Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Abstract

Ubiquitinatie is een soort posttranslationele modificatie die niet alleen de stabiliteit reguleert, maar ook de lokalisatie en functie van een substraateiwit. Het ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert bijna alle basale cellulaire biologische processen. Zuivering van ubiquitinated eiwitten helpt bij het onderzoek naar de rol van ubiquitinatie bij het beheersen van de functie van substraateiwitten. Hier wordt een stapsgewijze procedure beschreven om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren met het p53 tumorsuppressorgeiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd onder strenge niet-denaturerende en denaturerende omstandigheden. Totaal cellulair Flag-tagged p53-eiwit werd gezuiverd met anti-Flag antilichaam-geconjugeerde agarose onder niet-denaturerende omstandigheden. Als alternatief werd het totale cellulaire His-tagged ubiquitinated eiwit gezuiverd met behulp van nikkel-geladen hars onder denatureringsomstandigheden. Ubiquitinated p53-eiwitten in de eluaten werden met succes gedetecteerd met specifieke antilichamen. Met behulp van deze procedure kunnen de alomtegenwoordige vormen van een bepaald eiwit efficiënt worden gezuiverd uit zoogdiercellen, waardoor studies naar de rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de eiwitfunctie worden vergemakkelijkt.

Introduction

Ubiquitine is een evolutionair geconserveerd eiwit van 76 aminozuren 1,2,3. Ubiquitine bindt covalent lysineresiduen op doeleiwitten door middel van cascades met activerende (E1), conjugaterende (E2) en ligase (E3) enzymen. Ubiquitine wordt eerst geactiveerd door het E1-enzym en wordt vervolgens overgebracht naar de E2-conjugaterende enzymen. Vervolgens interageren E3-ubiquitine-ligases met zowel ubiquitine-geladen E2-enzymen als substraateiwitten en bemiddelen ze de vorming van een isopeptidebinding tussen de C-terminal van ubiquitine en een lysineresidu in het substraat 1,2,3,4,5. Ubiquitinatie omvat de aanhechting van ubiquitine moieties aan lysineresiduen op substraateiwitten of aan zichzelf, wat leidt tot eiwitmonoubiquitinatie of polyubiquitinatie. Dit ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert een grote verscheidenheid aan biologische processen. Ubiquitinatie resulteert in de afbraak van substraateiwitten via het ubiquitine-proteasoomsysteem 1,2,3,4,5. Bovendien moduleert ubiquitinatie eiwitsubcellulaire lokalisatie, eiwitcomplexvorming en eiwithandel in cellen 3,5. Ubiquitine moieties die aan substraateiwitten zijn toegevoegd, kunnen worden verwijderd door deubiquitinerende enzymen (DUB's)6,7. Met name de verschillende manieren waarop ubiquitineketens worden samengesteld, bieden een groot aantal middelen om verschillende biologische processen te reguleren 1,5. De exacte rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de substraateiwitfunctie blijft tot nu toe onvolledig begrepen. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan de opheldering van de effecten van eiwitubiquitinatie op een verscheidenheid aan cellulaire processen.

Het p53-eiwit is een van de belangrijkste tumorsuppressorgeiwitten en vertoont genetische mutaties of inactivatie bij bijna alle menselijke kankers 8,9,10,11. p53 stabiliteit en activiteit worden in vivo subtiel gereguleerd door posttranslationele modificaties, waaronder ubiquitinatie, fosforylering, acetylering en methylatie12,13. Het p53-eiwit heeft een korte halfwaardetijd variërend van 6 min tot 40 minuten in verschillende cellen, wat voornamelijk het gevolg is van de polyubiquitinatie en daaropvolgende proteasomale afbraak10,12. Muis dubbele minuut 2 (Mdm2) is een E3 ubiquitine ligase van p53 dat bindt aan de N-terminus van p53 om zijn transcriptionele activiteit te remmen 12,14,15. Mdm2 bevordert de polyubiquitinatie en proteasomale afbraak van p53 om de stabiliteit ervan te beheersen en induceert monoubiquitinatie van p53 om de nucleaire export te vergemakkelijken 12,14,15,16. Hier wordt Mdm2-gemedieerde p53-ubiquitinatie als voorbeeld gebruikt om een methode voor de zuivering van ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen in detail te introduceren. De regulatoren die de ubiquitinatiestatus van doeleiwitten beïnvloeden, kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze in vivo ubiquitinatietest wanneer ze overexpressie hebben of worden neergeslagen / uitgeschakeld in zoogdiercellen. Bovendien kunnen ubiquitinated eiwitten worden gebruikt als substraten voor in vitro deubiquitinatietest. Een high-throughput screening kan worden uitgevoerd om specifieke DUB's voor doeleiwitten te identificeren door ubiquitinated substraten te incuberen met individuele DUB's. Ubiquitinated eiwitten kunnen fungeren als een steiger om downstream signaaleiwitten in cellen te rekruteren. Een alomtegenwoordig doeleiwitcomplex kan worden gezuiverd door sequentiële immunoprecipitatie onder inheemse zuiveringsomstandigheden en worden geïdentificeerd door massaspectrometrie. Het huidige protocol kan uitgebreid worden gebruikt om de cellulaire eiwitten te onderzoeken die worden gereguleerd door ubiquitinatie.

Er zijn verschillende methoden vastgesteld om ubiquitinated eiwitten te zuiveren, waaronder het gebruik van affiniteit-tagged ubiquitine, ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde ubiquitine-bindende domeinen (UBD's)17. Hier bieden we een protocol met behulp van affiniteit-gelabeld ubiquitine als een mediator om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine biedt voordelen ten opzichte van de andere methoden. Ubiquitinated eiwitten worden gezuiverd in de aanwezigheid van sterke denaturanten, die niet-specifieke binding aan nikkel-geladen hars verminderen door cellulaire eiwitten te lineariseren en eiwit-eiwitinteracties te verstoren. Daarentegen kan het gebruik van ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde URD's als mediatoren bindende partners niet effectief uitsluiten van doeleiwit omdat zuivering onder minder strenge voorwaarden moet worden uitgevoerd. Bovendien kan zuivering ook leiden tot een verhoogde binding van niet-gerelateerde eiwitten met behulp van deze mediatoren. Bovendien is er een bindende neiging voor verschillende ubiquitine-koppelingstypen en mono- en poly-ubiquitinatie door ubiquitine-bindende eiwitten of geïsoleerde UBD's17. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine draagt bij aan het naar beneden halen van alle cellulaire ubiquitinated eiwitten. Als alternatief maakt het gebruik van in de handel verkrijgbare anti-Flag of anti-HA antilichaam-geconjugeerde agarose het gemakkelijker om grootschalige Flag- of HA-gelabelde doeleiwitten onder niet-condenserende omstandigheden te immunopreciperen. Een tweede zuiveringsstap, bijvoorbeeld door nikkel-geladen hars gericht op poly-His-tagged ubiquitine, kan worden gebruikt om ubiquitinated doeleiwitten met een hoge zuiverheid te verkrijgen voor downstream experimenten. Met name een epitoop tagging zuiveringsstrategie kan worden aangepast wanneer een specifiek antilichaam niet kan worden verkregen om doeleiwitten effectief te immunoprecipitaat. Ten slotte behoudt de zuivering van ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen, in vergelijking met zuivering in vitro, de ubiquitine-koppelingsmodus van doeleiwitten onder meer fysiologische omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: H1299-cellen werden vriendelijk verstrekt door de Stamcelbank, Chinese Academie van Wetenschappen en bleken negatief te zijn voor mycoplasmabesmetting.

1. Celkweek

  1. Plaats voor de initiële cultuur 1 x 106 cellen van menselijke longadenocarcinoomcellijn, H1299 in een petrischaaltje van 10 cm met 10-12 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% glutamineadditief, 1% natriumpyruvaat en antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine). Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Splits de cellen elke 2-3 dagen, afhankelijk van wanneer ze 80% -90% samenvloeiing bereiken.
  2. Bereid een dag voor de transfectie 6-9 x 106 cellen voor drie petrischalen en plaat 2-3 x 106 cellen in een enkele petrischaal van 10 cm met 10-12 ml medium om een samenvloeiing van 70% -90% tijdens transfectie te bereiken.
    OPMERKING: HEK293T-cellen kunnen ook worden gebruikt om ubiquitinated eiwitten te zuiveren vanwege hun hoge transfectie-efficiëntie en eiwitexpressieniveau.

2. Plasmide transfectie

  1. Voeg 1,5 ml gereduceerd serummedium toe in drie centrifugebuizen van 15 ml.
  2. Voeg plasmide-DNA toe dat klaar is voor transfectie aan elke buis om als volgt verdunningen te maken. Buis 1: 1 μg Flag-p53 plasmide, 12 μg lege vector; Buis 2: 1 μg Flag-p53 plasmide, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plasmide en 9 μg lege vector; Buis 3: 1 μg Flag-p53 plasmide, 3 μg HH-Ub plasmide en 9 μg Mdm2 plasmide. Voeg in totaal 0,2 μg groen fluorescerend eiwit (GFP) plasmide toe aan elke buis om de transfectie-efficiëntie te controleren.
    OPMERKING: Een proefexperiment moet worden uitgevoerd om de optimale hoeveelheden plasmiden te bepalen die nodig zijn om een efficiënte doeleiwitexpressie in cellen te bereiken.
  3. Voeg 78 μL liposoom transfectiereagens toe aan 4,5 ml gereduceerd serummedium in een andere centrifugebuis om liposomen te verdunnen. Meng grondig door de buis te vegen en laat 5 minuten op kamertemperatuur (RT) staan.
  4. Voeg 1,5 ml van de verdunde liposoomoplossing toe aan elke buis uit stap 2.2 die 1,5 ml van de verdunde DNA-oplossing bevat. Meng grondig en verknoop de plasmiden met de liposomen gedurende ten minste 20 minuten bij RT. Gebruik een plasmide DNA: liposoomverhouding van 1:2 (μg:μL) voor elke transfectie.
  5. Gooi het originele medium uit de petrischalen weg en voeg 9 ml gereduceerd serummedium toe aan elk gerecht. Voeg 3 ml van het liposoom-DNA-mengsel toe aan elk gerecht en meng de oplossing door de plaat 3x voorzichtig heen en weer te schudden en vervolgens 3x links en rechts voor een gelijkmatige verdeling van het mengsel in de plaat.
  6. Kweek de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium na 4-6 uur en blijf de cellen gedurende 24-36 uur kweken.

3. Celverzameling

  1. Behandel de cellen na 24-36 uur met MG132 in een eindconcentratie van 10 μM gedurende 4-6 uur.
    OPMERKING: MG132 is een peptidealdehyde dat efficiënt de proteolytische activiteit van het 26S-proteasoomcomplex blokkeert. De hoeveelheden eiwitten die zijn geëubiquitineerd met lysine-48 (K48)-gebonden polyubiquitineketens kunnen worden verhoogd nadat cellen zijn behandeld met MG132 of andere proteasoomremmers.
  2. Gooi het medium weg, was de cellen 2x (zorg ervoor dat de cellen niet worden weggespoeld) met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en aspirateer de cellen met serologische pipetten.
  3. Voeg 1 ml PBS toe aan de schaal, verwijder de cellen door te schrapen met een schone schraper en breng de celsuspensie over in microcentrifugebuizen. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 minuten om celpellets te verzamelen.

4. Zuivering van ubiquitinated eiwitten onder niet-aturerende omstandigheden

  1. Bereid Flag lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl en 10% glycerol) vers aangevuld met proteaseremmer cocktail voor gebruik.
  2. Voeg 800 μL ijskoude Flag-lysisbuffer toe aan de cellen in elke buis, meng de cellen met behulp van een vortexoscillator of pipetpistool en incubeer het mengsel vervolgens op een rotator bij 4 °C gedurende 30 minuten.
  3. Onderwerp het mengsel aan 5-10 korte pulsen van ultrasone trillingen. Voer de ultrasoon op het ijs uit met een ultrasoonapparaatfrequentie van 20 kHZ en 80% amplitude waarbij elke puls 1 s duurt. Incubeer het mengsel op een rotator met 40 omwentelingen per minuut (rpm) bij 4 °C gedurende 30 min.
  4. Centrifugeer de ultrasone monsters bij 8.000 x g gedurende 20-30 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.
  5. Aliquot 80 μL (1/10) van het celextract en meng met 20 μL 5x natriumdodecylsulfaat (SDS) laadbuffer. Kook de monsters op 98 °C gedurende 5 min, koel af op ijs gedurende 2 min en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Gebruik deze monsters als invoergroep om de eiwitexpressie te controleren.
  6. Voeg 30 μL antivlag M2 antilichaam-geconjugeerde (Flag/M2) kralen toe aan de resterende celextracten en incubeer op een rotator bij 4 °C gedurende ten minste 4 uur of een nacht.
  7. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 min bij 4 °C om de kralen op te vangen. Voeg 1 ml ijskoude Flag lysis buffer toe aan de kralen en meng door de buis meerdere keren om te keren.
  8. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 min bij 4 °C om de kralen op te vangen. Herhaal stap 4.7 gedurende 4-6 keer.
  9. Voeg 40 μL Flag-peptiden in een eindconcentratie van 200 ng/μL toe aan de kralen en incubeer op een rotator bij 4 °C gedurende 2 uur om de gebonden eiwitten te elueren.
  10. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.
  11. Voeg 10 μL 5x SDS-laadbuffer toe, kook het mengsel op 98 °C gedurende 5 min, koel af op ijs gedurende 2 minuten en bewaar bij -20 °C voor Western blotting. U kunt het eluaat uit stap 4.10 ook direct bij -80 °C bewaren voor andere downstream-experimenten.
    OPMERKING: De hoeveelheid gezuiverde ubiquitinated eiwitten kan worden opgeschaald door het aantal cellen en hoeveelheden getransfecteerde plasmiden te verhogen. Een epitoop tagging strategie kan worden aangepast om cellulaire complexen te zuiveren die specifiek binden aan ubiquitinated p53 onder inheemse zuiveringsomstandigheden. Door Flag-p53, mdm2 en HA-ubiquitine co-expressie te geven, kan het ubiquitinated p53-eiwitcomplex immunoprecipiteerd worden door sequentiële Flag en HA-antilichaam-geconjugeerde agarose uit zoogdiercellen. Om partners van ubiquitinated p53-eiwitten te binden, moet de minder strenge BC100-lysisbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glycerol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 en 1x proteaseremmer) worden gebruikt tijdens het zuiveringsproces. Het eluaat uit HA-peptide wordt onderworpen aan massaspectrometrie om alle partners te identificeren die specifiek binden aan ubiquitinated p53.

5. Zuivering van ubiquitinated eiwitten onder denatureringsomstandigheden

  1. Voeg 1 ml ijskoude PBS toe aan de celpellets die in stap 3.3 zijn verkregen en meng gelijkmatig. Aliquot 100 μL (1/10 volume) van de celsuspensie in een microcentrifugebuis als invoermonster.
  2. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de celpellets te verzamelen. Voeg 80 μL Flag-lysisbuffer toe aan het invoermonster, meng de cellen met behulp van een vortexoscillator of pipetpistool en laat de cellen gedurende 1 uur op ijs vallen.
  3. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 20-30 min bij 4 °C. Aliquot 80 μL van het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis.
  4. Voeg 20 μL 5x SDS-laadbuffer toe aan het bovennatuurlijke middel, kook bij 98 °C gedurende 5-10 minuten, koel op ijs gedurende 2 minuten en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
  5. Centrifugeer de resterende 900 μL van de celsuspensie bij 700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de celpellet te verzamelen. Voeg 1 ml ubiquitinebuffer 1 (UB-buffer 1; 6 M guanidine-HCI, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) en 0,2% Triton X-100, vers aangevuld met 10 mM β-mercaptoethanol en 5 mM imidazool) toe aan de celpellets en meng verschillende keren door op en neer te pipetteren om de cellen gelijkmatig te verdelen.
    OPMERKING: De concentratie van imidazool kan variëren van 5 mM tot 20 mM om de niet-specifieke eiwitbinding op de nikkel-geladen hars te verminderen. Ubiquitinebuffer bevat guanidinehydrochloride, dat zowel ligases als DUB's inactiveert. β-mercaptoethanol is een heldere, kleurloze vloeistof met een sterke, onaangename geur vergelijkbaar met rotte eieren. Een oplossing met hoge concentratie veroorzaakt ernstige schade aan het slijmvlies, de bovenste luchtwegen, de huid en de ogen. Draag handschoenen en een bril en opereer in de zuurkast.
  6. Onderwerp de cellysaten aan 10-20 rondes ultrasoon totdat de oplossing niet langer stroperig is. Voer de ultrasoon op het ijs uit met een ultrasoonapparaatfrequentie van 20 kHZ en 80% amplitude waarbij elke puls 1 s duurt. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 20-30 minuten bij RT en breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
  7. Voeg 30 μL nikkel-geladen hars toe aan het supernatant en incubeer op een rotator die gedurende 4 uur of een nacht bij RT op 15 tpm is ingesteld. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 minuten bij RT om de kralen te verzamelen.
  8. Voeg 1 ml UB-buffer 1 toe, incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 minuten bij RT om de kralen te verzamelen.
  9. Voeg 1 ml ubiquitinebuffer 2 (UB-buffer 2; 8 M ureum, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) en 0,2% Triton X-100) toe aan de kralen, incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer op 1.500 x g gedurende 2 minuten om de kralen te verzamelen. Herhaal dit nogmaals.
  10. Voeg aan de kralen 1 ml PBS toe, incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 minuten bij RT om de kralen te verzamelen. Herhaal dit nogmaals.
  11. Elute gebonden eiwitten door de kralen te incuberen met 40 μL imidazool in een eindconcentratie van 0,5 M gedurende 1 uur bij RT. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 min bij RT.
  12. Breng het supernatant over in een schone microcentrifugebuis, voeg 10 μL 5x SDS-laadbuffer toe, kook bij 98 °C gedurende 5 minuten, koel af op ijs gedurende 2 minuten en bewaar bij -20 °C voor Western blotting. U kunt het onbewerkte eluaat ook bewaren bij -80 °C voor andere downstream-experimenten.

6. Detectie van gezuiverde ubiquitinated eiwitten door Western blotting

  1. Los de monsters uit stap 4.11 en 5.12 op met natriumdodecylsulfaatpoacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en breng ze vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan door Western blotting om doeleiwitten te detecteren met behulp van de overeenkomstige antilichamen zoals beschreven18.
  2. Kortom, incubeer het membraan door onder te dompelen in 20 ml blokoplossing met 5% ontvet melkpoeder in TBST-buffer (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, vers aangevuld met 0,1% Tween-20 voor gebruik) bij RT gedurende 1 uur. Incubeer vervolgens het membraan met primaire antilichamen bij RT gedurende 2 uur of een nacht bij 4 °C. Gebruik de volgende antilichamen voor elke set. Alle primaire antilichamen werden gebruikt bij een verdunning van 1:1000.
    1. Detecteer totaal p53-eiwit, inclusief ubiquitinated p53, met een anti-p53 monoklonaal antilichaam na immunoprecipitatie met Flag/M2 agarose-kralen.
    2. Detecteer ubiquitinated p53-eiwitten met een anti-HA-antilichaam of anti-ubiquitine-antilichaam na immunoprecipitatie met Flag / M2 agarose-kralen.
    3. Detecteer alomtegenwoordige p53-eiwitten met een anti-p53 monoklonaal antilichaam na nikkel-geladen hars pulldown.
    4. Detecteer totaal ubiquitinated eiwit met een anti-HA-antilichaam of anti-ubiquitine-antilichaam na nikkel-geladen hars pulldown.
  3. Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen bij RT gedurende 1 uur na 3x wassen met TBST-buffer gedurende 5 minuten elk. Alle secundaire antilichamen werden gebruikt bij een verdunning van 1:3000. Was vervolgens het membraan met TBST-buffer 3x gedurende 5 minuten elk met zachte roering.
  4. Start het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem om signalen van Western blotting te detecteren. Bereid de substraatoplossing voor HRP door oplossingen A en B te mengen in een verhouding van 1:1.
  5. Plaats het nitrocellulosemembraan in de camera obscura met de voorkant naar boven en bekleed de substraatoplossing gelijkmatig op het membraan met behulp van een pipetteerpistool. Selecteer de automatische belichtingsprocedure om chemiluminescente signalen op te vangen en pas de belichtingstijd handmatig aan totdat een ideaal signaal is verkregen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het schematische diagram toont de Flag-tagged p53 (Flag-p53) en His/HA double-tagged ubiquitine (HH-Ub) eiwitten (Figuur 1A). De procedures die worden gebruikt om ubiquitinated eiwitten te zuiveren zijn samengevat in figuur 1B. Poly-His-tagged ubiquitine kan worden geligeerd om eiwitten in zoogdiercellen te targeten. Ubiquitinated proteins kunnen worden gezuiverd met Flag/M2-kralen onder niet-aturerende omstandigheden of door geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC) onder denatureringsomstandigheden (figuur 1B). Totaal p53-eiwit, inclusief ubiquitinated p53, werd immunoprecipitated met Flag/M2-kralen uit H1299-cellen onder niet-aturerende omstandigheden. Het signaal van ubiquitinated p53-eiwit, dat verschijnt als een uitgesmeerde band van laag naar hoog molecuulgewicht, was aanzienlijk verhoogd toen Mdm2 ectopisch tot expressie kwam in deze cellen, wat suggereert dat ubiquitinated p53-eiwit effectief uit cellen is gezuiverd (figuur 2). Vervolgens werden de cellen gelyseerd onder denatureringsomstandigheden en werd het totale cellulaire ubiquitinated eiwit naar beneden getrokken met nikkel-geladen hars. Totaal cellulair eiwit werd gedetecteerd door Western blotting met behulp van een anti-HA monoklonaal antilichaam en ubiquitinated p53-eiwit werd gedetecteerd met behulp van een anti-p53 monoklonaal antilichaam. De resultaten toonden aan dat het totale ubiquitinated eiwitniveau onveranderd was, maar het ubiquitinated p53-eiwitniveau was dramatisch verhoogd nadat Mdm2 in deze cellen overexpressie had gehad. Deze resultaten gaven aan dat totale ubiquitine-eiwitten die ubiquitinated p53 bevatten, effectief uit cellysaten werden gehaald onder denatureringsomstandigheden (figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Een samenvatting van de procedures die worden gebruikt om ubiquitinated eiwitten te zuiveren. (A) Schematisch diagram van de Flag-tagged p53 (Flag-p53) en His / HA double-tagged ubiquitine (HH-Ub) eiwitten. (B) Ubiquitinated proteins kunnen worden gezuiverd met Flag/M2-kralen onder niet-condenserende omstandigheden en door IMAC onder denatureringsomstandigheden. Afkortingen: His/HA = polyhistidine/hemagglutinine; Ub = ubiquitine; Vlag/M2 kralen = anti-Vlag M2 antilichaam-geconjugeerde kralen; IMAC = geïmmobiliseerde metaal ionenaffiniteitschromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd onder niet-verzadigde omstandigheden. De Flag-p53 expressie plasmide werd alleen getransfecteerd, met HH-Ub, of met Mdm2 en HH-Ub in H1299 cellen. De totale p53-eiwitten en ubiquitinated vormen werden immuunprecipiteerd door Flag/M2-kralen uit celextracten. Het eluaat werd onderworpen aan Western blotting met anti-p53 (A) en anti-HA (B) monoklonale antilichamen. (C) De extracten van ruwe cellen (Input) werden onderworpen aan Western blotting met anti-p53 en anti-Mdm2 monoklonale antilichamen. GFP werd gebruikt als laadcontrole. Afkortingen: HH-Ub = His/HA double-tagged ubiquitin; HA = hemagglutinine; Vlag/M2 kralen = anti-Vlag M2 antilichaam-geconjugeerde kralen; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd onder denatureringsomstandigheden. De Flag-p53 expressie plasmide werd alleen getransfecteerd, met HH-Ub, of met Mdm2 en HH-Ub in H1299 cellen. De totale cellulaire ubiquitinated eiwitten werden naar beneden getrokken met nikkel-geladen hars en werden vervolgens onderworpen aan Western blotting met anti-p53 en anti-HA monoklonale antilichamen. (A) Ubiquitinated p53-eiwit werd gedetecteerd met behulp van een anti-p53-antilichaam. (B) Totaal ubiquitineerd eiwit werd gedetecteerd met behulp van een anti-HA-antilichaam. (C) De extracten van ruwe cellen (Input) werden onderworpen aan Western blotting met anti-p53 en anti-Mdm2 monoklonale antilichamen. GFP werd gebruikt als laadcontrole. Afkortingen: HH-Ub = His/HA double-tagged ubiquitin; HA = hemagglutinine; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ubiquitinatie speelt een cruciale rol in bijna alle fysiologische en pathologische cellulaire processen2. In de afgelopen jaren is grote vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de moleculaire rol van ubiquitine in signaalroutes en hoe veranderingen in het ubiquitinesysteem leiden tot verschillende menselijke ziekten2. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan het inzichtelijk maken van de exacte rollen van ubiquitinatie in deze processen. De mengsels van ubiquitine-geconjugeerde eiwitten kunnen worden gezuiverd uit cellen onder niet-deaturerende en denaturerende omstandigheden. IMAC met behulp van nikkelharsen kan worden gebruikt om poly-His-tagged eiwitten te zuiveren onder denatureringsomstandigheden. Het doel van het zuiveren van ubiquitinated eiwitten onder denatureringsomstandigheden is om de interactiepartners uit doeleiwitten weg te gooien. Alle cellulaire componenten die aan de doeleiwitten binden, worden onder denatureringsomstandigheden uit de elutie verwijderd. Daarentegen kunnen sommige cellulaire eiwitten die binden aan doeleiwitten onder inheemse omstandigheden in de elutie worden gehouden, wat de stroomafwaartse experimenten kan verstoren. Ubiquitinated eiwitten kunnen zelfs worden gezuiverd in de aanwezigheid van sterke denaturanten, wat de niet-specifieke eiwitbinding aan nikkelharsen sterk vermindert. Daarentegen kunnen de totale doeleiwitten, inclusief hun alomtegenwoordige vormen, worden gezuiverd door epitoop-taggingstrategieën met behulp van antilichaam-geconjugeerde agarose-kralen onder niet-denaturerende omstandigheden. Eiwitten werden gezuiverd onder minder strenge voorwaarden omdat tijdens dit proces antilichaam-gemedieerde affiniteitszuivering werd gebruikt. De doeleiwitten en hun ubiquitinated vormen werden gedetecteerd met eiwit- of ubiquitine-specifieke antilichamen. HA- en Myc-gelabelde eiwitten kunnen gemakkelijk worden gezuiverd volgens dezelfde procedure met antilichaam-geconjugeerde agarose-kralen. Met name is het gemakkelijker om eiwitten te detecteren met enkele of meerdere monoubiquitineketens dan die met polyubiquitineketens met eiwitspecifieke antilichamen. Daarentegen kunnen eiwitten met polyubiquitineketens gemakkelijker worden herkend door ubiquitine-specifieke antilichamen.

Om ubiquitinated eiwitten effectief te zuiveren, moet het expressieniveau van doeleiwitten hoog zijn in zoogdiercellen. Expressievectoren met sterke CMV-promotors kunnen worden gebruikt om hoge niveaus van eiwitexpressie in cellen te bereiken. Bovendien kunnen E3-ubiquitineligase en ubiquitine samen met de doeleiwitten tot expressie worden gebracht. Het zal ubiquitine moieties effectiever toevoegen aan de eiwitten. De activiteit van 26S-proteasoom kan worden geblokkeerd door een remmer met kleine moleculen om ubiquitinated eiwitten in cellen te accumuleren. Om ubiquitinated eiwitten effectief aan de hars te binden, moeten celextracten kort worden gesoniseerd om het DNA-complex te verstoren om de oplossing niet-viskeus te maken. Om de niet-specifieke binding te verminderen, moet een lage concentratie imidazol onder denatureringsomstandigheden aan de lysisbuffer worden toegevoegd. De alomtegenwoordige eiwitten met een zeer hoog molecuulgewicht zijn gemakkelijker te binden met de hars na de denaturerings- en hervouwingsprocedure. Om de efficiëntie van elutie te verhogen, probeer een hogere concentratie imidazool te gebruiken. Als de efficiëntie van elutie nog steeds extreem laag was, probeer dan de ubiquitinated eiwitten te elueren door direct te koken in SDS Laemmli-laadbuffer. De meeste alomtegenwoordige eiwitten die aan de hars zijn gebonden, kunnen in deze sterke denatureringsbuffer worden geëlueerd. Om een hogere zuiverheid van ubiquitinated eiwitten te bereiken, kan een tweestaps affiniteitszuivering worden aangepast. Na Flag/M2 immunoprecipitatie onder niet-stenaturerende omstandigheden, kan een tweede stap zuivering door nikkel-geladen hars worden gebruikt om His-tagged ubiquitinated eiwit naar beneden te trekken en zich te ontdoen van niet-ubiquitinated substraten. Daarentegen, na nikkel-geladen hars pull-down onder denatureringsconditie, kan een tweede affiniteitszuiveringsstap worden aangepast om de doeleiwitten immunoprecipitaat te immunopreciperen met behulp van de epitoop-taggingstrategie door anti-Flag of anti-HA antilichaam geconjugeerde agarose-kralen.

We hebben meer gevoelige immunoblotting gebruikt in plaats van zilverkleuring of Coomassie-kleuring om ubiquitinated eiwitten te detecteren, omdat we in deze studie een kleine zuiveringsschaal hebben uitgevoerd. Hoewel sommige cellulaire eiwitten gemakkelijk alomtegenwoordig zijn in cellen, kan slechts een klein deel van de eiwitten worden geligeerd met ubiquitine moieties. Om deze eiwitten met succes te detecteren door zilverkleuring of Coomassie-kleuring, moet een grote schaal van zuivering worden uitgevoerd. Om de zuiverheid van ubiquitinated eiwitten te verhogen, moet ook een tweede affiniteitszuiveringsstap worden uitgevoerd. We hebben deze experimenten niet uitgevoerd omdat ubiquitinated eiwitten die via dit protocol worden gezuiverd volledig voldoen aan de vereiste van downstream-analyses. Om bijvoorbeeld specifieke DUB's te identificeren voor een doeleiwit gereguleerd door ubiquitinatie, moeten we een grote hoeveelheid ubiquitinated doeleiwitten zuiveren. Deze eiwitten kunnen worden geïncubeerd met individuele DUB's gezuiverd uit zoogdiercellen in een deubiquitinatiebuffer. Door deze in vitro high throughput screening kunnen we DUB's identificeren die specifiek zijn voor een doeleiwit in zoogdiercellen.

Er zijn verschillende beperkingen van de techniek. De alomtegenwoordige eiwitten zijn goed voor een zeer klein deel van de doeleiwitten, het is moeilijk om een grote hoeveelheid ubiquitinated doeleiwitten te zuiveren. Probeer de eiwitexpressie in cellen op te schalen om een hoge zuiveringsefficiëntie te bereiken. Een alternatief is om een in vitro ubiquitinatiereactie uit te voeren om meer ubiquitinated eiwitten te verkrijgen. Sommige eiwitten zijn moeilijk om sterk tot expressie te komen in de zoogdiercellen, wat een andere beperking stelt aan het zuiveren van grotere hoeveelheden ubiquitinated eiwitten. Ten slotte is het huidige protocol beperkt tot de zuivering van gelabelde eiwitten die overexpressie vertonen met behulp van plasmide-DNA. De expressieniveaus van de doeleiwitten zijn hoger dan die van de endogene doeleiwitten. Om de endogene ubiquitinatiestatus van een doeleiwit te beoordelen, kunnen de eiwitten met hun ubiquitinated vormen direct immunoprecipiteerd worden door doeleiwitspecifieke antilichamen uit cellen. Anti-ubiquitine-antilichamen kunnen worden gebruikt om de ubiquitinatiestatus van het doeleiwit te bepalen. Onder sommige omstandigheden kan het lagere expressieniveau, het lagere ubiquitinatieniveau van het doeleiwit of de lagere immunoprecipitatie-efficiëntie van specifieke antilichamen de detectie van de ubiquitinatiestatus van de endogene doeleiwitten uit zoogdiercellen echter beperken. Het huidige protocol kan in plaats daarvan een experimenteel systeem bieden.

Het p53 tumorsuppressorgeiwit speelt een cruciale rol bij het voorkomen van de kwaadaardige transformatie van normale cellen 8,9,10,11. De stabiliteit van p53 wordt strak gereguleerd door ubiquitinatie-gemedieerde afbraak in cellen. Mdm2 werkt als een E3 ubiquitine ligase om p53 mono- en polyubiquitinatie op een dosisafhankelijke manier te bevorderen16. Hier werden alomtegenwoordige p53-eiwitten gezuiverd onder denaturerende en niet-denaturerende omstandigheden in zoogdiercellen in aanwezigheid van Mdm2-overexpressie. De monoubiquitinated p53-eiwitten werden bij voorkeur gedetecteerd met anti-p53 monoklonale antilichamen, terwijl de polyubiquitinated vormen gemakkelijk werden gedetecteerd met ubiquitine-specifieke antilichamen. De niveaus van polyubiquitinated vormen kunnen effectief worden verhoogd door de expressie van Mdm2 in cellen te verhogen. Dit artikel biedt een ideaal experimenteel systeem voor de bereiding van ubiquitinated eiwitten om de rol van ubiquitinatie bij het moduleren van de eiwitfunctie op te helderen. Ubiquitinated eiwitten kunnen worden gebruikt om specifieke DUB's voor een doeleiwit te identificeren en om de rollen van verschillende soorten ubiquitineketens te onthullen, bijvoorbeeld de K48- en K63-gekoppelde ketens, in signalering. Dit protocol kan worden gebruikt om de rollen van ubiquitinatie in eiwit-eiwitinteractie en eiwitcomplexvorming te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (81972624) aan D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).

Tags

Biochemie nummer 181
Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter