Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High-Throughput Screening av mikrobielle isolater med innvirkning på Caenorhabditis elegans Helse

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63860
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University
* These authors contributed equally

Summary

Tarmmikrober kan positivt eller negativt påvirke helsen til verten via spesifikke eller konserverte mekanismer. Caenorhabditis elegans er en praktisk plattform for å skjerme for slike mikrober. Denne protokollen beskriver høy gjennomstrømningsscreening av 48 bakterielle isolater for påvirkning på nematodestressresistens, brukt som proxy for ormhelse.

Abstract

Med sin lille størrelse, korte levetid og enkle genetikk, tilbyr Caenorhabditis elegans en praktisk plattform for å studere virkningen av mikrobielle isolater på vertsfysiologi. Det fluorescerer også i blått når du dør, og gir et praktisk middel til å finne døden. Denne egenskapen har blitt utnyttet til å utvikle high-throughput etikettfrie C. elegans overlevelsesanalyser (LFASS). Disse involverer time-lapse fluorescensregistrering av ormpopulasjoner satt i multiwellplater, hvorfra befolkningens median dødstid kan utledes. Denne studien vedtar LFASS-tilnærmingen for å skjerme flere mikrobielle isolater samtidig for effektene på C. elegans følsomhet for alvorlig varme og oksidativ stress. Slike mikrobielle screening rørledning, som spesielt kan brukes til å prescreen probiotika, ved hjelp av alvorlig stressmotstand som en proxy for vertshelse, er rapportert her. Protokollen beskriver hvordan man dyrker både C. elegans tarmmikrobiota-isolatsamlinger og synkrone ormpopulasjoner i multiwell-arrays før de kombineres for analysene. Eksemplet som er gitt dekker testing av 47 bakterieisolater og en kontrollstamme på to ormstammer, i to stressanalyser parallelt. Innflygingsrørledningen er imidlertid lett skalerbar og anvendelig for screening av mange andre modaliteter. Dermed gir det et allsidig oppsett for raskt å kartlegge et multiparametrisk landskap av biologiske og biokjemiske forhold som påvirker C. elegans helse.

Introduction

Menneskekroppen har anslagsvis 10-100 billioner levende mikrobielle celler (bakterier, archaea sopp), som primært finnes i tarm-, hud- og slimhinnemiljøer1. I en sunn tilstand gir disse fordeler for verten, inkludert vitaminproduksjon, modning av immunsystemet, stimulering av medfødte og adaptive immunresponser mot patogener, regulering av fettmetabolismen, modulering av stressresponser og mer, med innvirkning på vekst og utvikling, sykdomsutbrudd og aldring 2,3,4,5 . Tarmmikrobiotaen utvikler seg også betydelig gjennom livet. Den mest drastiske utviklingen skjer i barndom og tidlig barndom6, men signifikante endringer forekommer også med alderen, inkludert en reduksjon i Bifidobacterium overflod og en økning i Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae og Enterococcus arter7. Livsstil kan ytterligere endre tarmens mikrobielle sammensetning som fører til dysbiose (tap av gunstige bakterier, overvekst av opportunistiske bakterier), noe som resulterer i ulike patologier som inflammatorisk tarmsykdom, diabetes og fedme5, men bidrar også til Alzheimers og Parkinsons sykdommer 8,9,10,11.

Denne erkjennelsen har kritisk bidratt til å raffinere begrepet tarm-hjerneaksen (GBA), hvor interaksjoner mellom tarmfysiologi (nå inkludert mikrober i den) og nervesystemet regnes som hovedregulator for dyremetabolisme og fysiologiske funksjoner12. Imidlertid er den nøyaktige rollen som mikrobiota i tarm-hjernesignalering og tilhørende virkningsmekanismer langt fra å bli fullt ut forstått13. Med tarmmikrobiota som en viktig determinant for sunn aldring, har hvordan bakterier modulerer aldringsprosessen blitt gjenstand for intens forskning og kontrovers 6,14,15.

Med demonstrasjonen at rundorm Caenorhabditis elegans er vert for en bonafide tarmmikrobiota dominert - som i andre arter - av Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria 16,17,18,19,20, den raske økningen som en eksperimentell plattform for å studere host-gut commensal interaksjoner 21,22,23,24 ,25,26 har betydelig utvidet vårt etterforskningsarsenal26,27,28,29. Spesielt kan eksperimentelle tilnærminger med høy gjennomstrømning som er tilgjengelige for C. elegans for å studere gen-diett, gen-stoff, genpatogen, etc. interaksjoner, tilpasses for raskt å undersøke hvordan bakterielle isolater og cocktailer påvirker C. elegans helse og aldring.

Den nåværende protokollen beskriver en eksperimentell rørledning for å skjerme samtidig arrays av bakterielle isolater eller blandinger satt i multiwell plater for effekter på C. elegans stressmotstand som en proxy for helse, som kan brukes til å identifisere probiotika. Den beskriver hvordan man kan vokse store ormpopulasjoner og håndtere bakterielle arrays i 96- og 384-brønns plateformater før behandling av ormer for automatisert stressmotstandsanalyse ved hjelp av en fluorescensplateleser (figur 1). Tilnærmingen er basert på etikettfrie automatiserte overlevelsesanalyser (LFASS)30 som utnytter fenomenet dødsfluorescens31, der døende ormer produserer et utbrudd av blå fluorescens som kan brukes til å fastslå dødstidspunktet. Blå fluorescens sendes ut av glukosylestere av anthranilinsyre lagret i C. elegans tarmgranulat (en type lysosomrelatert organell), som brister når en nekrotisk kaskade utløses i ormtarmen ved døden31.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt for høy gjennomstrømningsscreening av bakterieisolater med innvirkning på C. elegans motstand mot stress . (A) Tidslinje for vedlikehold og analyse av ormer og bakterier. (B) 96-brønn bakteriell plate array oppsett og håndtering. (C) 384-brønns ormplateoppsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De to C. elegans-stammene som ble brukt parallelt for den nåværende studien var Bristol N2 villtype og HT1890: daf-16 (mgDf50), som vokser med tilsvarende hastigheter. Protokollen kan imidlertid replikeres med en hvilken som helst kombinasjon av to stammer som har lignende vekstrater. Merk at når du tester andre stammer parallelt (for eksempel villtype og sakte voksende daf-2-mutanter ), må forskjellige vekstrater vurderes, og følgelig må protokollen justeres. Tidsskalaene og mengdene av ormer og bakterier i følgende protokoll er optimalisert for parallell testing av 48 bakterielle isolater på to ormstammer i to LFASS-analyser i tetraplikater. Justeringer vil være nødvendig hvis flere forhold skal testes parallelt. Escherichia coli OP50 bakteriestamme ble oppnådd fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota. De 48 bakterieisolatene ble hentet fra Schulenburg-laboratoriet og vedlikeholdt på LB-agar.

1. C. elegans dyrking på OP50 (Dag 1 - 8)

MERK: Den nåværende tilnærmingen tar sikte på å dyrke C. elegans hermafroditter på et fast medium i alle stadier og unngår unødvendige kostholdsendringer (dvs. ved bruk av alternative raskere voksende E. coli-stammer som NA22 eller rikere vekstmedier som eggplater) for å forbli så nært som mulig til standard vekstforhold32,33 som fortsatt er mye brukt. Ormens veksttemperatur (her satt til 15 °C) avhenger av C. elegans-stammen(e) som brukes, og kan trenge justering (for eksempel for å unngå eller utløse uttrykket av en temperaturfølsom fenotype eller biomarkør). For informasjon om ormehold, se referanse33.

  1. Forbered åtte NGM-plater med en diameter på 6 cm (10 ml nematodevekstmedieagar, NGM, tilleggsfil 1)32,33 per ormstamme og la dem tørke i 1 dag ved romtemperatur.
  2. Forbered en mettet flytende kultur av E. coli OP50-bakterier ved å så en enkelt bakteriell klon fra en nydyrket Lysogeny Broth agar (LB agar, Supplementary File 1) plate i 25 ml OP50 medium (Supplementary File 1) i et 50 ml konisk rør. Dyrk kulturen over natten ved 37 °C i en shakerinkubator.
  3. Inokuler de åtte 6 cm NGM-platene per stamme med 100 μL mettet væskekultur av E. coli OP50 per plate og hold platene ved 20 °C i 2 dager før bruk.
  4. Bruk en skalpell, kutt og overfør en firkantet agarbit på 0,5 cm med ormer fra en nylig sultet NGM-plate på hver av de åtte inokulerte 6 cm NGM-platene og inkuber disse platene ved 20 ° C i 3 dager (eller til ormene er ferdige med maten).
  5. Forbered fem 15 cm NGM-plater per ormstamme (30 ml NGM-medium per plate) og inokuler med 3 ml OP50. La platene tørke før du ruger ved 37 °C over natten. Hold platene ved 20 °C til bruk i senere trinn.
  6. Bruk en P-1000-pipette, tilsett opptil 3 ml steril M9-buffer (tilleggsfil 1) til 6 cm NGM-platene (trinn 1.1.) for å resuspendere ormene, og samle ormoppløsningen fra alle åtte plater per stamme i et enkelt 15 ml konisk rør.
    1. Sentrifuge ved 142 x g i 2 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten forsiktig ved hjelp av en P-5000-pipette eller en vannpumpe utstyrt med en steril Pasteur-pipette eller spiss. Tilsett 10 ml steril M9-buffer for å vaske ormpelleten. Gjenta 2x.
    2. Fjern supernatanten (så mye som mulig) og overfør ormene til en 15 cm OP50-inokulert NGM-plate (trinn 1.5.) ved hjelp av en pipette. Tilsett 0,5 ml konsentrert OP50-kultur.
    3. For å lage konsentrert OP50, inokulere hver av fire 1 L flasker LB med 2 ml OP50 startkultur (tilberedt i trinn 1.2.), og vokse i en risting inkubator i 6 timer ved 37 ° C og 160 x g. Pellet bakteriene ved 3057 x g og 20 °C i 15 min. Kast supernatanten, resuspender bakteriepellets med 6 ml OP50 medium, og samle i et sterilt 50 ml konisk rør.
      MERK: Bakterier kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
  7. Dyrk hver ormstamme på en NGM-plate med en diameter på 15 cm i 3-4 dager ved 15 °C ved å mate ormene med 0,5 ml konsentrert OP50 daglig.
    1. Når ormene nesten er ferdige med maten, samles og vaskes i M9-buffer (trinn 1.6.1.), overfører hver ormstammekultur til to 15 cm NGM-plater (trinn 1.5.) og forplanter ormer ved 20 ° C til ~ 95% av befolkningen er gravid voksne (det vil ta omtrent 24 timer for villtype Bristol N2).
      MERK: Gravide voksne er preget av tilstedeværelsen av egg i ormen, og den ideelle platen skal også ha en overflod av uklipte egg lagt på platen uten for mange larver33.

2. Vedlikehold av tarmmikrobiotaisolatsamlinger (dag 9)

  1. Strek de 48 bakterieisolatene på individuelle 6 cm LB agarplater og vokse i 48 timer ved 20 °C.
    MERK: Bakterier kan dyrkes ved 25 °C i 24-36 timer om nødvendig raskere, men den lengre veksten på 20 °C gjør det mulig å oppdage potensielle forurensninger.
  2. Synkroniser et stort antall C. elegans.
    1. Blekemiddel gravid voksne ormer ved å følge standard eggpreparasjonsmetode33 og overfør eggene til to useedede 15 cm NGM-plater i 24 timer ved 15 ° C for å tillate at alle L1-larvene klekkes og vokser synkront i de påfølgende trinnene.
      FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer blekemiddelløsninger.

3. Voksende store C. elegans kulturer (Dag 10)

  1. Når de er klekket, samler du L1-larvene (fra trinn 2.2.1.) i 3-4 ml M9 i et rent konisk 15 ml rør. Pipette fire 10 μL dråper ormløsning på et lysbilde eller en plate og telle antall ormer i hver dråpe under et stereomikroskop ved 16x forstørrelse. Bestem ormkonsentrasjonen av løsningen ved å beregne gjennomsnittlig antall larver fra alle dråper ormoppløsning. Multipliser denne verdien med volumet som er igjen og estimer det totale ormtallet for hver belastning.
    MERK: 46.000-50.000 L1 larver per stamme er nødvendig på dette stadiet for senere å fylle en 384-brønnplate eller to halvplater.
    1. For hver belastning overfører du alle L1-larvene til to 15 cm NGM-plater (23 000-25 000 L1 per plate) som tidligere er inokulert med 3 ml OP50 (trinn 1,5.) og sådd på nytt med 0,5 ml konsentrert OP50.
  2. Inkuber ved 15 °C, fyll på med 0,5 ml konsentrert OP50 daglig etter behov til ormene når L4-stadiet.
    MERK: L4-trinnet er preget av en litt mørkere tarm og en halvskive eller halvmåneformet hvit flekk hvor vulva til slutt vil danne32,33.
  3. Forbered 96-brønns NGM-agaroseplater ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Forbered åtte 96-brønns NGM-agaroseplater ved å fylle hver brønn med 125 μL NGM-agarose (fire plater per analyse).
      MERK: Det anbefales å plate noen ekstra plater hvis noen blir forurenset i de påfølgende trinnene. To platelesere vil bli pålagt å kjøre analyser parallelt, men de kan også kjøres suksessivt med utgangspunkt i varmespenningsanalysen, da den kan kjøres i så lite som 6 timer. For disse platene er den <4% askeagar erstattet med agarose (se materialtabell), noe som muliggjør langsommere og jevnere tørking over NGM-pluggene og reduserer ormgraving for bedre utvinning.
    2. Sørg for at brønnene fylles jevnt og boblefritt. Bruk en varmeblokk satt til 70 ° C (med langsom varmeoverføring gjennom plasten i multiwellplaten, NGM-agarose kan bare varme opp til ca. 55-60 ° C) for å forhindre at blandingen størkner under prosessen. For å fjerne bobler i brønner, bruk en steril flammeoppvarmet nål.
    3. La platene med 96 brønner settes i romtemperatur i et sterilt miljø før de snus (lokket ned for å forhindre kondens) og oppbevares ved 4 °C i en ren boks til det er nødvendig.
  4. På dag 11, sjekk ormene fra trinn 3.2., slik at ingen forurensninger har dukket opp og ormene fortsatt er fulle.
  5. På dag 12, sjekk ormene fra trinn 3.1., og sørg for at ingen forurensninger har dukket opp og ormene fortsatt er fulle. Sjekk også ormenes utviklingsstadium.
    MERK: Kjønn / stamme og utviklingsstadiet av ormen, for eksempel L4 eller L4 + 24 h ormer som brukes, er avhengig av behandlingene ormene blir utsatt for. Her ble villtype hermafroditter utsatt for bakterieisolat fra L4 i 36 timer.

4. Forbereder tarmmikrobiotaisolatsamlinger for fôring av ormer

  1. Overvåk bakterievekst på LB-agarplatene fra trinn 2.1. og fortsett å ruge ved 20 °C.
    MERK: Selv om det ikke er ideelt, i tilfelle noen kloner ikke vokser eller avslører forurensninger, kan bakterier bli stripet fra rene lagre på 6 cm LB-plater og dyrket ved 25-28 ° C i 24 timer for å være klar for eksperimentet.
  2. Definer et 96-brønns array-oppsett for bakteriesamlingen som testes, noe som letter systematisk platesåing og dataanalyse i de påfølgende trinnene (tilleggstabell 1).
  3. Samle bakteriemassen fra hver 6 cm bakterieplate (trinn 4.1.), og overfør den til et merket 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml M9-buffer. Utfør dette ved å bruke enten en steril plastsløyfe med en engangs 2 mm diameter eller en metallsløyfe med en diameter på 5 mm. Steriliser metallsløyfen mellom bakteriestammer ved å dyppe i 100% etanol, flammende og avkjøle i 5 s.
  4. Vortex mikrosentrifugerørene til bakteriepellets er fullstendig resuspended (avhengig av bakteriestammen, kan dette ta ~ 1-10 s).
  5. Spinn ned ved 9,300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, fjern 700 μL supernatant og resuspender bakteriepelleten ved vortexing.
  6. Overfør 200 μL av hver bakteriesuspensjon til en enkelt brønn i en tom steril 96-brønnsplate i henhold til oppsettet angitt i trinn 4.2.
  7. Fra denne platen inokulerer du åtte 96-brønns NGM-agaroseplater (fremstilt i trinn 3.3.) med 10 μL bakterieoppløsning ved hjelp av en flerkanals pipette og inkuberer med lokket på ved 25 °C i 24 timer. Ikke forsegl platene for å tillate platetørking og bakteriell aerob vekst og for å unngå overflødig kondens.
  8. Forsegl opphengsplaten med 96 brønner klargjort i trinn 4.6. med ren selvklebende tetningsfilm (se Materialfortegnelse), og oppbevares ved 15 °C i opptil 5 dager. Dette vil bli brukt til ormen re-fôring etter behov.

5. Oppsett av LFASS varmesjokk og oksidativ analyse (dag 13-14)

  1. Ser du på platene fra trinn 3.5., vurder ormenes utviklingsstadium. Når >90% av ormene har nådd L434, samle ormene i opptil 10 ml steril M9-løsning i 15 ml koniske rør.
  2. Vask ormene grundig (minst 4x) ved å spinne ned ved 142 x g i 2 minutter ved 4 °C, fjerne supernatanten og tilsette 10 ml fersk steril M9 mellom hver vask for å bli kvitt OP50-bakterier. Resuspender ormpelleten i 10 ml M9.
  3. Overfør 50 μL snekkeoppløsning til et lavoverflatebindende rør (se Materialfortegnelse) inneholdende 950 μL M9. Etter forsiktig blanding av rørinnholdet for å unngå ormsedimentering, bruk raskt en fuktet pipettespiss med lav binding for å overføre 3-4 separate 10 μL-dråper på et glassglass eller en NGM-plate, og telle ormnumre under et stereomikroskop (se materialtabell) ved 16x forstørrelse. Gjennomsnittlig teller fra 3-4 dråper og bestemme antall ormer per mikroliter i ormoppløsningen (se trinn 3.1.).
  4. Juster ormkonsentrasjonen i 10 ml røret for å nå ~ 120 ormer i 8 μL. Hvis oppløsningen er tilberedt i trinn 5.2. er ikke konsentrert nok, spinn ormene ned og fjern M9 tilsvarende for å nå 120 ormer per 8 μL.
  5. Overfør 8 μL ormløsning (~120 ormer) til hver av brønnene i de åtte NGM-agaroseplatene med 96 brønner fra trinn 4.7., ved hjelp av en flerkanalspipet eller en gjentatt pipt. Sørg for å bruke tips om lav oppbevaring for å begrense ormtap. Det kan også være nødvendig å kutte spissendene for å tillate store voksne ormer for å begrense mekanisk stress på voksne ormer.
    MERK: Analysen krever minst 30 levende sunne ormer for å fungere pålitelig, men fungerer best med ca 100 ormer per brønn.
  6. Inkuber ormen og bakteriefrøede 96-brønns NGM-agaroseplater ved 25 ° C i 36 timer.
  7. Kontroller platene mellom 12-24 timer, slik at ormene forblir fulle hele tiden. Hvis det er behov for re-fôring, resuspendere bakteriene i 96-brønns bakteriell array plate lagret ved 15 ° C i trinn 4.8., og legg opp til 10 μL av den tilsvarende bakterielle løsningen til 96-brønns NGM-agarose plater hvor ormer er i fare for sult før slutten av 36 timers inkubasjonsperiode (sultede ormer vil produsere svært forskjellige resultater, så dette er veldig viktig).
    MERK: Følgende trinn må utføres på dag 15. Før du starter analysen, kan det være nødvendig å optimalisere lesehøyden. Den optimale avlesningen oppnås 20-50 μm over bunnen av brønnen. Dette vil være avhengig av modellen til plateleseren. Noen tilbyr muligheten for en Z-scan, mens andre tillater manuell høydeinngang. Still inn den optimale høyden på nivået der det høyeste blå fluorescenssignalet (365 nm/430 nm) oppdages. Noen platelesere kan operere i en fast høyde optimalisert for tilhengercelleanalyser og er kanskje ikke ideelle for LFASS-analyser.
  8. Etter 36 timer dispenseres 30 μL M9 i hver brønn i 96-brønnsplaten.
    MERK: For termiske spenningsanalyser må plateleseren ha nådd ønsket temperatur for å utføre analysen og må kanskje slås på på forhånd. Den nåværende protokollen bruker 42 °C for å maksimere drapshastigheten, men tilnærmingen gjelder for andre temperaturer over 30 °C.
  9. Overfør ormer (ca. 20 μL) til 384-brønnsplaten i henhold til angitte oppsett, ved hjelp av lavretensjonstips (vurder å kutte av enden av spissene for å tillate store ormer å redusere mekanisk stress for voksne ormer).
    MERK: For denne studien brukes to forskjellige plateleserinnstillinger for de to analysene som er beskrevet her (termisk stress og oksidativt stress), og prøver beregnet på disse to analysene må derfor ikke belegges i samme 384-brønnplate.
  10. Kontroller at plateleserne er riktig konfigurert (tabell 1).
  11. Fyll på 384-brønnsplatene med mer M9, med sikte på et endelig volum på 60 μL per brønn. For termisk spenningsanalyse, tilsett 40 μL M9, og for t-BHP-indusert oksidativt stress, tilsett 34 μl M9 i 6 μl t-BHP (se materialtabell).
    1. Start analysen innen 2 minutter etter at du har lagt til t-BHP (ideelt sett må alle ormer utsettes for t-BHP samtidig, analysetidsoppløsningen er 2 min). Hvis det ikke er mulig, bruk en tidtaker for å estimere tiden brukt pipettering av t-BHP før analysestart for å tillate senere justering av median dødstid.
  12. Lukk platene med det gjennomsiktige lokket. Forsegl kantene på 384-brønnplatene med maskeringstape (taping over platen og lokket), slik at båndet ikke går over lokket eller under platen. Skjær båndet mellom lokket og platen med intervaller ved hjelp av en skalpell for å tillate luftutveksling mens du minimerer fordampning under analysen.
  13. Sett platen inn i plateleseren (se Materialfortegnelse) og start kjøringen. Målet er å begeistre ved 365 nm og oppdage utslipp ved 435 nm hvert 2. minutt i 6-12 timer (tabell 1).
    MERK: Vanligvis er 6 timer nok for 42 ° C varmespenningsanalyser og 8 timer for 7% t-BHP oksidativt stressanalyser.

6. Håndtering av plateleserdata

  1. Lagre råfluorescensdataene fra plateleseren som komma- eller tabulatorseparerte .txt-, .csv- eller .xls /.xlsx-formater, og konverter deretter til xls /.xlsx-format. Avhengig av dataformatet, kan du omorganisere dem slik at de samsvarer med Excel-arkoppsettet som trengs for LFASS-analyse. Følg de detaljerte instruksjonene i referanse30.
    MERK: Mens data kan analyseres manuelt, normalisere hver tidsserie og se etter tidspunktet da dødsfluorescens når det halve maksimumet, kan automatisert analyse utføres i Matlab som kjører LFASS-rutinen30.
  2. Last ned og installer Matlab (versjon 2014a eller nyere) og LFASS-programvarepakken fra https://github.com/ABA80/LFASS. Følg retningslinjene og merknadene som er gitt i den.
    MERK: Figur 1C gir en kort beskrivelse av tilnærmingen. Matlab er pålagt å kjøre LFASS-rutinen. Alternativt kan Matlab-koden oversettes til Oracle, bortsett fra tilpasningsfunksjonen, som er proprietær. Nye utjevnings- og sigmoidfunksjoner kan skrives om for å muliggjøre bruk i en helt åpen kildekode-plattform.
  3. Mellom LFASS-analyser flytter du dataene og resultatene til et nytt sted, da LFASS-analysen vil behandle alle filene i datamappen og overskrive filer i Resultater-mappen.

7. Inspeksjon av data

  1. Åpne Excel-filen og merk radene i henhold til brønnposisjonen på platen med 384 brønner. Tilleggsfil 2 viser et eksempel på Excel-filen for råfluorescensdataene som genereres for varmesjokkanalysen. Bruk brønnposisjonen på 384-brønnplaten for å merke ormen og bakteriestammene.
  2. I forkant av Matlab-analysen, inspiser dataene visuelt i Excel, og plott fluorescensintensitet over tid for en representativ brønn. Avhengig av plateleseren som brukes, kan data være støyende, men bør vise en klar topp. Spesielt:
    1. Bestem en fluorescensverdi under hvilken en topp ikke ville være vesentlig forskjellig fra støy (innstilling av en slik terskel i LFASS vil øke hastigheten på analysen ved å ekskludere tomme brønner).
    2. Legg merke til det tidligste tidspunktet når fluorescensfluktuasjoner demper før de stiger (dyr kan slå kraftig i opptil 30 minutter, noe som fører til raskt svingende blå fluorescensavlesninger).
      MERK: Topptilpasningen kan forbedres ved å ekskludere disse tidlige tidspunktene fra kurvetilpasningsvinduet.
    3. Legg merke til tidspunktene mellom hvilke minimale og maksimale fluorescensverdier forventes å falle (se på flere brønner for å identifisere disse områdene) da de vil bli brukt til kurvetilpasning.
    4. Sjekk om amplitudene til fluorescenstoppene varierer betydelig mellom brønnene, normaliser dataene før videre analyse ved å bruke følgende formel:
      Normalisert fluorescensbrønn n (t) = (Fluorescensbrønnn [t] - minimum fluorescensbrønn [Dt]) / (maksimal fluorescensbrønn [Dt] - minimum fluorescensbrønn [Dt])
      der "n" er gjeldende brønnnummer, "t" er tidspunktet, og "Dt" er serien av tidspunkter for analysen.

8. Databehandling i LFASS

MERK: Detaljer er gitt på https://github.com/ABA80/LFASS og i tilleggsmaterialet til referanse30.

  1. Opprett to undermapper i LFASS-mappen, en for dataene som skal analyseres og en for resultater, for eksempel "mine data" og "resultater".
  2. Kopier analysen Excel-datafilen til LFASS-undermappen "mine data" etter datainspeksjon.
  3. Start MATLAB, naviger til LFASS-mappen , skriv og kjør fitfolder i kommandovinduet (Tilleggsfil 3). Følg deretter instruksjonene på skjermen.
  4. Etter å ha skrevet inn "fitfolder", ber systemet om navnet på mappen der Excel-filen ligger, for eksempel "mine data". Skriv inn navnet på datamappen (i dette eksemplet "mine data").
  5. Følg instruksjonene på skjermen, og oppgi de ulike parametrene du har bedt om.
    1. Skriv inn "2" for tidsintervallet mellom påfølgende målinger i gjeldende protokoll (ved å angi dette kan resultatene uttrykkes i minutter i stedet for tidspunktenheter).
      MERK: Tidsintervallet kan endres for å utføre fluorescensmålinger mer eller mindre ofte (for å redusere eller øke tidsoppløsningen) og også avhengig av plateleserfunksjonene (dvs. tidsintervallet må kanskje økes for platelesere som ikke kan utføre raske nok målinger). Sørg for at du alltid matcher det eksperimentelle tidsintervallet med LFASS-rutinen.
    2. Tilordne den øvre toleranseterskelen ved å skrive "0,95" (dette kan endres etter behov for å forbedre passformen) og den nedre toleranseterskelen ved å skrive "0,05" (dette kan endres etter behov for å forbedre passformen) for å begrense sigmoidtilpasningen.
      MERK: Andre tidsparametere er basert på brukermerknader fra datainspeksjonen (trinn 7.2.).
  6. Velg om du vil vise eller ikke monterte og jevne kurver ved å skrive "y" for JA eller "n" for NEI når du blir bedt om det. Hvis du vil inspisere de konvergerende tilpasningene visuelt, velger du førstnevnte.
    MERK: Sistnevnte er nyttig for å visualisere alle utjevnede data, men er vanligvis ikke valgt fordi det genererer for mange popup-grafer. Etter dette vil Matlab utføre LFASS-rutinen, som kan ta 1-10 minutter hvis flere Excel-filer behandles på en gang. Popup-vinduer med kurver vises i henhold til valget i trinn 8.6. Tilleggsfil 4A viser et eksempel på en montert kurve.
  7. Velg om du vil (1) analysere kurver identifisert som støy eller (2) montere dårlig tilpassede kurver med et [y/n]-alternativ. Skriv inn y for å godkjenne og n for å avvise.
    MERK: Det anbefales å godkjenne ombygging, spesielt hvis det er mange dårlig monterte eller umonterte kurver. Dette vil tillate brukeren å gi skreddersydde kurvetilpasningsparametere for hver kurve slik de vises på skjermen og bare be om tidligere og senere grenser for sigmoid-passformen. Det kan forsøkes så mange ganger som nødvendig.
  8. Når dataene er analysert, lukker du Matlab og åpner LFASS-mappen .
  9. Klikk på LFASS-undermappen Mine resultater, da resultatfilene lagres automatisk i Resultater-mappen som .txt.
    MERK: Matlab genererer tre .txt filer: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" og "Refitted.txt". De to førstnevnte lagres som en forholdsregel i tilfelle en datamaskinkrasj eller brukerfeil under ombyggingen. Filen som inneholder den mest nøyaktige komplette analysen er "Refitted.txt".
  10. Åpne filen Refitted.txt med Microsoft Excel og lagre som .xls for videre behandling. Tilleggsfil 4B viser et eksempel på en slik resultatfil.
    MERK: For hver brønn (organisert i rader) er det gitt tre verdier i kolonnene som gir estimater av median dødstid for ormpopulasjonen: "Raw": rapporterer tiden som krysser ved halvmaksimum av den eksperimentelle datatoppen; "Batch-montert": rapporterer tiden for å krysse ved halvmaksimum av batch-montert kurve; "Refitted": rapporterer tiden for å krysse på halvmaksimum av den ombygde kurven.
  11. Lagre filen i .xls format som en kopi på et trygt sted. Hvis du ikke gjør dette, risikerer du at filene blir overskrevet under neste kjøring av LFASS-rutinen.
    MERK: Resultatene kan deretter behandles videre for grafisk eller statistisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFASS-analyser gir robust, høy gjennomstrømning og rask screening av flere testforhold samtidig, for eksempel screening av mange genetiske og mikrobiotaparametere som bidrar til stressmotstand og aldring. Det tar bare 2-3 uker for eksperimentet å skaffe seg et omfattende datasett med flere testforhold. L4 + 36 h voksne villtype ormpopulasjoner ble utsatt for 42 ° C termisk stress og 7% t-BHP-indusert oksidativt stress etter en 36 timers kultur på 48 tarmmikrobielle isolater i 36 timer. Analysen ble utført fire ganger, med hver tilstand replikert fire ganger i hver analyse. På tvers av alle forholdene som ble testet, varierte median dødstid mellom 40-130 min for termisk stressanalyse og mellom 90-240 minutter for t-BHP-indusert oksidativt stressanalyse. Termiske stressanalyser i tidlig voksen alder viser vanligvis mer konsistente resultater og mindre variasjon mellom dager og intradag enn oksidative stressanalyser og er bedre prediktorer for etterfølgende levetid30. Forskjellen i median dødstid for ormer matet på forskjellige mikrobielle dietter eksemplifiserer definitivt hvordan tarmkommensaler påvirker vertsstressmotstanden. Figur 2 viser typiske resultater fra 16 biologiske replikasjoner for Bristol N2 villtype ormer på to tarmmikrobiotaisolater av interesse og standard laboratoriestamme E. coli OP50.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater fra parvise varme-/oksidative stressmotstandsanalyser fra ormer dyrket på to bakterieisolater og en kontrollstamme. (A) Varmestressanalyse. Wild-type ormer ble matet i 36 timer på enten MYb11 (Pseudomonas lurida) eller MYb115 (Pseudomonassp.) bakterieisolat eller OP50 kontrollbakterier. MYb11 førte til signifikant tidligere median dødstidspunkt (p < 0,001). (B) Analyse av oksidativt stress. Wild-type ormer ble matet i 36 timer på enten MYb11 eller MYb115 bakterielle isolater eller OP50 kontrollbakterier. MYb11 førte til signifikant tidligere median dødstidspunkt (p < 0,05). 120-150 ormer ble analysert i fire sett med prøver, og hvert eksperiment ble utført i quadruplicate. Brønner med dårlig kvalitet/dårlig tilpassede data førte til manglende verdier. Boksplottrepresentasjoner angir enkeltbrønnverdier, minimums-, median- og maksimumsverdier. *Indikerer statistisk signifikans ved p < 0,05 og ***p < 0,001, med enveis ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En
Parameter Innstilling Kommentar
Temperatur 25 °C
Fluorescens eksitasjon 365 nm 10 nm båndbredde
Fluorescensutslipp 430 nm 20 nm båndbredde
Antall blink 8 blinker, 1 ms avgjort tid
Vinne 100 til 130 Justeres avhengig av utvalg. Sikt mot 2-5 k leseverdi ved analysestart
Oppholdstid 1 μs
Integrasjon tid 30 μs
Lese tidsintervall Hvert 2. minutt Avhengig av stressalvorlighetsgrad, kan varighet og tidsintervall trenge justering (8 timer er nok ved 7% t-BHP)
Varighet 8-12 timer
Les retning Nedenfra
B
Parameter Innstilling Kommentar
Temperatur 42 °C
Fluorescens eksitasjon 365 nm 10 nm båndbredde
Fluorescensutslipp 430 nm 20 nm båndbredde
Antall blink 8 blinker, 1 ms avgjort tid
Vinne 100 til 130 Justeres avhengig av utvalg. Sikt mot 2-5 k leseverdi ved analysestart
Oppholdstid 1 μs
Integrasjon tid 30 μs
Lese tidsintervall Hvert 2. minutt Avhengig av alvorlighetsgraden kan varighet og tidsintervall måtte justeres (6 timer er nok ved 42 °C)
Varighet 6-12 timer
Les retning Nedenfra

Tabell 1: Innstillinger for oksidativ analyse og varmestressanalyse. Eksempler på innstillinger som brukes til oksidative (A) og varme (B) stressanalyser på fluorescensplateleserne som ble brukt i denne studien.

Tilleggsfil 1: Media-, buffer- og kulturoppskrifter. Sammensetning av ulike medier, buffere og kulturer brukt i denne studien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Rå fluorescensdata fra plateleseren etter å ha blitt eksportert og konvertert til Excel .xls format. (A) Excel-filen viser råfluorescensdataene for en varmesjokkanalyse. Rå fluorescensdata vises med 2 minutters tidsintervall. (B) Kolonnen med "brønnposisjon" på 384-brønnsplaten er uthevet, som kan brukes til å merke ormen og bakteriestammer. (C) Filen er merket med orm og bakteriestammer. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: LFASS-analyse ved bruk av Matlab. (A) Etter å ha åpnet LFASS-mappen i Matlab, dukker det opp et kommandovindu. (B) "fitfolder" skrives inn i kommandovinduet for å starte programmet, og mappens navn med filen som skal analyseres, angis. (C) Når programmet finner dataene Excel-fil for analyse, må brukeren følge instruksjonene på skjermen, og gi de forskjellige parametrene som etterspørres. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Analyserte LFASS-data ved hjelp av Matlab. (A) Et eksempel på en kurve montert gjennom Matlab-analyse, der den svarte linjen indikerer tidspunktet som tilsvarer den tidligere tidsgrensen og den blå linjen den senere tidsgrensen for kurvetilpasningen. Den monterte sigmoidkurven vises i rødt. (B) Resultatfilen generert av Matlab åpnes i .xls format. Verdiene utheves og vises i tallformat. Den andre kolonnen angir tiden da verdien på rådatakurven først overskrider 50 % av maksimumsverdien. Den tredje kolonnen angir tiden da den tilpassede kurvens verdi er lik 50 % av maksimumsverdien, som bestemt under batchtilpasningsanalysen. Den fjerde kolonnen angir tidspunktet da verdien på den monterte kurven tilsvarer 50 % av maksimumsverdien etter batchanalyse og endelig ombygging der det er nødvendig. Den fjerde kolonnen skal dermed gi det mest pålitelige resultatet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Eksempel på eksperimentelle plateoppsett. (A) 96-brønns plateoppsett for testing av 47 forskjellige ormtarmmikrobiota bakterielle isolater på to separate ormstammer, med levende OP50 som brukes som kontroll. Fire eksemplarer av denne platen kreves for hver analyse som kjøres. (B) 384-brønnoppsett for varme- eller oksidative spenningsanalyser, tilsvarende den forrige 96-brønns plateanalysen i (A). Dette oppsettet gjør det mulig å utføre tetraplikater for hver tilstand, med hver ormstamme som har sin egen OP50-kontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans tilbyr mange fordeler for rask screening av flere eksperimentelle parametere samtidig, på grunn av sin lille størrelse, gjennomsiktighet, rask utvikling, kort levetid, billighet og enkel håndtering. Dens betydelig enklere genom, kroppsplan, nervesystem, tarm og mikrobiom, men likevel kompleks og lik nok til mennesker, gjør det til en kraftig preklinisk modell, hvor mekanistisk innsikt kan oppnås under testing for bioaktiv effekt eller toksisitet. Ettersom interessen vokser for å utvikle mikrobielle inngrep for sykdommer 8,9,34,35, er det et attraktivt alternativ å dra nytte av slike prekliniske modeller for raskt å undersøke probiotika, med det stort sett uutnyttede og nesten ubegrensede terapeutiske potensialet til mikrober 34. Protokollen beskrevet her er egnet til å studere virkningen av miljøbakterier på C. elegans helse, men kan lett tilpasses til andre formål.

Allsidighet
De forskjellige "modulene" som danner denne rørledningen kan tilpasses eksperiment- eller laboratoriespesifikke krav. For eksempel kan bakterielle isolater erstattes av bakterielle blandinger, bakterielle mutanter eller RNAi-produserende bakterier, og oppsettet kan brukes til å skjerme for bakterielle gener involvert i vertsmikrobeinteraksjoner, skjerme for vertsgener involvert i stressmotstand, eller studere virkningen av individuelle mikrober som en del av definerte bakterielle samfunn. Denne metoden beskriver screening av flere bakterielle isolater i en enkelt orms genetiske bakgrunn. Analysen er imidlertid skalerbar, og flere verts- og bakteriegenotyper kan studeres samtidig. Dette kan videre kombineres med differensielle medikamentelle behandlinger og / eller diettregimer for å få innsikt i vertsgen-mikrobe-gen-diettinteraksjoner.

Protokollen er ennå ikke forsøkt på andre nematodearter, men den bør også være direkte anvendelig på C. remanei og C. briggsae, og den kan gjelde for L3-stadium parasittiske nematodearter som deler morfologiske, størrelses- og dødsfluorescensegenskaper med C. elegans30. Endelig kan andre stressorer (juglone, paraquat, arsenat, andre temperaturer) brukes i samme rørledning for å gi komplementær eller bekreftende informasjon.

Potensielle utfordringer
Tidsinvesteringen frem til dag 12 for å dyrke ormer og bakterier før analysene er betydelig, men på grunn av gjennomstrømningen av tilnærmingen oppveies den langt av bredden i de innsamlede dataene. Likevel er forsiktighet i planlegging av slike analyser viktig for å unngå å kaste bort tid ved å gjenta forberedelsestrinnene fordi materialene er suboptimale når analysene kan starte. Viktigste tidlige problemer inkluderer prøveforurensning (ormer eller bakterier), dårlig synkroniserte ormpopulasjoner og går tom for materialer (ormpopulasjoner spiser gjennom maten raskere enn forventet og fôrer eller overfører dyr oftere enn planlagt).

Unngå forurensninger
På grunn av protokollens omfang og varighet er et stort potensielt problem forurensning av sopp og bakterier, hvis forekomst sikkert vil forvirre resultatene. Det ideelle oppsettet er dermed et luftkondisjonert og luftfiltrert dedikert laboratorierom uten direkte luftstrøm over eksperimentbenken, ved hjelp av sterile forbruksvarer. Imidlertid er det vanligvis tilstrekkelig å observere regelmessige rengjøringsprosedyrer (dekontaminere benker før og etter arbeid, rengjøre platebokser og bruke sterile forbruksvarer) og arbeide med en flamme i et inneholdt rom (unngå ganger, mellomrom i nærheten av åpne dører og vinduer) for å opprettholde et rent miljø. Hvis milde forurensninger oppstår før eggforberedelse i trinn 2.2.1., vil blekeprosedyren ta seg av dem, og protokollen kan gå som planlagt. Omvendt vil forurensninger som påvirker den voksende ormpopulasjonen før overføring til testbakterieplater bety slutten på dette forsøket, og protokollen må startes på nytt fra trinn 1. Senere forurensninger vil ha en tendens til å påvirke enkeltbakteriestammer eller testforhold. Avhengig av omfanget, kan det være verdt å fortsette eller starte protokollen på nytt.

Synkronisering av ormen
Ettersom motstand mot termiske og oksidative utfordringer endres når ormer utvikler seg og vokser, kan testforhold som fører til forskjellige utviklingsstadier når LFASS-analyser utføres, ikke lett sammenlignes. Det er viktig å gi godt synkroniserte populasjoner for endepunktanalyser. Ettersom analysene utføres på ormer samlet i bulk ved L4- eller L4 + 48-timers stadier, i fravær av en ormsorterer eller annen sorteringsprosedyre for å samle perfekt iscenesatte ormer, må ormpopulasjonene være veldig godt synkronisert ved L1. Det bør sikres at klekkinger holdes av mat lenge nok til at alle levende egg kan klekkes før testkohorten vokser (>15 timer ved 20 °C og >18 timer ved 15 °C). Genotype kan påvirke spredningen i utviklingstiming, som også påvirkes av temperatur. Voksende ormpopulasjoner ved 15 ° C gir bedre kontroll over dette samtidig som det begrenser virkningen av temperaturfølsomme mutasjoner under ormpopulasjonens ekspansjonsfase (spesielt når man arbeider med insulinsignalmutanter). Hovedårsaken til å studere effekten av mikrober fra L4 eller L4 + 48 h er å omgå utviklingseffekten av et annet kosthold og studere virkningen av levende tarmbakterier i stedet for deres innvirkning på kostholdet. Ormer dyrket i et tidligere larvestadium på forskjellige bakterielle isolater eller blandinger vil uunngåelig føre til ujevne utviklingshastigheter og tap av synkronisering.

Konsekvenser av å stole på blå fluorescens
Å kunne fastslå død i LFASS-analyser uten behov for individuell ormsporing eller ekstra reagenser som Sytox green36, men i stedet utnytte et endogent signal i et fluorescensområde som neppe vil overlappe med tradisjonelle ormbiomarkører, er en klar fordel. Det er imidlertid fortsatt viktig å sikre at ormdødsfluorescens kan oppdages konsekvent på tvers av mange testforhold. Selv om analysen ikke er avhengig av fluorescenskvantifisering, men på dens dynamikk, må tilstrekkelig fluorescens fortsatt sendes ut av ormene for å estimere median dødstid (TOD) nøyaktig. Siden analysen ikke tillater oppløsning av enkeltormdød, må de blå fluorescensutbruddene som sendes ut av døende individer, ha tilstrekkelig tidsmessig overlapping for fluorescensakkumulering for å gi ut en enkelt populasjonsfluorescenstopp. Først da kan median TOD utledes nøyaktig. Dette betyr at ormer som ikke er i stand til å produsere tilstrekkelige nivåer av blå fluorescens, ikke kan brukes i denne protokollen, som spesielt inkluderer noen mutanter av kynureninbanen som tdo-2 og kynu-130,31, samt sultne dyr. Derfor er det viktig å sikre at ormer holdes i fylte forhold hele tiden. Dette kan spesielt være et problem når du utfører HT115-drevne RNAi-skjermer, da HT115-plener på NGM-medium supplert med IPTG og antibiotika har en tendens til å være tynnere enn OP50-plener. Overvåking av ormens matforsyning i dagene som fører til analysene er derfor kritisk.

En annen konsekvens av dynamikken i dødsfluorescens er at jo raskere analysen er, desto bedre er følsomheten, da ormer fra samme populasjon vil dø mer synkront og produsere en mer definert populasjonsdødsfluorescenstopp. Jo lengre analysen er, desto større er populasjonsstørrelsen som trengs for å generere gode dødsfluorescenstopper. Mutanter med lavt stoffskifte, som eat-2 og daf-230, vil også gi ut mindre fluorescens og kreve høyere tall per brønn. Mens 10-15 villtype ormer per brønn er tilstrekkelig for en 42 ° C termisk stressanalyse som dreper dem alle innen 4 timer, er det nesten dobbelt så mye som kreves for daf-2 (e1370) ormer i samme analyse, og > 100 villtype ormer kreves for en analyse som vil drepe ormer over en 24-timers periode.

I sammenheng med miljømessige bakterielle isolater kan forskjellig mikrobiell metabolisme også differensielt påvirke kynureninbanen som produserer de blå fluorescerende forbindelsene. Derfor fører noen bakterielle isolater til lavere topp dødsfluorescens, mens andre fører til høyere topper enn OP50. Som et resultat må man sikte på nok ormer per brønn for å imøtekomme alle eventualiteter.

Til slutt er det viktig å optimalisere plateavlesningsparametere riktig. Denne protokollen dekker innstillingen av fluorescenseksitasjons- og utslippsparametere og dybden der avlesninger ideelt sett skal utføres. Med et muligens bredt spekter av dødsfluorescensutbytter over flere forhold i en enkelt analyse, er det viktig å sikre at svake signaler oppdages, men at detektorer aldri blir mettet. Instrumenter med detektorer med høye dynamiske områder vil dermed yte bedre.

Begrensninger av metoden
Metoden beskrevet her er robust og fleksibel og kan enkelt tilpasses ulike forhold. For enkelhets skyld nevnes viktige begrensninger og begrensninger langs protokollen der de spiller inn. Kort sagt, avhengigheten av dødsfluorescens som en endogen markør for død er både en styrke og en begrensning av disse analysene.

Under et begrenset antall spesifikke diettforhold (lav tryptofan dietter eller sult) og i mutante forhold som påvirker tryptofanmetabolismen (dvs. tdo-2, kynu-1, noen daf-2 alleler), kan dødsfluorescensen (DF) være sterkt dempet, i den grad at toppfluorescensen er vanskelig å oppdage og TOD-estimater er mindre pålitelige.

Omvendt kan noen mikrober produsere blå fluorescerende forbindelser hvis eksitasjons- og utslippsspektra overlapper med DF-signaler (dvs. Enterococcus faecalis). Mens deres dynamikk er forskjellig fra DF og ofte kan kobles fra, kan de forvirre analysen.

Deretter er analysene avhengige av kumulasjon av signaler fra døende individuelle ormer, men DF slukkes over tid. Derfor, hvis ormer dør for langt fra hverandre, vil individuelle fluorescenstopper ikke produsere en populasjonstopp, og forhindre måling av en populasjons median TOD. Jo langsommere analysen dreper, desto høyere er ormnummeret som kreves i hver brønn30. Derfor er 10-15 voksne ormer per brønn tilstrekkelig for en varmestressanalyse på 42 °C som dreper halvparten av ormene innen 2 timer, men over 70 ormer per brønn er nødvendig for en bakteriell hurtigdrepende analyse som dreper halvparten av ormene på 12 timer.

Til slutt trenger brukere tilgang til en plateleser for å utføre slike analyser som kan utføre time-lapse fluorescensmålinger ved de nødvendige bølgelengdene. Eksitasjons- og emisjonsbølgelengder kan også variere noe mellom systemer og variere mellom nematodearter, som nevnt30.

Sammenligning og komplementaritet med andre C. elegans-analyser
I løpet av de siste 10-15 årene har mange analyser blitt utviklet for å vurdere C. elegans helse under flere forhold samtidig, ved hjelp av et mangfold av strategier og tilbyr ulike nivåer av datadybde og bredde 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. Flere kraftige analyser er spesielt utviklet for automatisk å overvåke mange ormer samtidig på faste medier over hele levetiden, ved hjelp av kameraarrayer og skannere med multiormsporingsalgoritmer og / eller mikrofabrikkerte individuelle ormarrayer 37,38,39,40,41,43 . I sammenheng med vertsmikrobeinteraksjoner har lignende tilnærminger til protokollen beskrevet ovenfor, men ikke avhengig av DF, også muliggjort genomomfattende RNAi-screening av C. elegans-gener involvert i bakterielle infeksjoner46,47,48. Imidlertid er disse høykapasitetsanalysene avhengige av å håndtere ormer i væske gjennom, noe som ikke er ønskelig når det gjelder flere bakterietyper samtidig på grunn av økt risiko for krysskontaminering og fordi væskekultur påvirker verts- og mikrobielle metabolisme. Derfor, i tradisjonelle infeksjons-, stress-, helse- og levetidsanalyser, opprettholdes og eldes C. elegans på bakterielle plener dyrket på faste medier. Som det også er tilfelle i denne protokollen, kan resultater fra skjermer utført med denne rørledningen lettere relateres til og forutsi utfallet av nedstrøms bekreftende eksperimenter med skjermtreff.

Fordelene med selve LFASS-tilnærmingen er godt dekket i referanse30. Sammenlignet med mer forseggjorte kontinuerlige bildeoppsett som kan brukes til lignende studier, er LFASS billigere (forutsatt at median TOD er den eneste avlesningen som trengs), og dens enkelhet betyr at den ikke krever mye teknisk evne eller spesialisert utstyr. LFASS handler i hovedsak om bredde over dybde. LFASS-data gir ikke annen informasjon enn median dødstidspunkt for en ormpopulasjon og en indirekte avlesning av en kynureninbaneutgang. Omvendt, med lavere, men fortsatt anstendig gjennomstrømning, kan komplekse egenskaper måles fra andre analyser 37,38,39,40,41,43 over hele levetiden til ormer, noe som gjør dem gode nedstrøms tilnærminger for å studere treff fra en LFASS-skjerm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker CGC Minnesota (Madison, USA, NIH - P40 OD010440) for å gi ormstammer og OP50 og Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Tyskland) for å gi alle de miljømessige mikrobielle isolatene som er avbildet her. Dette arbeidet ble finansiert av et UKRI-BBSRC-stipend til AB (BB / S017127/1). JM er finansiert av et Lancaster University FHM PhD-stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm diameter plates (Non-vented) Fisher Scientific 10720052 Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 168381
384-well black, transparent flat bottom plates Corning 3712 or 3762 Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 150288 Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite) Thermo 130188
Agar (<4% ash) Sigma-Aldrich 102218041 Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose Fisher Scientific BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP Beckman coulter
Bleach Honeywell 425044
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5080
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB agar Difco 240110
LB broth Invitrogen 12795084
LoBind tips VWR 732-1488 Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes Eppendorf 22431081
Magnesium sulfate Fisher Scientific M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+ Tecan Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark Tecan
Potassium phosphate monobasic Honeywell P0662
Sodium chloride Sigma-Aldrich S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base Leica MZ6, or M80 Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) Sigma-Aldrich 458139
Transparent adhesive seals Nunc Fisher Scientific 101706871 It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan Sigma-Aldrich 1278-7099
Yeast extract Fisher Scientific BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
  2. Amon, P., Sanderson, I. What is the microbiome. Archives of Disease in Childhood - Education & Practice Edition. 102 (5), 257-260 (2017).
  3. Belkaid, Y., Harrison, O. J. Homeostatic immunity and the microbiota. Immunity. 46 (4), 562-576 (2017).
  4. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  5. Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
  6. Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
  7. Mitsuoka, T. Establishment of intestinal bacteriology. Biosci Microbiota Food Health. 33 (3), 99-116 (2014).
  8. Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
  9. Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
  10. Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
  11. Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
  12. Miller, I. The gut-brain axis: historical reflections. Microbial Ecology in Health and Disease. 29 (1), 1542921 (2018).
  13. Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
  14. Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
  15. Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
  16. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  18. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  19. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  20. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
  21. Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
  22. Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
  23. Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
  24. Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
  25. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  26. Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
  27. Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
  28. Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
  29. Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
  30. Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
  31. Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
  32. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  33. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  34. Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
  35. Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
  36. Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
  37. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  38. Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
  39. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  40. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  41. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  42. Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
  43. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
  44. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  45. Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
  46. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
  47. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
  48. Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).

Tags

Biologi utgave 182
High-Throughput Screening av mikrobielle isolater med innvirkning på <em>Caenorhabditis elegans</em> Helse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, I., Martin, J.,… More

Ali, I., Martin, J., Zárate-Potes, A., Benedetto, A. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (182), e63860, doi:10.3791/63860 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter