Summary
Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono un potente strumento nella ricerca traslazionale sul cancro, che riflette sia l'eterogeneità genetica che fenotipica della malattia e la risposta alle terapie antitumorali personalizzate. Qui, viene dettagliato un protocollo consolidato per generare DOP di carcinoma della vescica primario umano in preparazione per la valutazione delle analisi fenotipiche e delle risposte ai farmaci.
Abstract
Le attuali piattaforme di test terapeutici in vitro non hanno rilevanza per la fisiopatologia tumorale, impiegando tipicamente linee cellulari tumorali stabilite come colture bidimensionali (2D) su coltura tissutale di plastica. C'è un bisogno critico di modelli più rappresentativi della complessità tumorale in grado di prevedere con precisione la risposta terapeutica e la sensibilità. Lo sviluppo di colture tridimensionali (3D) ex vivo di organoidi derivati dal paziente (DOP), derivati da tessuti tumorali freschi, mira ad affrontare queste carenze. Le colture organoidiche possono essere utilizzate come surrogati tumorali in parallelo alla gestione clinica di routine per informare le decisioni terapeutiche identificando potenziali interventi efficaci e indicando terapie che possono essere inutili. Qui, questa procedura mira a descrivere strategie e un protocollo dettagliato passo-passo per stabilire DOP di cancro alla vescica da tessuto clinico fresco e vitale. I nostri protocolli consolidati e ottimizzati sono pratici per impostare colture 3D per esperimenti utilizzando materiale di partenza limitato e diversificato direttamente dai pazienti o materiale tumorale allo xenotrapianto derivato dal paziente (PDX). Questa procedura può essere impiegata anche dalla maggior parte dei laboratori dotati di attrezzature standard per la coltura dei tessuti. Gli organoidi generati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati come surrogati ex vivo per comprendere sia i meccanismi molecolari alla base della patologia urologica del cancro sia per valutare i trattamenti per informare la gestione clinica.
Introduction
Il cancro della vescica è il tumore del tratto urinario più diffuso e il decimo tumore maligno umano più comune in tutto il mondo1. Comprende uno spettro geneticamente diversificato e fenotipicamente complesso della malattia2. Le forme uroteliali non muscolo-invasive di cancro della vescica (NMIBC) sono le diagnosi più comuni di cancro alla vescica (70%-80%), e questi tumori mostrano una notevole eterogeneità biologica e risultati clinici variabili 2,3,4. I pazienti con NMIBC in genere sperimentano un alto rischio di recidiva della malattia (50-70%) e un terzo dei tumori progredirà e si svilupperà in un cancro della vescica muscolo-invasivo significativamente più aggressivo (MIBC)2. Sebbene i tassi di sopravvivenza a 5 anni per NMIBC siano elevati (>90%), questi pazienti devono sottoporsi a gestione clinica a lungo termine5. D'altra parte, la MIBC localmente avanzata (non resecabile) o metastatica è generalmente considerata incurabile6. Di conseguenza, il cancro alla vescica ha uno dei più alti costi di trattamento a vita nell'ambito della cura del cancro ed è un onere significativo sia per l'individuo che per il sistema sanitario 3,7. Le aberrazioni genetiche sottostanti nella malattia avanzata rendono la gestione terapeutica del cancro della vescica una sfida clinica e le opzioni terapeutiche per i tumori uroteliali invasivi sono migliorate solo di recente dall'approvazione delle immunoterapie sia per NMIBC 8,9 avanzato che ad alto rischio. Attualmente, il processo decisionale clinico è stato guidato da caratteristiche cliniche e istopatologiche convenzionali, nonostante i singoli tumori del cancro della vescica mostrino grandi differenze nell'aggressività della malattia e nella risposta alla terapia10. C'è un urgente bisogno di accelerare la ricerca di modelli clinicamente utili per migliorare la previsione della prognosi dei singoli pazienti e l'identificazione di trattamenti efficaci.
Gli organoidi tridimensionali (3D) mostrano un grande potenziale come modelli tumorali grazie alla loro capacità di auto-organizzarsi e ricapitolare l'architettura intrinseca in vivo e il profilo farmacogenomico del tumore originale e la loro capacità di rispecchiare la funzionalità cellulare nativa del tessuto originale da cui sono stati derivati 11,12,13 . Sebbene le linee cellulari consolidate del cancro della vescica siano prontamente disponibili, relativamente convenienti, scalabili e semplici da manipolare, le linee cellulari in vitro in gran parte non riescono a imitare lo spettro di diverse alterazioni genetiche ed epigenetiche osservate nei tumori clinici della vescica12,14 e sono state tutte stabilite e mantenute in condizioni di coltura aderenti 2D. Inoltre, le linee cellulari derivate da tumori della vescica primari e metastatici ospitano una significativa divergenza genetica dal materiale tumorale originale. 8,15.
Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare modelli murini geneticamente modificati e indotti da agenti cancerogeni. Tuttavia, mentre questi modelli ricapitolano alcune delle cascate oncogeniche naturali coinvolte nella neoplasia umana (esaminate nei riferimenti 16,17,18), mancano di eterogeneità tumorale, sono costose, rappresentano scarsamente il cancro della vescica invasivo e metastatico e non sono praticabili per test farmacologici a breve termine poiché i tumori possono richiedere molti mesi per sviluppare14,19 . I modelli di cancro derivati dal paziente (inclusi organoidi, colture cellulari primarie riprogrammate condizionatamente e xenotrapianti) offrono preziose opportunità per comprendere gli effetti del trattamento farmacologico prima del trattamento clinico20. Nonostante ciò, pochi gruppi utilizzano abitualmente questi modelli prossimali del paziente a causa dell'accesso limitato al tessuto fresco del paziente primario e dell'ampia ottimizzazione necessaria per generare in modo riproducibile condizioni di coltura organoide (DOP) derivate dal paziente. In un ambiente in vivo, le cellule oncogeniche possono interagire e comunicare con varie composizioni dei costituenti circostanti, tra cui cellule stromali, cellule immunitarie infiltranti nei tessuti e matrice12. Allo stesso modo, per le DOP coltivate in formato 3D, la complessità cellulare / matrice può essere personalizzata per includere altri componenti rilevanti. Le DOP possono essere generate rapidamente e spesso possono essere passate estensivamente o crioconservate per un uso successivo, nonostante abbiano una durata di vita finita 21,22,23. La farmacodinamica (cioè la risposta a un farmaco) può essere valutata utilizzando letture multiple, tra cui la vitalità e la morfologia organoide e la caratterizzazione di bersagli immunoistochimici o cambiamenti trascrizionali.
Qui, vengono descritte le procedure per la creazione di organoidi del cancro della vescica dal materiale del paziente raccolto dalla resezione transuretrale del tumore della vescica (TURBT) o dalla rimozione chirurgica della vescica (cistectomia radicale). Viene illustrato il metodo per generare DOP, utilizzando materiali e strumenti di laboratorio umidi prontamente disponibili. Gli endpoint includono cambiamenti nelle caratteristiche morfologiche e nella vitalità delle cellule. Questi sono stati misurati utilizzando microscopia a fluorescenza, saggi di vitalità in vitro (integrità metabolica e della membrana cellulare) e analisi istopatologica. La Figura 1 mostra il flusso di lavoro per stabilire le DOP del cancro della vescica umana da materiale clinico ottenuto durante la chirurgia elettiva.
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Protocol
I pazienti hanno acconsentito a questo studio dopo la loro ammissione sotto il team di Urologia presso il Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australia. Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e all'interno delle linee guida etiche e istituzionali (numero etico HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
NOTA: Come criteri di ammissibilità, i pazienti avevano ≥ 18 anni con cancro e in grado di comprendere e fornire il consenso. Sono stati esclusi coloro che non sono stati in grado di dare il consenso informato. Coloro che avevano una lingua principale diversa dall'inglese sono stati esclusi in quanto la fornitura di interpreti non era possibile a causa di considerazioni logistiche e di bilancio. Sono stati esclusi anche i pazienti i cui tumori non erano accessibili alla biopsia o che era improbabile che fossero disponibili in quantità adeguata dopo la patologia di routine.
1. Preparazione del mezzo organoide
NOTA: il mezzo organoide per il cancro della vescica umana richiede fattori di crescita che aiutano nella sopravvivenza, nella crescita e nella continua espansione degli organoidi derivati da materiale clinico dissociato (Tabella 1). Per i dettagli completi di ciascun supplemento utilizzato in questa procedura, fare riferimento alla Tabella dei materiali.
- Scongelare gli ingredienti congelati su ghiaccio o in frigorifero a 2-8 °C. Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento e lavorare da aliquote congelate (conservate a -20 °C).
- Mezzo basale: Preparare il mezzo basale integrando l'avanzato Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (adDMEM/F12) con HEPES (10 mM) e glutammina (2 mM). Questo è anche usato come mezzo di trasporto e durante le fasi di lavaggio degli organoidi.
NOTA: Advanced DMEM/F-12 è usato come mezzo basale per aiutare nell'espansione degli organoidi in presenza di siero limitato; tuttavia, richiede l'integrazione con HEPES e L-glutammina. - Centrifugare brevemente il fattore di crescita dei fibroblasti 10 (FGF-10), il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF-2), il fattore di crescita epiteliale (EGF), SB202190, la prostaglandina E2 (PGE2) e A 83-01 prima dell'apertura per garantire che i componenti siano nella parte inferiore della fiala.
- Mezzo organoide completo: Mezzo basale supplementare con noggin- e R-spondin 1-condizionati umani ad una concentrazione finale del 5% v/v, EGF umano (50 ng/mL), FGF-2 umano (5 ng/mL), FGF-10 umano (20 ng/mL), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nicotinamide (10 mM), N-acetilcisteina (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) e una formazione antibiotica ad ampio spettro alla concentrazione indicata dal produttore.
- Conservare i mezzi organoidi a 4 °C al buio e utilizzarli entro 2 settimane (1 mese al massimo). Non congelare. Evitare un'esposizione prolungata a fonti di luce.
NOTA: Il mezzo organoide è preparato senza siero; tuttavia, siero e penicillina / streptomicina potrebbero essere integrati su base user-to-user come richiesto.
2. Un giorno prima della procedura descritta in 3
- Membrana basale ridotta con fattore di crescita di scongelamento (BME; vedi Tabella dei materiali) durante la notte per almeno 12 ore prima dell'uso in frigorifero o cella frigorifera a 4 °C. Se necessario, erogare BME in aliquote da 1 mL in un tubo monouso in polipropilene da 1,5 mL per evitare cicli di congelamento-disgelo.
- Posizionare le punte delle pipette filtrate in un frigorifero a 4 °C o in una cella frigorifera.
NOTA: questa sezione si riferisce alle punte delle pipette che verranno utilizzate durante la manipolazione del BME per prevenire la polimerizzazione prematura e ridurre il rivestimento del BME sulla superficie delle punte. - Sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche necessarie per la procedura.
3. Generazione di organoidi tumorali della vescica
NOTA: Questo è un primo passo per l'istituzione di DOP da tumori primari del paziente. Questa procedura è adattata per i tessuti del cancro della vescica dai metodi stabiliti da Gao et al.24.
- Utilizzare una cappa a rischio biologico di classe II per preparare il campione. Recuperare il ghiaccio secco e bagnato e stampare il foglio di elaborazione del campione del paziente (file supplementare).
- Chiamare il personale di ricerca in sala operatoria quando la resezione chirurgica è quasi completa.
NOTA: Verificare che il paziente soddisfi i criteri di idoneità e abbia firmato il modulo di consenso del partecipante. Il tessuto è fornito per la ricerca solo se eccedente rispetto ai requisiti per la valutazione istopatologica clinica. - Raccogliere un nuovo campione di tumore macroscopicamente vitale dalla chirurgia. Assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo di trasporto (1x adDMEM/F12 o 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)) in un tubo conico sterile da 50 ml o in un barattolo di campione di urina durante il transito.
NOTA: In alcuni centri clinici, potrebbe essere necessario trasportare il tessuto in un laboratorio di patologia per essere assegnato alla ricerca. In queste circostanze, si raccomanda di aggiungere antibiotici e antimicotici al mezzo di trasporto. Il tessuto può essere conservato a 4 °C in mezzo basale per un massimo di 24 ore dopo l'intervento chirurgico e generare comunque colture organoidi vitali. - Registrare i dettagli del campione, incluso il peso del tessuto (g o mg), la descrizione del campione e i dettagli relativi a qualsiasi campione di sangue e urina sul foglio di elaborazione del campione del paziente (file supplementare).
- Rimuovere con attenzione il mezzo di trasporto e sostituirlo con 10 ml di mezzi basali. Lasciare che il tessuto tumorale si depositi per gravità.
NOTA: il mezzo di trasporto è considerato un rifiuto clinico e deve essere raccolto in un contenitore per rifiuti opportunamente etichettato in una quantità appropriata di soluzione di decontaminazione. Una volta che il liquido è stato decontaminato chimicamente, può essere smaltito secondo le linee guida istituzionali per i rifiuti pericolosi. - Rimuovere il tessuto tumorale con una pinza e metterlo in una capsula di Petri sterile da 90 mm (Figura 2A). Registrare il peso del tessuto in mg o g sul foglio di elaborazione del campione clinico e sulla griglia di dissezione (Figura 2B).
- Rimuovere il tessuto non canceroso (compreso il tessuto adiposo) e le regioni necrotiche macroscopicamente visibili utilizzando pinze sterili e lama monouso del bisturi montata sul manico del bisturi (Figura 2C). Lavare i pezzi tumorali 1-2 volte con 1x DPBS freddo. Raccogliere i pezzi tumorali e trasferirli in una nuova capsula di Petri sterile da 90 mm.
NOTA: poiché le lame del bisturi sono affilate, prestare attenzione quando si affetta manualmente. Il tessuto adiposo adiacente al tumore può essere identificato da aree distintamente morbide, gelatinose e pallide immediatamente adiacenti al perimetro visivo del tumore. Il tessuto adiposo macroscopico e le regioni focalmente scure che rappresentano aree di necrosi richiederanno un giudizio personale durante la dissezione da una biopsia tumorale della vescica escissionale. - Scatta una fotografia, disegna un diagramma del tessuto e pianifica la dissezione del tessuto su una griglia di elaborazione clinica (Figura 2B e Figura 2C).
NOTA: È importante tenere una registrazione visiva e uno schizzo approssimativo delle singole caratteristiche macroscopiche del tumore e della dissezione per ciascun caso specifico. - Sezionare pezzi di tessuto tumorale e allocare per analisi istopatologiche (Figura 2D) e molecolari (Figura 2E).
- Per le analisi istologiche: posizionare circa 50 mg di tessuto tumorale in una cassetta di istologia plastica monouso etichettata (Figura 2D). Immergere la cassetta istologica in un contenitore con un volume da 5 a 10 volte superiore al 10% di formalina tamponata neutra (NBF). Incubare durante la notte a RT.
- Rimuovere il 10% di NBF e sostituirlo con il 70% (p/p) di etanolo il giorno successivo per la conservazione a 4 °C fino a quando il tessuto non può essere lavorato utilizzando il protocollo di lavorazione dei tessuti di routine
- Per le analisi molecolari: congelare a scatto almeno un pezzo tumorale da1-3 mm 3 in una crioviale da 1,5 mL priva di RNasi/DNasi utilizzando azoto liquido e conservare a -80 °C (Figura 2E).
- Erogare 5 mL di mezzo organoide (Tabella 1) nella capsula di Petri da 90 mm contenente il/i pezzo/i tumorale/i rimanente/i.
- Tritare meccanicamente il tessuto nel modo più fine possibile (0,5-1 mm3 pezzi o più piccolo) con una lama sterile #10 per bisturi.
NOTA: Frammenti più grandi o interi pezzi di tessuto (>3 mm3) impiegheranno molto più tempo a digerire e diminuiranno la vitalità del campione. Omettere il passaggio precedente se il tessuto è disaggregato e i frammenti sono abbastanza piccoli da pipettare con una punta sierologica da 5 ml. - Trasferire il tessuto finemente tritato in un tubo conico da 50 mL e aggiungere 4 mL di mezzo organoide, 1 mL di collagenasi/ialuronidasi 10x e 0,1 mg/mL di desossiribonucleasi 1 (DNasi 1) per evitare l'aggregazione cellulare.
NOTA: La soluzione enzimatica deve essere preparata ogni volta al momento. Aumentare il volume del mezzo per essere circa 10 volte la quantità visibile dei frammenti tumorali per campioni di grandi dimensioni. - Incubare il tessuto tumorale tritato e la soluzione enzimatica per 1-2 ore su uno shaker o rotatore orbitale (150 rpm) in un incubatore (37 °C, 5% CO2) per dissociare i frammenti in una sospensione cellulare e abbattere i collageni. Questo può essere verificato con analisi istologiche (Figura 3A).
NOTA: Se la quantità di tessuto è grande o non si osserva alcuna dissociazione evidente dopo 1-1,5 ore, aumentare il tempo di incubazione controllando il livello di dissociazione ogni 30 minuti. I tempi per questo passaggio dipendono dal campione e devono essere determinati empiricamente ogni volta. Una soluzione notevolmente più chiara con frammenti di tessuto indistinguibili all'occhio (o pochissimi frammenti) indica una digestione riuscita. - Terminare la digestione con l'aggiunta di 2x volume (20 ml) di mezzo basale al campione.
- Centrifugare il campione a 261 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT), aspirare ed eliminare il surnatante.
- Per lisare i globuli rossi contaminanti (RBC), risospessare il pellet ottenuto dalla fase precedente in 5 ml di tampone ammonio-cloruro-potassio (ACK). Incubare il tubo a RT per 3 minuti o fino a quando non si vede la completa lisi dei globuli rossi (la sospensione diventa chiara).
NOTA: se i globuli rossi non sono osservati come un piccolo grumo rosso nel pellet, questo passaggio può essere omesso. - Aggiungere 20 ml di mezzo basale nel tubo. Centrifugare il tubo a 261 x g per 5 minuti a RT e aspirare il surnatante.
- In questa fase, posizionare un'aliquota di 10 ml di 2x e 1x mezzo organoide in un bagno d'acqua a 37 °C per riscaldare.
- Filtrare il campione attraverso un filtro pre-bagnato reversibile da 100 μm in un nuovo tubo da 50 ml per rimuovere il materiale insolubile di grandi dimensioni.
NOTA: Il grande materiale non digerito (>100 μm) raccolto dal filtro può contenere cellule di interesse e può essere coltivato in una capsula di Petri da 90 mm o in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti in mezzo organoide per derivare colture 2D (Figura 1 (fase 5) e Figura 3B). - Filtrare l'eluato attraverso un filtro pre-umido reversibile da 37 μm per raccogliere singole cellule e piccoli cluster per l'isolamento di singole cellule e cellule immunitarie (Tubo 37-1; Figura 1 (fase 6) e Figura 3B).
NOTA: La resa delle cellule tumorali durante questa fase può essere aumentata facendo passare nuovamente la sospensione cellulare filtrata attraverso il colino. - Invertire il filtro da 37 μm e utilizzare 10 mL di mezzi basali per raccogliere grappoli di piccole e moderate dimensioni (37-100 μm) (tubo 70-1; Figura 3B).
- Ricaricare ciascuno dei nuovi tubi da 50 mL (tubi 70-1 e 37-1) con DPBS a 40 mL. Centrifugare la sospensione a 261 x g per 5 min a RT. Aspirare ed scartare il surnatante.
- Aggiungere 10 ml di mezzi basali al tubo 37-1 e contare le cellule utilizzando il colorante di esclusione blu tripano e un contatore cellulare automatizzato (secondo le specifiche del produttore). Determinare il numero di cellule e la vitalità delle cellule.
- Centrifugare il resto del campione a 261 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il mezzo e sostituirlo con una soluzione di congelamento cellulare o un mezzo basale contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina/streptomicina e il 10% di dimetilsolfossido (DMSO).
- Posizionare i campioni in crioviali da 1,5 ml e conservarli in un contenitore di congelamento cellulare. Trasferire immediatamente il contenitore in un congelatore a -80 °C per una velocità di raffreddamento ottimale. Dopo la conservazione notturna in congelatore a -80 °C, trasferire i crioviali in liquido criogenico o in fase aria (-196 °C) per la conservazione a lungo termine.
- Cellule risospese dal tubo 70-1 con 500 μL di mezzo organoide 2x preriscaldato.
NOTA: la densità di semina deve essere elevata per una propagazione organoide di successo. Il volume del mezzo organoide e, successivamente, del BME deve essere modificato empiricamente sul numero di cellule isolate dalla fase di filtrazione. Questo passaggio fornisce un punto di partenza rilevante basato su studi nel nostro laboratorio. - Aggiungere BME alle cellule (con un rapporto 1:1 con 2x mezzo organoide) con punte di pipetta filtrante sterile P1000 ghiacciate e mescolare delicatamente per sospendere le cellule. Pipettare rapidamente e con attenzione 100 μL di cellule ricostituite / miscela BME a pozzetti di una piastra a fondo piatto a fondo piatto a 96 pozzetti di attacco ultra-basso. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore (37 °C, 5% CO2) per 20-30 minuti per solidificare.
- Aggiungere il rapporto 1:2 di 1x mezzo organoide sopra la sospensione cellulare BME a seconda del volume valutato empiricamente. Nel punto di partenza pertinente, aggiungere 50 μL di 1x mezzo organoide oltre a 100 μL di cellule ricostituite/ miscela BME.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per 20 minuti per equilibrare.
- Estrarre la piastra di coltura cellulare dall'incubatore e assemblarla su un portacampioni sul palco di un microscopio. Valutare visivamente gli organoidi in condizioni di contrasto di fase o di campo luminoso.
NOTA: le immagini vengono acquisite al meglio da un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di ottica a interferenza differenziale (DIC), fotocamera digitale e software associato per osservare la formazione di DOP sferici in preparazione per l'analisi degli endpoint.- Se sono visibili cluster distinti, posizionare la piastra di coltura cellulare in una camera di microscopio riscaldata elettronicamente sul palco (37 ° C, 5% CO2) per l'imaging di cellule vive nelle prime 24-72 ore.
- Assicurarsi che il collare riscaldato flessibile sia fissato alla lente per ridurre la deriva termica e che l'umidificatore sia riempito con dH2O.
- Eseguire l'imaging iniziale utilizzando un obiettivo 4x o 10x (N.A. 0,30, W.D. 15,2 mm). Time-lapse ogni 5-10 minuti con l'impostazione del contrasto di fase.
- Verificare il successo dell'isolamento caratterizzato dalla comparsa di organoidi auto-organizzanti >10 per pozzetto dopo un periodo di 24-72 ore.
- Consentire alle colture di continuare per un massimo di due settimane se il numero di organoidi è basso (Figura 3C).
- Ricaricare il mezzo ogni 2-3 giorni utilizzando 50 μL di mezzo organoide preriscaldato per reintegrare i fattori di crescita esauriti e il volume complessivo.
- Acquisire immagini (come descritto nel passaggio 3.30) nei giorni 1, 2 e 3 (serie time-lapse) e nei giorni 5, 7 e 10 prima del passaggio (se applicabile).
NOTA: Gli organoidi (osservati come strutture generalmente rotonde in cui non è possibile vedere i bordi delle singole cellule) sono in genere passati 7-10 giorni dopo l'installazione, a seconda del successo dell'isolamento. Prima o dopo il passaggio, gli organoidi possono essere trattati con citotossici o agenti terapeutici per un massimo di 6 giorni e la risposta al farmaco misurata utilizzando saggi di vitalità cellulare e citotossicità. In alternativa, gli organoidi possono essere recuperati da BME (utilizzando 1 mg / mL dispasi) e crioconservati (bio banked), preparati per test molecolari o incorporati e valutati istologicamente (Figura 4).
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Representative Results
Gli organoidi 3D sono stati stabiliti con successo dai tessuti TURBT e cistectomia del paziente con cancro alla vescica umana. In breve, questa tecnica evidenzia una rapida formazione di strutture multicellulari 3D che sono sia vitali che adatte per altre analisi endpoint come la valutazione istologica, la caratterizzazione molecolare (mediante immunoistochimica o PCR quantitativa in tempo reale) e lo screening farmacologico. Durante la procedura (Figura 1), i vari eluiti durante le nostre fasi di filtrazione (Figura 1, passaggi 1-6) potrebbero essere sfruttati per crioconservare singole cellule per l'isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore (TIL) e la generazione di una singola biobanca cellulare. La procedura consente di biobanked di più aspetti di un tumore primario eterogeneo in modo appropriato e in un modo che può essere monitorato tra i pazienti (Figura 2A, B), compresa l'istologia (Figura 2C, D) e i campioni freschi congelati (Figura 2E).
Una digestione di 2 ore con collagenasi/ialuronidasi e DNasi 1 disponibili in commercio consente una digestione sufficiente di 0,5-1 mm3 pezzi del tessuto bioptico della cistectomia più complesso, comprese le cellule neoplastiche all'interno della lamina propria e gli strati muscolari della vescica (Figura 3A). Frammenti post-digestione più grandi (>100 micron) si sono dimostrati adatti per la coltura in piastre di coltura tissutale standard di qualsiasi dimensione per l'isolamento di nuove colture 2D (Figura 3B). Tuttavia, è necessaria un'ampia caratterizzazione molecolare per convalidare l'origine del cancro di tali linee cellulari. Gli organoidi che vengono generati con successo con questo protocollo subiscono processi di auto-assemblaggio dinamico, comprese le fasi di aggregazione, compattazione e formazione finale, per cui si formano in strutture cellulari strette (Figura 3C) che possono essere valutate per la risposta alle terapie standard-of-care. La Figura 3C evidenzia le efficienti proprietà di autoassemblaggio degli organoidi. Istologicamente, queste strutture ricapitolano il tumore originale del paziente (Figura 4). Gli organoidi generati in questa procedura sono adatti per una moltitudine di scopi, tra cui un'ulteriore caratterizzazione, biobanking e test di efficacia dei farmaci (Figura 5).
Figura 1: Rappresentazione schematica della coltura del tessuto organoide dalla raccolta di campioni tumorali dall'intervento chirurgico alle analisi degli endpoint. URN, numero di registrazione dell'unità; TIL, Linfocita infiltrante il tumore. (1) Il tessuto viene tritato meccanicamente in una capsula di Petri da 90 mm il più finemente possibile con una lama sterile per bisturi (0,5-1 mm3 pezzi). (2) I pezzi tumorali sono risospesi in un mezzo di dissociazione enzimatico costituito dal mezzo organoide, collagenasi / ialuronidasi e DNasi 1. (3) Il tessuto tumorale tritato e la soluzione enzimatica vengono incubati per 1-2 ore su un incubatore rotatore (150 giri/min, 37 °C, 5% CO2) e successivamente pellettizzati (4) per dissociare i frammenti in una sospensione cellulare più fine. Il campione viene sottoposto a filtrazione attraverso filtri reversibili pre-umidi (5) 100 μm e (6) 37 μm in nuovi tubi da 50 ml per rimuovere materiale insolubile di grandi dimensioni e isolare cluster da 37-100 μm. Dopo (7) centrifugazione della frazione isolata dall'inverso del filtro da 37 μm, i cluster cellulari sono sospesi in (8) BME e mezzi organoidi prima di (9) imaging a cellule vive. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Manipolazione del tessuto tumorale sterile per lo stabilimento di organoidi. (A) Dopo l'escissione e il trasporto in laboratorio, il campione viene posto in una capsula di Petri sterile, pesato e successivamente sezionato. (B) Una griglia di dissezione del campione viene utilizzata per contrassegnare il campione per vari processi. Un esempio di dissezione è mostrato in (C) dove i campioni vengono prelevati dalla periferia tumorale il più possibile per evitare aree di necrosi centrale e annotate (inset) prima (D) incassare il tessuto prima della fissazione del tessuto. Barra scala: 6 mm. Barra della scala inserita: 4 mm. (E) Piccoli frammenti freschi vengono prelevati per il successivo congelamento e biobanking. Barra scala: 5 mm. Elementi di questa immagine sono stati creati con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Derivazione enzimatica e assemblaggio dinamico di organoidi tumorali della vescica. (A) Immagini rappresentative di tessuto di carcinoma della vescica parentale colorato con ematossilina ed eosina (H&E) (patologia rivista come T3bN0) a fissazione immediata (a sinistra) e 2 ore di post-digestione con 1x collagenasi/ialuronidasi (destra). Barra di scala: 500 μm. Barra della scala inserita: 50 μm. (B) Immagini rappresentative degli isolamenti >100 μm, 37-1 e 70-1 (giorno 2). Le barre di scala sono indicate all'interno dell'immagine. (C) Le immagini rappresentative sono mostrate per l'isolamento organoide del cancro della vescica oltre 48 ore e la colorazione H&E organoide del giorno 7. Barra scala: 50 μm. Barra di scala per l'immagine nell'inserto: 20 μm. DIC: contrasto di interferenza differenziale. Gli elementi di questa immagine sono stati creati con BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Le colture organoidiche derivate dal cancro della vescica mantengono l'architettura istologica dei tumori parentali. Immagine H&E rappresentativa del carcinoma della vescica di basso grado (Ta) e corrispondente immagine in campo luminoso dell'organoide al giorno 7 della coltura. Il pannello all'estrema destra mostra la colorazione H&E associata dell'organoide del giorno 7. Le barre di scala sono indicate nella figura. LG: basso grado, BC: cancro alla vescica, H & E: ematossilina ed eosina e DIC: contrasto di interferenza differenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Applicazioni a valle con organoidi derivati da pazienti affetti da cancro alla vescica. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Additivo | Finale Conc. | Stock Conc. | Solvente | |
| Media basali | Glutamax | 2 mM | 1 M | NaCl |
| HEPES · | 10 mM | 1 M | NaCl/NaHPO4 soluzione tamponata | |
| Supplementi per supporti completi | R-spondin 1 mezzi condizionati | 5% v/v | Supporti condizionati | DMEM/F-12 avanzato |
| Noggin media condizionati | 5% v/v | Supporti condizionati | DMEM/F-12 avanzato | |
| FEG | 50 ng/ml | 0,5 mg/mL | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-10 · | 20 ng/ml | 100 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-2 · | 5 ng/ml | 50 μg/mL | PBS/0,1% BSA | |
| Nicotinammide | 10 mM | 1 M | 1 g in 8,2 mL ddH20 | |
| N-acetil-L-cisteina | 1,25 mM | 500 mM | 40 mL ddH20 | |
| A 83-01 | 0,5 μM | 50 metri quadrati | DMSO | |
| SB202190 · | 10 μM | 50 metri quadrati | DMSO | |
| Y27632 · | 10 μM | 100 metri | ddH20 | |
| Additivo B-27 | 1X | 50 volte | ||
| Prostaglandina E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocin · | 100 μg/ml | 50mg/mL | ||
Tabella 1: Integratori utilizzati per mezzi organoidi basali e completi
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Discussion
Mentre i protocolli organoidi 3D derivati dal tessuto del cancro della vescica sono ancora nella loro infanzia, sono un'area di ricerca attiva e indagine clinica. Qui, viene dettagliato un protocollo ottimizzato per stabilire con successo le DOP del cancro della vescica adatte sia per i campioni NMIBC che MIBC. Questo flusso di lavoro si integra parallelamente negli studi clinici ospedalieri e considera l'accumulo di campioni di biobanche, tra cui l'elaborazione dei campioni istologici e la banca dei tessuti freschi congelati, che è una considerazione importante per le pipeline di organoidi clinici. Questo protocollo si basa su metodi esistenti e fornisce una metodologia consolidata per costruire una pipeline di medicina di precisione organoide.
L'attuale tasso di successo di questo protocollo - come altri - è di circa il 70%25. Si prevede che questo migliorerà man mano che le tecniche di isolamento e la caratterizzazione del microambiente tumorale del cancro alla vescica si evolveranno. Come previsto, la qualità del campione iniziale influenza il tasso di successo ed è un importante passo limitante. I campioni ottenuti da pazienti naïve alla chemioterapia forniscono il più alto tasso di successo, mentre quelli provenienti da pazienti che hanno ricevuto la chemioterapia neoadiuvante possono avere un numero ridotto di cellule vitali26,27. Tipicamente, i campioni di cancro della vescica (sia da TURBT che da cistectomie) forniscono un'ampia quantità di campioni con elevata cellularità tumorale. Ciò consente una robusta generazione di organoidi compresi tra 30-100 μm entro un periodo di crescita di 24-72 ore (dato che alcuni cluster <40 μm vengono trattenuti nelle fasi di filtrazione). È importante sottolineare che l'eterogeneità osservata nei campioni organoidi (cioè formazioni cistiche e strutture più dense) indica che questo protocollo fornisce condizioni adatte a derivare popolazioni eterogenee di cellule tumorali.
Il nostro protocollo ottimizzato può essere eseguito su materiale di partenza limitato (come nel caso di alcuni interventi chirurgici elettivi, comprese le procedure TURBT o campioni acquisiti da pazienti in uno studio clinico), consentendo l'incorporazione di analisi multiple per massimizzare il valore del campione. Questo protocollo include metodi per descrivere i passaggi per far crescere la coltura 2D da cellule tumorali estranee di interesse che possono risiedere in grandi tessuti insolubili elaborati durante la fase iniziale di filtrazione. Come altri gruppi di ricerca che suggeriscono di elaborare i campioni entro 24 ore dopo l'intervento chirurgico 28,29, si osserva che l'ipossia tissutale che si verifica entro questo lasso di tempo non preclude la generazione di organoidi vitali. L'ottimizzazione è necessaria per determinare la densità di seeding delle cellule (cluster nativi) per pozzetto. Nella nostra esperienza, un numero eccessivo di cluster può causare una scarsa crescita delle colture, mentre le colture a bassa densità visiva possono portare alla morte cellulare. Questo può essere determinato dall'utente empiricamente nel contesto dei loro volumi che possono essere diluiti all'interno di un intervallo se necessario. Inoltre, i campioni TURBT spesso contengono bordi bruciati a causa del processo di resezione, che sono evidenti come regioni necrotiche prominenti. Un passo critico è l'attento isolamento del tessuto tumorale macroscopico e la successiva dissezione. Questo è fondamentale per derivare colture vitali e deve essere comunicato con il team chirurgico. In alcuni casi, questa potrebbe essere una limitazione iniziale alla procedura.
Un'ulteriore limitazione alla tecnica attuale è l'assenza del microambiente tumorale parallelo agli organoidi. Uno sviluppo necessario saranno i futuri sistemi di co-coltura per aumentare la complessità cellulare e fornire altri componenti del microambiente tumorale (cioè stroma e cellule immunitarie). Poiché gli organoidi sono definiti come strutture auto-organizzanti con la capacità di auto-perpetuare la loro crescita, sarà necessario un ulteriore lavoro per chiarire le cellule staminali tumorali discrete (come CD44 e CD49) che possono consentire migliori caratteristiche di crescita in vitro 31,32,33. Stabilire con certezza che le DOP provengano dal tessuto tumorale è fondamentale, in quanto il contributo delle cellule uroteliali normali nelle analisi funzionali e molecolari confonderà le indagini sulla resistenza ai farmaci. A volte l'origine tumorale delle cellule uroteliali nelle DOP è chiara a causa dell'uso di tessuto metastatico o tumori papillari (come nel caso qui; vedi Figura 4), ma quando il tessuto sorgente viene asportato dalla mucosa della vescica e quindi contiene margini dell'urotelio benigno, è fondamentale confermare che le DOP risultanti sono composte da cellule tumorali utilizzando tecniche molecolari. Pertanto, sono necessari confronti immunoistochimici e genomici tra gli organoidi stabiliti e il tumore primario da cui sono stati derivati30.
Per quanto riguarda il numero e le distribuzioni dimensionali degli organoidi per pozzetto, è difficile mantenere una densità di placcatura uniforme degli organoidi 3D per l'analisi di citotossicità. Questo è leggermente mitigato isolando intervalli definiti usando i filtri, ma è ancora una limitazione se piccoli cluster e organoidi più grandi sono isolati nello stesso pozzo. Le grandi selezionatrici di particelle possono mitigare questo problema, ma non sono ampiamente disponibili nei laboratori di ricerca medica. Tuttavia, le tecniche che misurano i segnali di vitalità prima e dopo il trattamento sono state utilizzate con successo negli organoidi del cancro della vescica34. Con l'avanzare di questa tecnologia, ciò consentirà ai ricercatori di sviluppare una libreria di DOP per il cancro della vescica con diversi profili genomici e risposte farmacodinamiche che possono essere esplorate per studiare nuove terapie. Inoltre, la procedura di raccolta dei campioni e il metodo di dissociazione qui descritti consentono preparazioni simultanee per la profilazione spaziale del tumore, la citometria a flusso multiparametrica e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Nel complesso, ciò consente una vasta gamma di endpoint potenti che possono essere riuniti per esplorare l'eterogeneità tumorale di un paziente e l'applicabilità di farmaci come le immunoterapie.
In sintesi, descriviamo un protocollo per stabilire e valutare colture di organoidi 3D derivati dal cancro della vescica nell'avvento degli endpoint della medicina di precisione. È importante notare che i passaggi e le note qui descritti sono approcci di routine utilizzati per isolare le DOP del cancro alla vescica nel nostro laboratorio. Il terreno di coltura utilizzato nella nostra procedura è stato originariamente descritto per le cellule tumorali della prostata e ora ha dimostrato di essere adatto per la coltura del cancro della vescica. È importante sottolineare che questo protocollo è centralizzato, adatto per l'uso di routine nei laboratori e ampiamente applicabile in tutti i tipi di cancro urologico. In combinazione con la fenotipizzazione molecolare ad alta fedeltà e gli endpoint di risposta ai farmaci, questa tecnica fornirà uno strumento utile per esplorare rapidamente la precisa gestione terapeutica dei pazienti con cancro alla vescica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Riconosciamo l'assistenza tecnica del nucleo di istologia dell'Istituto di ricerca traslazionale e della struttura delle risorse biologiche. Questa ricerca è stata sostenuta dal finanziamento di un premio della Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) e del Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalizised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Il Translational Research Institute riceve il sostegno del governo australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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