胞术分析提供了第一步近似，这对于评估iPSCs及其神经和神经胶质衍生物等细胞中的线粒体功能很有价值。

Figure 1
图 1：流式细胞术的设置。 （A）MMP，线粒体体积和线粒体ROS染色;（B）C6流式细胞仪数据采集的示例。缩写：MMP = 线粒体膜电位;ROS = 活性氧;FCCP = 羰基氰对三氟甲氧基苯腙;TMRE = 四甲基罗丹明乙酯;MTG = MitoTracker Green。另请参阅 补充表 S2。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：门控策略。 （A） 数据采集;（B）活细胞中MTG和TMRE染色的荧光直方图。缩写：SSC-A = 侧向散射区域;FSC-A = 前向散射区域;SSC-H = 侧向散射高度;FSC-H = 前向散射高度;FL#-A = 荧光团 # 面积;MTG = MitoTracker Green;FCCP = 羰基氰对三氟甲氧基苯腙;TMRE = 四甲基罗丹明乙酯。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3：协议工作流程的示意图。 缩写：DA = 多巴胺能;MMP = 线粒体膜电位;ROS = 活性氧;NDUFB 10 = NADH：泛醌氧化还原酶亚基10;SDHA = 琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基 A;COX IV = 细胞色素 c 氧化酶复合物 IV;mtDNA = 线粒体 DNA;TFAM = 线粒体转录因子 A. 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：iPSC分化。 （A）分化过程中不同阶段细胞的流程图和（B）代表性图像，包括iPSC（a），神经花环（b），神经球（c），NSCs（d），DA神经元（e）和星形胶质细胞（f）。比例尺 = 25 μm。缩写：iPSC = 诱导多能干细胞;NSC = 神经干细胞;DA = 多巴胺能;SFM = 无血清培养基;CDM = 化学成分明确的培养基;FGF-8b = 成纤维细胞生长因子-8b;PM = 紫吗啡;BDNF = 脑源性神经营养因子;GDNF = 神经胶质细胞系衍生的神经营养因子;PLO = 聚-L-鸟氨酸。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：iPSC 及其神经衍生物的代表性共聚焦图像。 （A） iPSC 中 SSEA4（红色）和 Oct4（绿色）的免疫染色。（B）iPSC衍生神经元球体中Nestin（红色）和Pax6（绿色）的免疫染色。（C）iPSC衍生的NSC中Nestin（红色）和Sox2（绿色）的免疫染色。 细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 50 μm。缩写：iPSC = 诱导多能干细胞;NSC = 神经干细胞;SSEA4 = 阶段特异性胚胎抗原-4;Oct4 = 八聚体结合转录因子 4;Pax6 = 成对的盒子-6;Sox2 = 性别决定区域 Y 框-2;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图 6：iPSC 衍生的星形胶质细胞和 DA 神经元的代表性共聚焦图像。 （A）iPSC衍生星形胶质细胞中GFAP（红色）和S100β（绿色）的免疫染色。（B）iPSC衍生DA神经元中神经谱系标记TH（绿色），Tuj 1（红色）和神经功能标记突触素（绿色）和PSD-95（红色）的免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 25 μm。缩写：iPSC = 诱导多能干细胞;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白;S100β = S100钙结合蛋白β;Tuj 1 = β III 微管蛋白;PSD-95 = 突触后密度蛋白 95;DA = 多巴胺能;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图 7：源自 POLG 患者 iPSC 的一个克隆和底特律 551 对照 iPSC 的一个克隆的 DA 神经元的流式细胞术分析。 （A） MTG 测量的线粒体体积，（B） TMRE 测量的总 MMP，（C） 由总 TMRE/MTG 计算的特定 MMP 水平，（D） 由 MitoSox Red 测量的总线粒体 ROS，以及 （E）通过总MitoSox Red/MTG计算的特定线粒体ROS水平。 数据以样品数量（每个克隆n≥3）的平均值±标准误差表示。使用GraphPad Prism软件分析和生成数据。曼-惠特尼 U 检验用于评估变量的统计显著性。显著性表示为 P < 0.05。*P < 0.05;ns，不重要。缩写：DA = 多巴胺能;POLG = DNA聚合酶亚基γ;iPSC = 诱导多能干细胞;MMP = 线粒体膜电位;ROS = 活性氧;MTG = MitoTracker Green;TMRE = 四甲基罗丹明乙酯。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 8
图 8：来自 POLG 患者 iPSC 的一个克隆和底特律 551 对照 iPSC 的一个克隆的星形胶质细胞的流式细胞术分析。 （A） 用 MTG 测量的线粒体体积，（B） 用 TMRE 测量的总 MMP，（C） 通过总 TMRE/MTG 计算的特定 MMP 水平，（D） 由 MitoSox Red 测量的总圆粒体 ROS S，以及 （E）通过总MitoSox Red/MTG计算的特定线粒体ROS水平。 数据以样品数量（每个克隆n≥3）的平均值±标准误差表示。使用GraphPad Prism软件分析和生成数据。曼-惠特尼 U 检验用于评估变量的统计显著性。显著性表示为 P < 0.05。*P < 0.05;ns，不重要。缩写：POLG = DNA 聚合酶亚基 γ;iPSC = 诱导多能干细胞;MMP = 线粒体膜电位;ROS = 活性氧;MTG = MitoTracker Green;TMRE = 四甲基罗丹明乙酯。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 9
图 9：源自 POLG 患者 iPSC 的一个克隆和底特律 551 对照 iPSC 的一个克隆的 DA 神经元的流式细胞术分析。 （A）由NDUFB10测量的总复合物I，（B）由总NDUFB10 / TOMM20计算的特定复合物I水平，（C）由SDHA测量的总复合物II，（D）由总SDHA/TOMM20计算的特定复合物II水平，（E）由TFAM测量的总TFAM，以及（F）由总TFAM/TOMM20计算的特定TFAM水平。数据以样本数的平均值±标准误差（SEM）表示（每个克隆n≥3）。使用GraphPad Prism软件分析和生成数据。用于评估变量统计显著性的曼-惠特尼 U 检验。显著性表示为 P < 0.05。*P < 0.05;ns，不重要。缩写：DA = 多巴胺能;POLG = DNA聚合酶亚基γ;iPSC = 诱导多能干细胞;NDUFB10 = NADH：泛醌氧化还原酶亚基10;TOMM20=线粒体外膜20的转位酶;SDHA = 琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基 A;TFAM = 线粒体转录因子 A. 请点击此处查看此图的大图。

Figure 10
图 10：源自 POLG 患者 iPSC 的一个克隆和底特律 551 对照 iPSC 的一个克隆的星形胶质细胞的流式细胞术分析。 （A） 用 NDUFB10 测量的总复合物 I， （B） 由总 NDUFB10/TOMM20 计算的特定复合物 I 水平， （C） 由 SDHA 测量的总复合物 II， （D） 由总 SDHA/TOMM20 计算的特定复合物 II 水平， （E）由COX IV测量的总复合物IV，（F）由COX IV / TOMM20计算的特定复合物IV水平，（G）由TFAM测量的总TFAM和（H）由总TFAM/TOMM20计算的特定TFAM水平。数据以样本数的平均值±标准误差（SEM）表示（每个克隆n≥3）。使用GraphPad Prism软件分析和生成数据。曼-惠特尼 U 检验用于评估变量的统计显著性。显著性表示为 P < 0.05。*P < 0.05;** P < 0.01;ns，不重要。缩写：POLG = DNA 聚合酶亚基 γ;iPSC = 诱导多能干细胞;NDUFB10 = NADH：泛醌氧化还原酶亚基10;TOMM20=线粒体外膜20的转位酶;SDHA = 琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基 A;TFAM = 线粒体转录因子 A;COX IV = 细胞色素 c 氧化酶复合物 IV。 请点击此处查看此图的大图。

补充图S1：共聚焦激光扫描荧光显微镜的设置和拍摄图像的步骤。 （A） 选择 配置 工具，然后从 当前可用 激光器中选择正确的激光器类型并设置其功率。（B）选择采集 -采集模式-SEQ ，并从数据库中选择相应的荧光波长照片模式。（C） 选择 顺序扫描加载 并导入相应的模式。（D）选择40倍物镜并滴加。（五）拍摄不同波长照片的具体设置参数。（F） 设置照片参数，预览并保存照片。 请点击此处下载此文件。

补充图S2：流式细胞术的步骤和设置。（A） 打开 Cflow 软件，选择“文件”工具，然后选择“打开 CFlow 文件或模板”。（B） 设置 40000 个事件，并在“运行限制”面板中选择仅包含活动单个单元格的门。在“流体”面板中选择“中速”。（C） 选择 FSC-A 与 FSC-A 图（a） 来设置主门控。选择 FSC-A 与 FSC-H 图 （b） 和 SSC-A 与 SSC-H 图 （c） 以排除双峰。选择相应的过滤器，例如FL1或FL2，并使用FL1-A与FSC-A图（d）或FL2-A与FSC-A图绘制运行未染色细胞时的阳性事件。（D）设置相同的参数，预览，运行染色样品并保存照片。另请参阅补充表 S2。请点击此处下载此文件。

补充表S1：培养基和溶液配方。请按此下载此表格。

补充表 S2：流式细胞术染色的设置。请按此下载此表格。

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Discussion

以下是用于生成iPSC衍生的神经元和星形胶质细胞以及使用流式细胞术评估线粒体功能的多个方面的协议。这些方案允许将人iPSCs有效地转化为神经元和神经胶质星形胶质细胞，并详细表征线粒体功能，主要是在活细胞中。该协议还提供了基于共染色流式细胞术的策略，用于获取和分析多种线粒体功能，包括活细胞中的体积、MMP 和线粒体 ROS 水平以及固定细胞中的 MRC 复合物和 TFAM。具体来说，这些协议允许估计每个线粒体体积的总水平和特定水平。虽然该策略检测DA神经元和星形胶质细胞中已知线粒体疾病（POLG）中的线粒体功能障碍，但这些技术适用于任何类型的细胞和疾病。此外，该协议稳健且可重复。以前的几项研究已成功应用该协议来分析成纤维细胞，iPSC，NSC，DA神经元和星形胶质细胞的线粒体变化2，3，13，17。

执行此协议时需要考虑一些关键点。为了确保一致和高效的分化，使用高质量的iPSC（含有<5%分化细胞的细胞）启动转化至关重要。尽管其他市售的定义培养基可以是有效的替代品，但本研究并未解决替代品。由于iPSC系的培养基组成和克隆差异会影响起始细胞群的增殖和分化效率，因此使该方案适应其他维持性培养基可能需要优化。

之前已经研究了MTG和MMP荧光之间的关系3。这一点很重要，因为据报道MTG荧光既独立于18 ，又对MMP19，20敏感。在先前的研究中，用不同浓度的TMRE滴定iPSCs并用150 nM MTG共染色，在较低浓度的TMRE（5-100 nM）下，MTG水平保持不变，而对于较高浓度的TMRE（超过100 nM）观察到MTG信号降低。因此，选择100 nM TMRE和150 nM MTG来测量特定的MMP。由于这种关系可能是细胞特异性的，因此在使用MTG和TMRE双重染色测量MMP之前，必须评估MTG和MMP荧光之间的相关性。

细胞密度也会影响线粒体功能和细胞代谢。在这项研究中，观察到MMP的细胞密度依赖性变化，这在其他研究中也得到了证明21。因此，在为不同细胞类型建立共染色方案时，在所有样品中选择相似的细胞密度（不要太高或太低）以尽量减少差异非常重要。与其他基于显微镜的检测相比，流式细胞术在分析大量细胞时具有速度和可重复性的优势。在显微图像的分析中，研究人员的偏向会在一定程度上扭曲结果，这在使用流式细胞术时不是问题。此外，流式细胞术分析需要不到一百万个细胞，一个样品的分析只需要几分钟，这意味着可以在1-2小时内分析数十个样品。该技术也可以应用于多种细胞类型，包括来自其他神经退行性疾病的细胞类型，因此应该有助于理解不同神经退行性疾病的机制和测试潜在的治疗方法。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgments

我们衷心感谢挪威卑尔根大学的分子成像中心和流式细胞术核心设施。这项工作得到了挪威研究委员会（资助号：229652），Rakel og Otto Kr.Bruuns legat和中国国家留学基金委（项目编号：201906220275）的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

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References

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神经科学，第177期，
人诱导多能干细胞及其神经和神经胶质衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析
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Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, … More

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

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